Методическое пособие введение
 Скачать 189.21 Kb.
|
|
3. УЧАСТИЕ НЕКОДИРУЮЩИХ РНК В ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ Некодирующие РНК (нкРНК, non-coding RNAs - ncRNAs) наряду с метилированием ДНК и ковалентной модификацией гистонов являются одним из ключевых факторов формирования эпигенетического кода. Некодирующие РНК представляют собой группу молекул РНК, которые, в отличие от матричной РНК, не несут информацию о первичной структуре белка. К группе нкРНК можно отнести рибосомную и транспортную РНК. Однако, в современной литературе термином нкРНК принято обозначать группу РНК, выполняющих функцию эпигенетических регуляторов, которые активно участвуют во многих физиологических и патологических процессах. В настоящее время хорошо изучены несколько групп регуляторных нкРНК, обладающих способностью контролировать экспрессию генов на этапе транскрипции и посттранскрипционном уровне. К нкРНК относят микроРНК (miRNA), длинную нкРНК (lncRNA), малую интерферирующую РНК (siRNA), piwi-взаимодействующую РНК (piRNA) и и т.д. При этом, miRNA, siRNA и piRNA получили название малые нкРНК, поскольку длина даннын РНК обычно менее 200 нуклеотидов, тогда как длина lncRNA превышает 200 нуклеотидов. Согласно современным данным литературы (Li Y., 2021). Роль нкРНК в эпигенетической системе контроля экспрессии генов лучше всего понятна для микроРНК. Данная группа нкРНК представлена нуклеотидными цепочками длиной около 20 нуклеотидов. Известно, что микроРНК, являясь одной из наиболее важных нкРНК, реализуют свои эффекты, регулируя посттранскрипционную экспрессию генов в широком диапазоне нормальных физиологических процессов, таких как развитие и дифференцировка организма. Примечательно, что было обнаружено, что микроРНК играют ключевую роль в патогенезе целого ряда опаснейших заболеваний, таких как рак. Нарушение регуляции профилей экспрессии микроРНК сильно коррелирует с инициацией и развитием рака у человека, где эти аберрантные транскрипты обычно сопровождаются эпигенетическими нарушениями. Малая интерферирующая РНК (siRNA) представляют собой класс двухцепочечных молекул РНК. Подобно микроРНК, siRNA опосредуют посттранскрипционное подавление посредством процессов РНК-интерференции (RNAi), связываясь с мРНК. В свою очередь, piRNA представляют собой группу небольших нкРНК длиной примерно 21-35 нуклеотидов. Известно, что piRNA связывается с белками PIWI, приводя к подавлению транскрипции генов посредством деградации матричной РНК. Рассмотрим роль некодирующих РНК в эпигенетических механизмах на примере наиболее хорошо изученных представителях некодирующих РНК - микроРНК и длинных некодирующих РНК. 3.1 МикоРНК Согласно классическим представлениям ген miRNA сначала транскрибируется РНК-полимеразой II или РНК-полимеразой III в первичный транскрипт miRNA (pri-miRNA). Затем при-микроРНК расщепляется на микроРНК-предшественницу (пре-микроРНК; 60-80 нуклеотидов) ядерным микропроцессорным комплексом, образованным Drosha и DGCR8. Пре-микроРНК транспортируется из ядра специфическим ядерным транспортным рецептором Экспортин-5 в цитоплазму, где она далее расщепляется на двухцепочечную микроРНК/микроРНК дуплекс с помощью Dicer, рибонуклеазы из семейства РНКазы III (RNase III), разрезает двуцепочечные молекулы РНК и пре-микроРНК (pre-miRNA) с получением коротких двуцепочечных РНК-фрагментов. Дуплекс микроРНК связывается с белками Argonaute с помощью РНК-индуцирующего комплекса сайленсинга (RISC), включающего Dicer, РНК-связывающий белок ответа на трансактивацию (TRBP) и Argonaute. В результате одна из нитей дуплекса (зрелая микроРНК) при участии белков семейства Argonaute включается в механизмы подавления трансляции. Согласно классическим представлениям микроРНК выполняют свою роль только в цитоплазме, где они