Методическое пособие введение
 Скачать 189.21 Kb.
|
|
1.3 Фосфорилирование гистонов. Фосфорилирование гистонов также характеризуется высокой степенью пластичности. Процесс ковалентной модификации в данном случае контролируются киназами и фосфатазами, которые соответственно присоединяют и удаляют фосфатные группы. Фосфорилированию подвергаются остатки аминокислот серина, треонина и тирозина, преимущественно, в области N-концевых хвостов гистонов. Все идентифицированные гистоновые киназы переносят фосфатную группу из АТФ в гидроксильную группу боковой цепи целевой аминокислоты. При этом модификация добавляет значительный отрицательный заряд гистону, что, в свою очередь, ослабляет силу электростатического взаимодействия между ДНК и гистонами. Большинство сайтов фосфорилирования гистонов находятся в пределах N-концевых хвостов. Однако участки в пределах коровых участков гистонов действительно существуют. Одним из таких примеров является фосфорилирование H3Y41 (тирозин в 41 положении), который регулируется тирозинкиназой JAK2. Учитывая чрезвычайно высокую пластичность специфического фосфорилирования гистонов, в ядре клетки должна быть высокая активность фосфатаз. Мы знаем, например, что фосфатаза PP1 работает антагонистически по отношению к Aurora B-киназе, которая формирует метки H3S10ph и H3S28ph в процессе регуляции митотического цикла клетки. 1.4Другие пути ковалентной модификации гистонов нуклеосомы Убиквитинирование. Это посттрансляционное присоединение ферментами убиквитинлигазами одного или нескольких мономеров убиквитина с помощью ковалентной связи к боковым аминогруппам белка-мишени. β-N-ацетилглюкозаминирование Многие белки регулируются посредством модификации их сериновых и треониновых боковых цепей одиночными остатками сахара β-N-ацетилглюкозамина (O-GlcNAc). Недавно гистоны были добавлены к длинному списку белков, модифицированных O-GlcNAc. Дезаминирование Эта реакция включает превращение аргинина в цитруллин. В клетках млекопитающих эта реакция на гистонах катализируется пептидилдеиминазой PADI4, которая превращает аргинин в цитруллин. Удаление «хвостового» конца гистонов Возможно, наиболее радикальным способом ковалентной модификаций гистонов является удаление N-концевого хвоста гистонов – процесс «отсечения» хвоста. В настоящее время известно, что этот тип модификации существует у дрожжей и млекопитающих (мыши), где удаляются первые 21 аминокислота H3-гистона. В клетках мыши фермент, выполняющий эту функцию, был идентифицирован, как Катепсин L, который расщепляет N-конец H3-гистона в процессе дифференцировки клеток. Также установлено, что процесс «отсечения» хвостовых фрагментов гистонов принимает участие в регуляции транскрипции (Santos-Rosa H. et al., 2009). 1.5 Роль ковалентной модификации гистонов в регуляции экспрессии генов. В целом, локализация и интенсивность ацетилированных и метилированных сайтов гистонов играет важнейшую роль в регуляции экспрессии генов. Сообщается, что пермиссивные области (доступные для транскрипции) демонстрируют открытую структуру хроматина, отмеченную гиперацетилированием гистонов H3 и H4 и ди- и триметилирование гистона H3 по лизину 4 (H3K4me2/3). Напротив, репрессированные области (в которых транскрипция подавлена) демонстрируют компактную структуру хроматина, в которой отсутствует ацетилирование H3/H4 и метилирование H3K4, и вместо этого обогащены “репрессивными” модификациями, ди- и триметилированием H3K9 (H3K9me2/3), триметилированием H3K27 (H3K27me3) и триметилирование H4K20 (H4K20me3) (McCabe M.T. et al., 2009). Например, установлено, что у эукариот триметилирование гистона H3 остатков Лизина в 9 положении (H3-K9) активирует белок HP1, связывающий хроматин, который является маркером конденсации в гетерохроматин с последующей репрессией генов (Lehnertz B. et al., 2003). Действительно, в то время как метилирование в H3K9 позволяет связывать белок гетерохроматина 1 (HP1), подавляющий транскрипцию, метилирование в H3K4, напротив, способствует стимуляции транскрипции через блокирование связывания репрессора транскрипции, ремоделирование нуклеосом и угнетение деацетилаз. Кроме расположения метильной группы, имеет значение интенсивность метилирования остатков лизина. Показано, что триметилированный остаток лизина H4-K20 связан с транскрипционно неактивным гетерохроматином, тогда как монометилированный и диметилированный H4-K20 связаны с