Гистология. Метод радиоавтографии. Применение в гистологии
 Скачать 0.66 Mb.
|
 Университет «Синергия» (Московский финансово-промышленный университет «Синергия») Кафедра медико-биологических дисциплин РЕФЕРАТ по Гистологии на тему: «Метод радиоавтографии. Применение в гистологии.»
Москва — 2023 СОДЕРЖАНИЕ Введение………………………………………………...………3 Радиоавтография………………………………………….…….4 Радиоавтография в гистологии…………………………..…….7 Заключение ………………………..…………………………...12 ВВЕДЕНИЕ В настоящее время уровень современных методов исследования невероятно вырос. Они позволяют изучать и ткани как единое целое, и выделять из них отдельные типы клеток, что позволяет изучать их жизненный цикл на протяжении достаточно длительного времени. Благодаря современным методам исследований появилась возможность выделять отдельные органеллы клетки, а также составляющие их макро- и микромолекулы (например, молекулы ДНК) и исследовать их функциональные особенности. Это стало возможно благодаря созданию новых и новаторских приборов и технологий, компьютерных технологий, разного вида микроскопирования, рентгенографического анализа, радиоактивных изотопов, авторадиографии, хромотографии, электрофореза, фракционирования содержимого клеток, культивирования и разделения клеток, гибридизации. При использовании биотехнологических методов – получения гибридов и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и пр. В настоящее время все биологические объекты можно изучать на молекулярном, клеточном, субклеточном и тканевом уровнях. Несмотря на глобальное внедрение в естественные науки биофизических, физических, биохимических и технологических методов, помогающих в решении многих вопросов, объясняющих жизнедеятельность на тканевом и клеточном уровнях, гистология остается морфологической наукой, с присущим только ей набором методов, которые позволяют нам дать характеристику процессам, происходящим в тканях и клетках, показать их структурные особенности. Основными этапами гистологического и цитологического анализа являются: выбор объекта исследования, правильная подготовка препарата для микроскопического изучения, а также качественный и количественный анализ, полученных результатов и анализ изображений гистологических препаратов. Чаще всего объектами исследования в гистологии и цитологии служат как живые, так и специальным образом фиксированные ткани и клетки, а также полученные с использованием электро- и световых микроскопов изображения. В гистологии существует множество методов, позволяющих проводить анализ тканей, клеток и других гистологических препаратов, но в своей работе я бы хотела более подробно остановиться на методе радиоавтографии. РАДИОАВТОГРАФИЯ Радиоавтография — впервые был применен в 1904 году Лондоном и Коптаревым на животных объектах при введении в организм радия, а позже Т. Л. Сиротина в 1971году. Этот метод обязанный своим возникновением началу активного развития ядерной физики, именно она сделала возможным получение и использование радиоактивных изотопов различных элементов. Для радиоавтографии необходимы, в частности, изотопы элементов, используемых клеткой и могут связываться с веществами, используемыми клеткой или тканями, которые можно вводить животным или добавлять к растительным культурам в количествах, которые не будут нарушать нормального клеточного метаболизма. Радиоактивный изотоп (или помеченное им вещество) участвует в биохимических реакциях так же, как его нерадиоактивный аналог, и в то же время способен испускать излучение. Путь изотопов в организме можно проследить с помощью различных методов обнаружения радиоактивности. Радиоавтография является одним из основных методов изучения обменных процессов в клетке, который объединяет принципы морфологического и биохимического анализов. Этот метод позволяет наиболее полно изучить обменные процессы в разных структурах. Суть метода радиоавтографии заключается в том, что входящие в состав клеток химические соединения подвержены постоянному самообновлению. В следствии этого, в основе метода радиоавтографии лежит использование радиоактивных элементов (например, фосфора 32Р, углерода 14С, серы 35S, водорода 3Н) или меченых ими соединений. В гистологических срезах радиоактивные вещества обнаруживают с помощью фотоэмульсии, которую наносят на препарат, а затем проявляют. На участках препарата, где фотоэмульсия соприкасалась с радиоактивным веществом, происходит фотореакция,в результате которой образовались засвеченные участки (треки). Таким способом можно определять, например, скорость включения меченых аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, обмен йода в клетках щитовидной железы и пр. В биологии и медицине метод радиоавтографии в основном применяют для обнаружения даже самых малых количеств радиоактивных изотопов и изучения их распределения в срезах как целых органов или тканей, так и в отдельных клетках. Метод радиоавтографии незаменим, например, в случаях содержания малых количеств радиоактивного элемента, а его интенсивность не поддается измерению счетчиками. Радиоавтография позволяет исследовать распределение радиоактивного элемента в срезах тканей органа, характер выведения этого элемента из организма, а также накопление его в разных системах организма. Для того, чтобы на препаратах, предназначенных для изучения с помощью светового или электронного