распознают свои целевые белок-кодирующие мРНК и приводят к подавлению трансляции и деградации целевой мРНК. При этом, основной регуляторный эффект микроРНК обусловлен их способностью связываяться с мРНК-мишенями в 3'-нетранслируемой области (3' UTR). Однако элементы, реагирующие на микроРНК, также располагаются и в кодирующих областях мРНК-мишени. МикроРНК реализуют свои эффект в комплексе с белками семейства Argonaute, поскольку данные белки являются эффективной платформй, на которой микроРНК могут связываться с мРНК-мишенями. Кроме того, если соединение оснований miRNA-mRNA произойдет корректно представитель семейства Argonaute, белок AGO2 может проявлять эндонуклеазную активность, расщепляя мРНК-мишень. Таким образом микроРНК подавляют экспрессию генов, точнее служат посттранскрипционными регуляторами генов. По мнению ряда авторов именно этот классический путь регуляции позволяет микроРНК принимать участие в важнейших процессах жизнедеятельности клеток, таких как дифференцировка клеток, апоптоз, пролиферация клеток и органогенез (Wang S. et al., 2021). В тоже время, нарушение экспрессии микроРНК может быть причиной многих опасных заболеваний человека. Также подчеркивается, что остаются мало изученными механизмы экспрессии генов микроРНК и инициация транскрипции микроРНК в различных типах клеток и тканей в норме и при патологии. Однако, дальнейшие исследования показали, что зрелые микроРНК могут транспортироваться из цитоплазмы в ядро, где микроРНК могут функционировать в качестве регуляторов генов в ядре посредством механизма, отличного от классической посттранскрипционной репрессии включаясь в системы регуляции биогенеза и функционирования некодирующих РНК (включая микроРНК и длинные нкРНК), добавляя новый уровень сложности к нашему пониманию регуляции генов (Liang H. et al., 2013). При этом, некоторые зрелые микроРНК могут повторно проникать в ядро, а в некоторых случаях их даже больше в ядре, чем в цитоплазме. Установлено, что присутствие зрелых микроРНК в ядре - общее явление в клетках млекопитающих. Результаты исследований показали, что зрелые микроРНК первоначально накапливаются в цитоплазме, а в дальнейшем происходит транспорт цитоплазматической микроРНК в ядро клетки (Foldes-Papp Z. et al., 2009). Показано, что представители одного и того же семейства микроРНК могут по-разному распределяться в цитоплазме или ядре (Hwang H.W. et al., 2007). Авторами обнаружено, что транспортировке в ядро способствует присутствие в молекуле микроРНК специфический гексануклеотидный 3’-концевой мотив (AGUGUU) определяющий ее импорт в ядро. Результаты дальнейших исследования показали, что около 75% микроРНК присутствуют как в ядре, так и в цитоплазме (Gagnon K.T. et al., 2014). Наряду с этим было подтверждено, что в ядрах клеток человека присутствуют специфические белки семейства Argonaute (Ago2), наличие которых критически важно для поддержания стабильности, в том числе, и микроРНК (Hansen T.B. et al., 2011; Zisoulis D.G. et al., 2012). Выявлено присутствие в ядрах клеток рибонуклеазы Dicer (Catalanotto C. et al., 2016). Предполагается, что транспортный белок ядерной мембраны Экспортин-1 может обеспечивать транслокацию, как микроРНК, так и белков Argonaute из цитоплазмы в ядро (Zisoulis D.G. et al., 2012). Сообщается, что комплекс AGO-микроРНК может импортироваться в при участии транспортного белка импортин-8 (IPO8), поскольку подавление синтеза IPO8 резко снижает содержание AGO2 в ядре (Catalanotto C. et al., 2016). Тем не менее, состав РНК-индуцирующего рибонуклеопротеинового комплекса сайленсинга (RISC) в ядре и цитоплазме отличается. Таким образом, присутствие в ядре микроРНК и белков семейства Argonaute (в частности, белка Ago2, обладающего нуклеазной активностью) может свидетельствовать о том, что микроРНК