эухроматическими областями (Xiao B. et al., 2005). Также высказывается мнение о том, что распределение метилированных меток гистонов могут отличаться по своему положению в нуклеосоме относительно различных функциональных участков ДНК и таким образом оказывать влияние на экспрессию генов. Например, одним из основных признаков промотора (сайта начала транскрипции - TSS) является присутствие H3K4me3. Область промотра обогащена метками H3K4me3. Метки H3K4me3 могут быть обнаружены, как в неактивных, так и в активных промоторах; таким образом, он маркирует не только транскрибируемый/активный ген, но и гены, которые могут стать активными. Например, указанная закономерность относится к генам, которые угнетены в G0 фазу митотического цикла, но активны в пресинтетический период (Black J.C. et al., 2012). В тоже время, расположение метки H3K27me3 в области транскрибируемого участка гена, в отличие от H3K36me3, коррелирует с репрессией транскрипции. Это ингибирование может быть устранено путем деметилирования. В целом, данные результаты позволяют предположить, что антагонизм между H3K27me3 и H3K36me3 может быть важным регулятором транскрипции. Расположение ацетилированных и метилированных меток гистонов при онкологических заболеваниях может претерпевать, как геноспецифические, так и широко распространенные изменения. Раковые клетки демонстрируют глобальное снижение уровней H4K20me2/3, H3K9me2 и ацетилирования H4, особенно в H4K16. Деацетилирование сайта H4K16Ac и и деметилирования лизина в положениях H4K20me2/3 происходит при предраковых поражениях и нарастает во время прогрессирования опухоли. Деметилирование сайтов H3K9me2 и H4K20me3 может свидетельствовать о глобальном нарушении регуляции транскрипционной репрессии в раковых клетках. У млекопитающих важным фактором контроля баланса процессов ацетилирования и деацетилирования гистонов является рацион питания. Например, ограничение калорийности пищи или диета с высоким содержанием жиров могут влиять на ацетилирование гистонов через уровни образования NAD+. При этом ограничение калорий способствует повышению уровня NAD+/NADH, усиливая процессы деацетилирования. Диета с высоким содержанием жиров, напротив, снижая активность NAD+ приводит к подавлению активности деацетилазы сиртуина (Su X. et al., 2016). Авторы цитируемого обзора высказывают мнение о том, что показатель соотношения в тканях NAD+/NADH может оказывать прямое влияние на активность деацетилаз sirtuin. В частности, у мышей с сахарным диабетом, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, активность никотинамид-фосфорибозилтрансферазы (NAMPT), ключевого фермента в синтезе NAD+ у млекопитающих, сильно снижается. Тогда, как введение никотинамид-мононуклеотида или рибозида восстанавливает NAD+, активирует деацетилазы SirT1 и SirT3 и повышает чувствительность тканей к инсулину. С другой стороны, NAD+-содержащий фермент никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT) повышенно регулируется в мышиных моделях ожирения и резистентности к инсулину и сверхэкспрессируется во многих опухолях. Этот фермент обладает двойным эпигенетическим действием, одновременно истощая S-аденозилметионина и NAD+ и тем самым нарушая процессы метилирования и деацетилирования. Еще одним важным фактором среды является гипоксия, которая может быть вызвана интенсивными физическими нагрузками, восхождением в горы, авиаперелетами на большой высоте, а также рядом патологий – онкология и заболевания сердечно-сосудистой системы. Следовательно, вызванное гипоксией повышение уровня NADH также может подавлять активность деацетилазы сиртуина. Гормоны системного действия также являются важным специфическим фактором контроля эпигенетической системы регуляции экспрессии генов в организме млекопитающих (Wu S.C., Zhang Y., 2009). Авторы цитируемого обзора сообщают, что ядерные рецепторы гормонов могут прямо или косвенно вовлекать модифицирующие хроматин ферменты, такие как метил-трансферазы (HMTs) и деметилазы белков гистонов в процессы регуляции экспрессии различных генов-мишеней. Например, ассоциированная с коактиватором аргининметилтрансфераза 1 (фермент CARM1, также известный, как PRMT4) является одним из наиболее хорошо охарактеризованных примеров HMTs, который играет важную роль в опосредовании функции ядерных рецепторов эстрогенов. Данный фермент осуществляет метилирование остатков аргинина в положении 2, 17 и 26 гистона H3 и опосредует активацию транскрипции генов-мишеней. С другой стороны, физиологически активная форма гормонов щитовидной железы - трийодтиронин (Т3), взаимодействуя с собственным ядерным рецептором, способствует активации гистоновых метилтрансфераз CARM1, так и PRMT1,тем самым увеличивает метилирование остатков аргинина, стимулируя транскрипцию. Напротив, подавление транскрипции, опосредованной рецепторами Т3 в отсутствие гормона объясняется метилированием H3K9 с помощью SUV39H1. 