микроскопов, можно было обнаружить излучение, испускаемое радиоактивными изотопами, в темном помещении препараты покрывают особой фотоэмульсией, после чего оставляют на некоторое время в темноте. Затем препараты проявляют (тоже в темноте) и фиксируют. Определенные участки препарата, содержащие радиоактивные изотопы, воздействуют на лежащую над ними эмульсию, в которой под действием испускаемого излучения возникают темные «зерна». Таким образом, получают радиоавтографы (от греч. радио – лучевидный, аутос – сам и графо – писать). Ядра радиоактивных изотопов крайне нестабильны, а поэтому подвергаются распаду, испуская заряженные частицы -лучи. Экспериментатор в свою очередь регистрирует на фотопленке радиоактивный распад. Радиоавтография до сих пор имеет очень обширную область применения, позволяющую изучить то, где и как в исследуемом организме протекают те или иные биохимические реакции и процессы. Введенные в организм соединения, меченные радиоизотопами, и последующее их исследование методом радиоавтографии позволяет: получить более точные данные о процессах, происходящих в клетках, клеточных структурах и тканях; локализации тех или иных веществ; более точно установить длительность и порядок протекания ряда процессов. Например, при применении радиоактивного фосфора в радиоавтографии давали возможность для обнаружения присутствия активного обмена веществ в растущей кости; применение радиойода и радиоавтографии позволяют закономерности в деятельности щитовидной железы; также, введение меченых соединений — предшественников белка и нуклеиновых кислот, и радиоавтография помогли выяснить роль в обмене этих жизненно важных соединений определённых клеток и клеточных структур. Метод радиоавтографии дает возможность определить не только локализацию радиоизотопа в гистологическом препарате, но и определить его количество, так как число восстановленных зёрен серебра эмульсии прямо пропорционально количеству воздействующих на неё частиц. Количественный анализ макрорадиографов проводят обычными приёмами фотометрии, а микрорадиографов — подсчётом под микроскопом зёрен серебра или следов-треков, возникших в эмульсии под действием ионизующих частиц. Радиоавтографию уже долгое время успешно сочетают с электронной микроскопией. Меченые радиоактивными изотопами химические соединения, которые используются для исследования биологических процессов, называются предшественниками. Предшественники – это вещества, сходные с теми, которые организм получает из пищи. Они служат строительными блоками для построения тканей и включаются в состав сложных компонентов клеток и тканей таким же образом, как в них включаются немеченые строительные блоки. Компонент ткани, в который включается меченый предшественник и который испускает излучение, называется продуктом.  Для контрастной радиоавтографии применяются оптические и ядерные фотоэмульсии, а для следовой радиоавтографии — ядерные фотопластинки типа MP, для гисторадиоавтографии α-излучающих материалов — ядерные фотопластинки типа А-2 или MP, эмульсию А, Р. При исследовании β-излучающих материалов используют фотопластинки типа MP или МК, эмульсию Р. Эти же эмульсии применяются для микробиологических и других исследований. Полученное фотографическое изображение распределения радиоактивных веществ в исследуемом объекте, полученное методом радиоавтографии, называется авторадиограммой или радиоавтографом. РАДИОАВТОГРАФИЯ В ГИСТОЛОГИИ Исходя из возможностей метода радиоавтографии, свое самое широкое применение он получил в гистологии, поскольку представляет собой исследование биологических явлений на срезах тканей с использованием радиоактивности и позволяет обнаружить радиоактивные вещества в тканях благодаря воздействию радиоактивного излучения на фотоэмульсию. Возможность обнаружения радиоактивных соединений в клеточных структурах, а также тканевых компонентах позволяет получить обширную информацию. При использовании в данном методе радиоактивных аминокислот можно установить, какие клетки данной ткани вырабатывают больше белка, а какие — меньше, поскольку количество зерен серебра, образовавшихся над клетками, пропорционально интенсивности синтеза белка.  Рис.1. Радиоавтографы поднижнечелюстной железы мыши после введения 3 I-фукозы за 8 ч до получения материала. А — при использовании светового микроскопа можно видеть черные зерна серебра, указывающие участки клетки, содержащие радиоактивные вещества. Большая часть радиоактивного материала находится в гранулах клеток гранулярных протоков железы. Большое увеличение.  Рис.2. Радиоавтографы поднижнечелюстной железы мыши после введения 3 I-фукозы за 8 ч до получения материала. Б — та же ткань, подготовленная методом электронно-микроскопической авторадиографии. Зерна серебра при этом увеличении выглядят как извитые структуры, расположенные главным образом над гранулами (Г) и в просвете железы (П). Большое увеличение. Содержащие радиоактивные молекулы структуры покрыты такими зернами. Данный метод можно использовать как для световой, так и для электронной микроскопии. При помощи радиоактивного предшественника ДНК (такого, как радиоактивный тимидин) можно определить, какие клетки в данной ткани (и в каком количестве) готовятся к делению. Также можно проанализировать и динамические процессы. Для того, например, чтобы выяснить, где в клетке вырабатывается белок, который далее секретируется, а также понять по какому пути белок перемещается внутри клетки, до выделения из нее, нескольким животным вводят радиоактивную аминокислоту и получают от них материал и анализируют результаты спустя разные промежутки времени после введения. Радиоавтографы срезов материала, полученного в разные сроки эксперимента, покажут перемещение радиоактивных белков. Для того чтобы установить, где в органе образуются новые клетки и куда они мигрируют, нескольким животным вводят радиоактивный тимидин и получают материал спустя различное время после инъекции. Радиоавтографы срезов покажут, где клетки делятся и куда (если это происходит) они мигрируют.  