функционируют, как регуляторы генов в ядре посредством механизма, отличного от классической посттранскрипционной репрессии. Экспериментально данный тезис был подтвержден анализом процессов связывания некоторых микроРНК с первичным транскриптом (pri-miR) и блокировки процессинга pri-miR в предшественник пре-miR с последующим подавлением созревания микроРНК (Tang R. et al., 2012; Catalanotto C. et al., 2016). По мнению авторов, приведенный факт допускает возможность того, что, во-первых, одна молекула микроРНК способна непосредственно в ядре воздействовать на первичные транскрипты других микроРНК и контролировать их синтез. Во-вторых, можно предположить наличие сложной иерархической структуры в ряду микроРНК, в которой определенные микроРНК могут иметь приоритет над другими микроРНК. Помимо этого, в литературе представлены сведения о том, что комплексы AGO-miRNA могут воздействовать по принципу комплементарности на специфические последовательности последовательности в длинных некодирующих РНК, влияя на их стабильность и функцию (Chiyomaru T. et al., 2014). Наряду с этим, была показана возможность микроРНК регулировать экспрессию генов длинных некодирующих РНК через управление активностью фермента ДНК-метилтрансферазы (DNMT) (Braconi C. et al., 2011). Привлекает внимание тот факт, что в области ядрышка наблюдается высокое содержание микроРНК. Возможно, тесная связь микроРНК с ядрышками может указывать на то, что такая локализация микроРНК необходима для посттранскрипционного контроля мРНК в цитоплазме. Таким образом, динамическое перемещение микроРНК в ядрышко и из него является частью программы регуляции мРНК (Politz J.C. et al., 2009; Catalanotto C. et al., 2016). В частности, совместная локализация некоторых микроРНК и рибосомной РНК (рРНК), как в ядрышке, так и в цитоплазме в клетках млекопитающих, дает основание предполагать, что микроРНК может ассоциироваться с субъединицами рибосом на ранней стадии биогенеза рибосом (Politz J.C. et al., 2006). Также в литературе обсуждается возможное участие комплекса микроРНК-Ago2 в системе регуляции сплайсинга и альтернативного сплайсинга первичного транскрипта мРНК, благодаря которому микроРНК изменяют доступность сплайсосом к сайтам сплайсинга, не влияя на уровни и стабильность транскрипции про-мРНК (Ameyar-Zazoua M. et al., 2012; Liu J. et al., 2012; Alló M. et al., 2014). Однако, механизмы регуляции экспрессии генов молекулами микроРНК не ограничиваются перечисленными выше примерами. Имеются экспериментальные доказательства комплементарного взаимодействия некоторых микроРНК с промоторами структурных генов, что в свою очередь, подтверждает прямое участие микроРНК в регуляции транскрипции ряда белков (Place R.F. et al., 2008). Последующие исследования подтвердили существование нового и широко распространенного механизма регуляции экспрессии генов, управляемой микроРНК через комплементарное взаимодействие с промоторами структурных генов, а также выявили актуальность данного механизма в изучении патогенеза смертельно опасных заболеваний человека (Majid S. et al., 2010; Huang V. et al., 2012; Zhang Y. et al., 2014). Еще одним важным современным направлением исследований микроРНК является анализ механизмов их транскрипции. В связи с этим высказывается мнение о необходимости создания базы данных, содержащей информацию о механизмах регуляции транскрипции микроРНК человека (TRmir). Предполагается, что эта база данных должна быть ориентирована на предоставление множества доступных ресурсов, касающихся транскрипционных регуляторных областей микроРНК и аннотирования их потенциальных ролей в регуляции микроРНК (Gao Y. et al., 2022). Необходимость в создании такой базы данных обусловлена не только широким доступом к сведениям о регуляторных областях транскрипции микроРНК, но также получением информации о связанных с микроРНК однонуклеотидных полиморфизмах (SNP) и факторах транскрипции (TFs), способных оказывают существенное влияние на биологические процессы человека в норме и при патологии. 