2.Метилирование ДНК Метилирование ДНК является одним из наиболее важных эпигенетических механизмов. Метилированию подвергается цитозин, стоящий в паре с гуанином в одной полинуклеотидной нити ДНК - CpG-сайты. Современные данные литературы свидетельствуют о том, что у млекопитающих метилировано 60-80% CрG, которые распределены закономерно в повторяющихся последовательностях, транскрибируемых участках генов и межгенных областях. Предполагается, что метилирование CpG сайтов может играть важную роль в ограничении доступности хроматина и к подавлению транскрипции (Li Y. et al., 2021). В то время, как CpG является основной мишенью метилирования ДНК, присоединение метиловой группы может происходить на сайте CpNpG, где N может быть представлен A, T или C (Stoll S. et al., 2018). Известно несколько вариантов метилирования ДНК, такие как 5-метилцитозин (5 mC), N6-метиладенин (6mA) и 4-метилцитозин (4 mC), где цифрами обозначено положение метильной (СН3) группы в азотистом основании нуклеотида (Chen K et al., 2016). При этом, варианты метилирования 6mA и 4mC могут встречаться в геноме прокариот, тогда, как вариант метилирования 5mC широко распространенный тип метилирования ДНК эукариот. Результаты наиболее ранних исследований позволили установить роль 5mC-модификации цитозина в процессах митотического деления клетки. Но только в 1983 году первая ДНК-метилтрансфераза (Dnmt1) была очищена группой Ингрэма (Bestor и Ingram, 1983). Было показано, что Dnmt1 предпочтительно метилирует ДНК в сайтах CpG, тогда, как отсутствие активного фермента Dnmt1 в эмбриональных стволовых клетках мыши приводит к истощению метилирования CpG во всем геноме, что указывает на роль Dnmt1 в поддержании метилирования во время репликации ДНК. Сейчас установлено, что сложная закономерная топология метилированных участков ДНК формируется при участии ДНК-метилтрансфераз (DNMTs), включая DNMT1, DNMT3A и DNMT3B, а также ферментов, осуществляющих деметилировании ДНК, включая семейство TET метилцитозиндиоксигеназ. При этом, ДНК-метилтрансферазы DNMT3A и DNMT3B катализируют метилирование CpG в ранее неметилированных CpG. Тогда, как ДНК-метилтрансфераза DNMT1 обеспечивает воспроизведение с высокой точностью ранее существовавших сайтах метилирования CpG во вновь синтезированной дочерней цепи ДНК, обеспечивая сохранность ранее метилированных сайтов CpG во время деления клетки (Li Y. et al., 2021). Основным биологическим эффектом метилирования ДНК обычно является подавление экспрессии генов. Результаты исследования с использованием линии мышей, у которых отсутствовал фермент Dnmt1, показали, что утрата способности к метилированию ДНК привела к экспрессии некоторых генов, которые в норме находятся в неактивном состоянии. Обнаружены также специфические белки, способные распознавать 5mC-метку на молекуле ДНК и выполняют последующие действия, т.е. эффекторы или считыватели 5mC. Выявлено четыре белка-считывателя 5mC, включающие семейство метил-CpG-связывающих доменов (MBD), включая MeCP2, MBD1,MBD2 и MBD4 (Chen K et al., 2016). Установлено, что белок катенина p120 Kaiso является специфическим считывателем 5mC и функционирует как репрессор генов, зависимый от метилирования ДНК. Последующий анализ белков-считывателей 5mC привел к более полному объяснению роли метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов. Было выяснено, что специфическое связывание считывающих белков с метилированным CpG приводит к подавлению экспрессии генов и представляет собой фундаментальный эпигенетический механизм, имеющий особое значение у высших организмов. Таким образом, метилирование ДНК непосредственно участвует в процессах регуляции экспрессии генов. Наряду с модифицированием гистонов метилирование ДНК модулирует структуру хроматина и влияет на экспрессию генов, определяя их активность в разных типах клеток. Тем не менее, согласно современным представлениям, подавление