Рис. 3. Радиоавтографы срезов ткани мыши, которой за 1 ч до получения органов ввели 3Н-тимидин. Так как авторадиографы экспонировали в течение очень продолжительного времени, радиоактивные ядра содержат большое количество метки и покрыты «облаками» темных зерен. А — в основании кишечных желез (треугольники) многие клетки делятся, но вдоль ворсинок (стрелка) делящиеся клетки отсутствуют. Малое увеличение. Б — на срезе лимфатического узла видно, что деление клеток происходит преимущественно в его герминативных центрах (стрелка). Малое увеличение. На рис. 4 и 5 приведены примеры авторадиограмм. Методом радиоавтографии можно обнаруживать распределение природных радиоактивных элементов в канях растительных и животных организмов и т. д. Рис. 4. Авторадиограмма (отпечаток), показывающая распределение фосфора (32Р) в листьях помидора. Растение помещалось предварительно в раствор, содержащий радиоактивный фосфор. Светлые участки соответствуют повышенным концентрациям радиоактивного изотопа; можно видеть, что фосфор сконцентрировался у стебля и в сосудистых частях листьев.  Рис. 5. Включение в ядра соединительнотканых клеток меченного тритием тимидина, идущего на построение нуклеиновых кислот. Увеличено в 600 раз.  Введение в организм соединений, меченных радиоизотопами, и дальнейшее исследование тканей и клеток данным методом позволяет получить точные данные о том, какие процессы проходят в тех или иных клетках или клеточных структурах, как локализуются те или иные вещества,а также установить временные параметры протекания ряда процессов. Так, например, применение радиоактивного фосфора дало возможность выявить присутствие интенсивного обмена веществ в растущей кости; применение радиоиода позволили уточнить закономерности деятельности щитовидной железы; введение меченых соединений — предшественников белка и нуклеиновых кислот помогли объяснить роль в обмене этих жизненно важных соединений определённых клеточных структур. Метод радиоавтографии позволил определить не только локализацию радиоизотопа в биологическом объекте, но и его количество, поскольку число восстановленных зёрен серебра эмульсии пропорционально количеству воздействующих на неё частиц. Количественный анализ макроавтографов проводят обычными приёмами фотометрии, а микроавтографов — подсчётом под микроскопом зёрен серебра или следов-треков, возникших в эмульсии под действием ионизующих частиц. Радиоавтографию начинают успешно сочетать с электронной микроскопией.  Рис. 6. Радиоавтография с введением 3Н-тимидина (кожа спины крысы)  ЗАКЛЮЧЕНИЕ Именно методом авторадиографии в свое время было показано, что ДНК всегда находится в ядре и никуда оттуда не выходит. РНК, напротив, синтезируется в ядре, а затем выходит в цитоплазму. Белок никогда не синтезируется в ядре. Место синтеза белка – рибосомы цитоплазмы. Отсюда белок может перемещаться и в ядро, и внутрь органелл цитоплазмы. В заключение следует отметить, что каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Исследователь должен использовать несколько взаимодополняющих методов, чтобы сделать окончательный вывод. Наука не стоит на месте и постоянно идут исследования и разработки новых методов изучения и анализа, а применение новых методов исследований в гистологии, цитологии и эмбриологии позволяет выяснить общие закономерности организации тканей и клеток, структурные основы биохимических процессов, определяющих функцию конкретных структурных компонентов клетки. В заключение следует отметить, что каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Исследователь должен использовать несколько взаимодополняющих методов, чтобы сделать окончательный вывод. Список дополнительной литературы: Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А., Котовский Е.Ф. Гистология. Эмбриология. Цитология.: учебник, под ред. Афанасьева Ю.И. и Юриной Н.А .- 6-ое изд. доп. и перераб. – М. ГЭОТАР-Медия 2013 г. С. 37-50. Жинкин Л. Н., Применение радиоактивных изотопов в гистологии, в кн.: Радиоактивные индикаторы в гистологии, Л., 1959, с. 5—33; Бойд Д. А. Авторадиография в биологии и медицине, пер. с англ., М., 1989; Данилов Р.К. Гистология. Эмбриология. Цитология. Учебник для студентов медицинских ВУЗов.- М: ООО «Медицинское информационное агенство.»-2006 г.. с. 12-14, 22-27; Махинько В.И. Физическая и коллоидная химия. Иллюстрационный материал: Рис. 1, 2, 3 «Medical Planet» https://medicalplanet.su/gistologia/avtoradiografia_srezov_tkanei.html Рис. 4, 5 Большая Советская энциклопедия ( интернет версия) https://info.wikireading.ru/h0qkHIsYuT Рис. 6 Цитология. Учение о стволовых клетках ( Модуль 1) https://en.ppt-online.org/153905 |