3.2 Длинные некодирующие РНК Данная группа нкРНК (lncRNA) представлена нуклеотидными цепочками длиной свыше 200 нуклеотидов. В зависимости от их положения относительно кодирующих генов lncRNA можно разделить на две основные группы: межгенные lncRNA и внутригенные lncRNA. Межгенные, локализованные по определению в неаннотированных областях генома, обычно называют lincRNA. Источником образования внутригенных lncRNA, как правило могут являться интроны структурных генов (Rinn J.L., Chang H.Y., 2012). Установлено, что lncRNA транскрибируются РНК-полимеразой II, демонстрируют специфическую для типа клеток экспрессию и реагируют на различные стимулы (Wang K.C., Chang H.Y., 2011). По данным литературы, основной функцией lncRNA является регуляция экспрессии структурных генов, которая может осуществляться cis- и trans-эффектами (Kopp F., Mendell J.T., 2018). Под cis-эффектами lncRNA следует понимать влияние на экспрессию близлежащих генов, во-первых, за счет регуляторного влияния транскрипта lncRNA на экспрессию соседних генов. В-вторых, когда сами процессы транскрипции или сплайсинга lncRNA могут инициировать экспрессию соседних генов. В-третьих, экспрессия сопредельных генов зависит исключительно от элементов ДНК в промоторе локуса lncRNA и полностью независима от кодируемой РНК или ее продукции. В то время, как транс-регуляция молекулами lncRNA может осуществляться: lncRNA, контролирующими состояние хроматина и экспрессию генов в областях, удаленных от их сайта транскрипции; lncRNA, которые взаимодействуют и регулируют эффекты белков или других молекул РНК. Обсуждая пути реализации эффектов lncRNA на процессы транскрипции, необходимо отметить, что lncRNA обладает способностью связывать факторы транскрипции и индуцировать ковалентную модификацию гистонов, подавляя экспрессию генов (Wilusz J.E. et al., 2009). Сообщается, что lncRNA могут модулировать активность или количества белков или РНК, с которыми они непосредственно связываются, как в ядре, так и в цитоплазме (Kopp F., Mendell J.T., 2018). Некоторые lncRNA связаны с образованием гетерохроматина, ярким примером данного механизма есть инактивация второй Х-хромосомы в соматических клетках женщин и некоторые другие примеры аллельного исключения. Некоторые lncRNA, взаимодействуя непосредственно с ДНК или со специфическими белками, способными модифицировать хроматин, могу оказывать влияние на структуру хроматина, подавляя экспрессию множества генов (Wang K.C., Chang H.Y., 2011; Kopp F., Mendell J.T., 2018). Было установлено, что lncRNA влияют на экспрессию сопредельных генов, взаимодействуя с их энхансорами и для активации энхансера гена важен не акт транскрипции, а сама lncRNA (Rinn J.L., Chang H.Y., 2012). Следует, однако отметить, что многие авторы из общего семейства lncRNA выделяют в самостоятельную группу межгенные длинные некодирующие РНК- lincRNA. Межгенные lincRNA наиболее хорошо изучены, при этом многие lincRNA имеют сайт инициации транскрипции, подобно структурному гену, причем транскрипция находится на противоположной цепи (дивергентная транскрипция) (Бейлерли О.А., Гареев И.