экспрессии генов метилированием ДНК может происходить напрямую или опосредовано. Например, присутствие метил-группировок в промоторной области гена напрямую связано с подавлением транскрипции, за счет прямого подавления связывания факторов транскрипции с промотором гена. Либо опосредованным путем, через рекрутирование белков репрессоров транскрипции, (например белок Kaiso). Белки-репрессоры предотвращают доступ транскрипционных факторов к промоторной области. Данные белки содержат метил-CpG-связывающий домен (MDB) и обладают способностью специфически связываются с метилированной ДНК. MBD-содержащие белки обеспечивают репрессию транскрипции. Данная группа белков модифицируют структуру хроматина, инициируя активность гистондеацетилазы (HDAC) к метилированной ДНК, что приводит к репрессии генов (Schubeler D. et al., 2000). Однако, в литературе имеются данные о том, что у позвоночных значительная часть CpG сайтов в зоне промотора не чувствительны к действию ДНК-метилтрансфераз, образуя CpG-островки, свободные от метилирования (Hughes A.L. et al., 2020). В данном случае доступность транскрипции определяется эпигенетическими метками белков-гистонов. Например, триметилированние остатка лизина в гистоне Н3 (H3K4me3) в геномах позвоночных тесно коррелирует с расположением CрG-островков, ассоциированных с промотором. Приводятся данные о том, что метилирование ДНК связано с отсутствием метилирования H3K4 и наличием метилирования H3K9 (Cheng X., Blumenthal R.M., 2010). Напротив, метилирование ДНК в области транскрибируемого участка гена может оказывать положительное влияние на экспрессию гена. Метилирование ДНК транскрибируемого участка гена может оказывать влияние на течение элонгации РНК во время транскрипции, регулировать сплайсинг РНК и изменять расположение нуклеосом, что в совокупности поясняет разнообразие роли метилирования ДНК в процессах регуляции экспрессии генов (Stoll S. et al., 2018). Важно отметит, что в системе контроля транскрипции различные формы метилирования ДНК могут координировать свои эффекты с различными гистоновыми метками, поскольку метилтрансферазы, деметилазы и белки-считыватели метилирования ДНК взаимодействуют с различными гистоновыми метками или ферментами модификации гистонов. Поскольку динамика ковалентных модификаций ДНК и белков-гистонов строго регулируется и координируется между собой, то уместно говорить о наличии эпигенетического кода, главное назначение которого управление экспрессией генов (Hashimoto H. et al., 2010). Например, деметилирование ДНК положительно коррелирует с активностью деметилаз остатков лизина в гистонах (Allis C.D., Jenuwein T., 2016). Затрагивая тему взаимодействия механизмов метилирования ДНК и гистонов, следует отметить, что метилирование CpG сайтов ДНК положительно коррелирует с метилированием остатков лизина гистонов H3K9 и негативно коррелирует с метилированием H3K4 (Meissner A. et al, 2008). Показано, что ДНК-метилтрансфераза Dnmt3L обладает способностью специфически взаимодействует с амино-концом гистона H3 только тогда, когда H3K4 не подвергался метилированию (Hashimoto H. et al., 2010). Следовательно, Dnmt3L может использовать в качестве метки метилированный сайт H3K4. Поэтому, когда метилирование H3K4 отсутствует, Dnmt3L индуцирует метилирование ДНК de novo путем присоединения Dnmt3a к нуклеосоме в положении H3K4, что позволяет говорить о согласованном функционировании сложного комплекса гистонов–Dnmt3L–Dnmt3a–ДНК. В современных публикациях высказывается мнение о том, что метилирование цитозина в CpG-динуклеотидах ДНК и остатков гистонового лизина и аргинина представляет собой модификацию хроматина, которая критически важна для сохранения целостности наследственного материала, а также для регуляции репликации транскрипции (Li Y. et al., 2021). Поэтому представленную выше информацию уместно дополнить данными о взаимодействии ДНК-метилтрансфераз и метилтрансфераз остатков аргинина в белках гистонах. Было показано, что симметричное метилирование гистона H4 аргинин 3 (H4R3me2s) белком аргининметилтрансферазой PRMT5 требуется для последующего метилирования ДНК. H4R3me2s служит прямой связывающей мишенью для ДНК-метилтрансферазы DNMT3A, подавляющей экспрессию генов. Напротив, утрата метки H4R3me2s в результате подавления аргининметилтрансферазы PRMT5 приводит к снижению связывания DNMT3A, потере метилирования ДНК и активации генов (Zhao Q. et al., 2009). Метилирование ДНК, также, как и ковалентная модификация гистонов обладает высокой пластичностью, в частности, именно регуляторные участки гена могут подвергаться наиболее динамичному метилированию и деметилированию. Возможно, активное деметилирование, связанное с присутствием метилированных производных цитозина, может играть решающую роль в цитодифференцировке и поддержании популяций стволовых клеток. Установлена связь между активным деметилированием ДНК и эмбриональным развитием. ДНК прокариотических клеток также содержат метилированные метки. Имеются данные о том, что N6-метиладенин (6mA или m6dA), присутствует в ДНК прокариот и играет решающую роль в репликации и репарации ДНК, защите бактериальных клеток от вирусной инвазии благодаря тому, что 6mA метка может быть распознана соответствующими эндонуклеазами рестрикции в качестве маркера, предотвращающего рестрикцию генома хозяина и дальнейшего обеспечения деградации неметилированной чужеродной ДНК. Между тем, ядерная ДНК эукариот также содержит достаточно высокий уровень 6mA-меток. Возможно, присутствие 6mA модификаций аденина в ядерной ДНК эукариот допустимо рассматривать в качестве еще одной потенциальной эпигенетической метки в дополнение к 5-метилцитозину. Обнаружено, что в ядерной ДНК эукариот 6mA-метки могут располагаться в сайтах старта транскрипции (TSS), в транскрибируемых областях генов, а также области ДНК-линкера между сопредельными нуклеосомами. Механизмы метилирования ДНК критически важны для процессов роста и развития многоклеточных организмов, как животных, так и растений. Показано, что у мышей нокаутирующие мутации (исключающие возможность экспрессии гена) любого из трех генов, кодирующих ДНК-метилтрансферазы (Dnmt1, Dnmt3a и Dnmt3b) являются летальными (Zilberman D, Henikoff S., 2007). Используя метод сопоставления комплексов метилированных локусов клеток различных тканей или разных индивидуумов возможно сформировать представление о полиморфизме метилирования ДНК, что в свою очередь делает возможным создание наборов маркеров метилирования, способных отличать, например раковые клетки от нормальной ткани. Важно отметить, что нарушение интенсивности и топологии метилированных меток ДНК рассматривают, как одну из причин заболеваний человека. Установлено, что малигнизированные клетки проявляют гиперметилирование в промоторных областях многих генов-супрессоров опухолей, такие как ген ретинобластомы (Rb1), глутатион S-трансфераза pi (GSTP1) и Е-кадгерин (CDH1), что приводит к подавлению экспрессии данных генов (McCabe M.T. et al., 2009). По мнению авторов, показатели метилирования ДНК значительно влияют на состояние экспрессии генов раковых клеток в еще большей степени, чем мутации кодирующей области генов. Напротив, гипометилирование промотора гена Atgr1a, кодирующего белок рецептора к Ангиотензину-II (AT1aR), приводит к повышению кровяного давления и усиливает чувствительность к потреблению соли (Stoll S. et al., 2018). Как уже отмечалось, существует тесная взаимосвязь процессов метилирования ДНК и ковалентной модификации гистонов (метилирование и ацетилирование). Кроме того, гены, кодирующие ДНК-метилтрансферазы могут мутировать, способствуя патологическим изменениям в клетках. Сообщается, что мутации в гене DNMT3L не только глобально подавляли метилирование ДНК, но и ингибировали способность Dnmt3L связываться с неметилированным лизином гистона H3K4me0 (Hashimoto H. et al., 2010). Поэтому механизмы, с помощью которых участки CpG остаются неметилированными в нормальных клетках или приобретают метилирование ДНК в раковых клетках, могут быть тесно связаны с интенсивностью модификации гистонов, поскольку неметилированные CpG-островки активных генов обогащены ацетилированными H3 и H4, а также H3K4me2. С другой стороны, появление дополнительных, нехарактерных для нормальных клеток, сайтов метилирования ДНК в раковых клетках, сочетается с преобладанием метилированием лизина в участках H3K9me2/3 и/или H3K27me3, что в свою очередь может приводить к устойчивой конденсации хроматина в гетерохроматин. Но и в нормальных клетках также метилирование лизина H3K9 и метилирование ДНК тесно связаны в гетерохроматиновых и транскрипционно-репрессированных эухроматических областях. Данный тандем метил-трансфераз гистонов и ДНК критически важен для регуляции экспрессии генов в течении гисто- и органогенеза. |