Ф., 2020). Гены длинной межгенной некодирующей РНК (lincRNA) обладают разнообразными особенностями, которые отличают их от генов, кодирующих мРНК, и выполняют такие функции, как ремоделирование хроматина и архитектуры генома, стабилизация РНК и регуляция транскрипции (Ransohoff J.D. et al., 2018). Некоторые гены, которые в настоящее время аннотируются как кодирующие lincRNAs, включают небольшие открытые рамки считывания (smORFs) и кодируют функциональные пептиды и, таким образом, могут быть более правильно классифицированы как кодирующие РНК. В целом, lincRNAs могут служить для точной настройки экспрессии соседних генов с выраженной тканевой специфичностью экспрессии. Следует подчеркнуть, что для lincRNA, в сравнении с мРНК, наблюдается более выраженная тканевая специфичность экспрессии, что позволяет им эффективно контролировать экспрессию генов-мишеней тканеспецифичным образом (Cabili M.N. et al., 2011). Тканевая специфичность экспрессии lincRNA может способствовать процессам гистогенеза и что функции lincRNA могут быть тесно связаны с функциями мРНК или других некодирующих РНК, экспрессируемых в той же ткани (Ransohoff J.D. et al., 2018). В настоящее время аннотировано 13 255 транскриптов lincRNA, кодируемых 8598 генами. lincRNA отличаются от мРНК по их обилию, геномной локализации и субклеточной локализации, эпигенетической регуляцией и тканевой специфичности экспрессии. По сравнению с мРНК транскрипты lincRNA имеют меньше экзонов, линейные размеры lincRNA существенно меньше, а также значительно ниже интенсивность их экспрессии (Melé M. et al., 2017). Кроме того экспрессия lincRNA характеризуется резко выраженной тканеспецифичностью, что согласуется с тем, что lincRNA играют тканеопределяющую роль. Если мРНК в основном транспортируются в цитоплазму для участия в трансляции, то lincRNA чаще обнаруживаются в ядре, чем в цитоплазме, что продемонстрировано. Установлено, что концентрационные индексы уровней содержания lncRNA в ядрах и в цитоплазме различных типов клеток, в целом имеют сходные соотношения (Derrien T. et al., 2012). Экспрессия генов, кодирующих lincRNA, как и генов, кодирующих белок могут регулировать эпигенетическими механизмами. В частности, метки гистонов H3K4me3 смежны участкам начала транскрипции активно экспрессируемых генов lincRNA, тогда как метки H3K36me3 располагаются вдоль тела гена (Derrien T. et al., 2012). В ряде обзорных публикаций (Spitale R.C. et al., 2011; Popadin K. et al., 2013; Ransohoff J.D. et al., 2018) выделены основные эффекты lincRNA, обуславливающие реализацию их функций: - ремоделирование состояния хроматина, направленное на активацию или подавление транскрипции; -специфическое взаимодействие с нуклеиновыми кислотами, а также с белками, участвуя в сборке белковых комплексов. В частности, в цитоплазме lincRNА могут оказывать влияние на мРНК-мишени, изменяя их стабильность, регулируя деградацию и состояние трансляции; -роль фактора, ограничивающего взаимодействие белков и нуклеиновых кислот. Например, изолируют микроРНК от взамидействия с их мРНК-мишенями, изолируют микроРНК от связывания с белками в функционально активный комплекс RISС, ограничивают взаимодействие факторов транскрипции с промоторами генов.; -преобладание цис-эффектов в локальной регуляции транскрипции в сопредельных структурных генах. Однако, из данного правила имеются исключения. Например, lincRNA HOTAIR. Ген данной lincRNA расположенный между HOXC11 и HOXC12 на хромосоме 12 и влияет на транскрипцию генов заднего кластера HOXD, расположенных на хромосоме 2. Это был первый пример lincRNA, которая осуществляет транс-регуляцию генов на расстоянии; -приводятся данные о том, что lincRNА могут действовать как прямые регуляторы ферментативной активности, связываясь с ферментом, чтобы либо активировать, либо подавлять его активность; - установлено, что локусы lincRNA расположены ближе к сайтам запуска транскрипции (TSS) структурных генов; -кодирование функционально активных олигопептидов. Как уже отмечалось, многие lincRNА могут кодировать небольшие молекулы пептидов, обладающих физиологической функцией в клетке. В частности у млекопитающих данная группа пептидов могут участвовать в регуляции мышечного сокращения и регенерации мышечной ткани. |