Называют популяцию, представляющую собой потомство одной или нескольких клеток одного вида микроорганизма

• Название: Называют популяцию, представляющую собой потомство одной или нескольких клеток одного вида микроорганизма
• Дата: 01.01.2022
• Размер: 123.26 Kb.
• Имя файла: mikra_kollok_otvetiki.docx
• Тип: Документы; #322716
• страница: 2 из 3

16. Культивирование микроорганизмов поверхностным способом

Микроорганизмы выращивают на поверхности плотной, сыпучей или в тонком слое жидкой среды, при этом микроорганизмы по- лучают кислород непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании стараются увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. На сыпучих средах поверхностным методом получают ферментные препараты. Поверхностное культивирование микроорганизмов применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности.

17. Глубинное культивирование в жидких средах

Все способы культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. При глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород.

Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать (подводить кислород вглубь жидкой среды). Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью.

Наиболее широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования — выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или пробирок со скоростью 100–200 об/мин и более. Чем больше скорость вращения, тем больше соприкосновение среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Помимо перемешивания аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием (барботирование)

через толщу среды стерильного воздуха. Этот способ используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, кислот.

Преимущества глубинного культивирования заключаются в от-

сутствие больших площадей и громоздкого оборудования (объемферментеров можно увеличить за счет увеличения высоты), в простоте обслуживания, возможности автоматизации, удобстве выделения целевого продукта из культуральной жидкости.

Глубинное культивирование микроорганизмов может быть пе-

риодическим и непрерывным.

При периодическом методе культивирования весь объем питательной среды засевают чистой культурой и выращивание ведут в оптимальных условиях в течение определенного периода до накопления нужного количества целе-

вого продукта.

Поскольку культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), клетки все время находятся в меняющихся условиях.

Сначала они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает недостаток питания и отравление вредными продуктами обмена.

В связи с этим культура в своем развитии проходит четыре фазы

роста и размножения, в течение которых изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства (рис. 5.4 (по оси ординат изображен логарифм накопления биомассы клеток)).

Первая стадия — лаг-фаза (латентная), или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду. В этой фазе микроорганизмы не размножаются, а приспосабливаются к среде, повышается содержание нуклеиновых кислот, происходит увеличение размера клеток. Эта стадия служит подготовкой к дальнейшему интенсивному синтезу белка клеткой, т. е. ее росту и размножению.

Вторая стадия — фаза логарифмического роста (экспоненциальная) характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена. Период времени, необходимого для удвоения числа клеток, называется продолжительностью генерации. В благоприятных условиях клетки бактерий делятся каждые 20–30 мин, их число увеличивается в геометрической прогрессии (1, 2, 4, 8, 16

и т.д.).

Третья стадия — стационарная фаза (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным.

Четвертая стадия — фаза отмирания, когда начинается гибель клеток и их количество уменьшается за счет отмирания и автолиза (самопереваривания). Периодическое культивирование осуществляют во многих производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Его недостатком являются нерациональные затраты времени на прохождение всех четырех стадий развития культуры, причем период самой активной

жизнедеятельности — фаза логарифмического роста — занимает небольшую часть производственного цикла.

В течение последних 30 лет все большее значение приобретает более прогрессивный метод непрерывного культивирования микроорганизмов. Он состоит в том, что культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает свежая питательная среда и с той же скоростью отводится культуральная жидкость. Посевной материал выращивают до стадии логарифмического роста и вносят в питательную среду. Продолжительность периода логарифмического роста зависит от количества питательных веществ

в среде, а также от количества вредных продуктов обмена, выделяемых клеткой.

При большой скорости притока среда быстро обновляется, питательные вещества не успевают накопиться и культура поддерживается сколь угодно долго в активном состоянии, не достигая стадии отмирания (рис. 5.5). Несмотря на значительное аппаратное усложнение технологического процесса, метод непрерывного культивирования имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим способом.

В последние годы активно разрабатывается и применяется метод

непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном (прикрепленном) состоянии: на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов.

Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность.

Непрерывное культивирование очень перспективно, широко используется в пищевой и микробиологической промышленности и создает возможность автоматического поддержания заданных оптимальных условий, благодаря

чему обеспечивается стандартность готового продукта при наименьших затратах.

18.

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ

МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Одно из важнейших достижений в области биотехнологии, оказавших значительное влияние на различные производства пищевых продуктов с использованием микроорганизмов, — это применение иммобилизованных (закрепленных) микроорганизмов.

Преимуществом использования иммобилизованных микроорганизмов является упрощение процесса подготовки посевного материала микроорганизмов в биотехнологическом процессе. При этом их биологическая активность сохраняется гораздо дольше, чем у интактных клеток. Иммобилизованные тем или иным способом клетки микроорганизмов можно использовать для получения биологически активных веществ и в пищевых производствах в течение нескольких месяцев или даже лет при соблюдении определенных санитарно-микробиологических мероприятий.

Как утверждают многочисленные исследования [20, 21], в природе, а именно в почвах, в илах, в горных породах, на поверхности растений микроор-

ганизмы в основном существуют в закрепленном состоянии.

Еще более полутора столетий назад натуральный спиртовый уксус

получали с помощью уксуснокислых бактерий, закрепленных на натуральном носителе — буковых стружках. Иммобилизованные на различных носителях клетки использовались во многих технологиях, связанных с брожением субстратов в конце 60-х — начале 70-х гг. ХХ в. Ранее были известны работы по иммобилизации ферментов (глюкозоизомеразы, пенициллиназы и многих

других) на носителях, что привело к существенной стабилизации

их активности.

Иммобилизованные микроорганизмы имеют ряд преимуществ по сравнению с иммобилизованными ферментами:

· отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов и продуктов

реакции,

· более высокая стабильность,

· возможность создавать непрерывные и полунепрерывные автоматизированные процессы,

· способность к длительному функционированию полиферментных

систем клеток микроорганизмов.

Для иммобилизации применяют микроорганизмы различных таксоно-мических групп и в различной степени поврежденные, например, замороженные, высушенные и др.

Иммобилизации можно подвергать вегетативные клетки, а также споры микроорганизмов.

Для иммобилизации клеток микроорганизмов, так же, как и для

иммобилизации ферментов, используют адсорбцию, ковалентное

и поперечное связывание и включение в гели. В качестве носителей

используют природные и синтетические материалы, способные обеспечивать высокую активность и стабильность системы, высокое качество получаемого продукта, низкую стоимость процесса, сохранение механической прочности носителя, возможность автоматизации процессов иммобилизации, ферментации и выделения конечных продуктов.

Иммобилизованные клетки применяют при проведении непрерывных и полунепрерывных процессов.

В настоящее время иммобилизованные клетки микроорганизмов в промышленном масштабе используют для получения аспарагиновой и яблочной кислот, фенилаланина, фруктозы и фруктозоглюкозных сиропов из различного сырья, в виноделии, в пивоварении и ряде других процессов [19, 20].

Основы методов иммобилизации и области применения иммобилизованных клеток

Существует довольно много методов иммобилизации микроорганизмов. Условно их можно разделить на три основные группы: механические, физические и химические. Используются также и их сочетания: механическое улавливание микроорганизмов, усиленное ковалентным связыванием.

Практическое значение для отраслей промышленности, где применяют брожение, имеют следующие методы иммобилизации (рис. 78):

— адсорбция/адгезия микроорганизмов на поверхности носителей (древесная стружка, пористая керамика, кольца Рашига, растительные волокна, силикатные минералы, соединения титана, стекловолокно и др.);

— включение в гели (носитель: альгинат кальция, карраген, агароза, хитозан, пектин, желатин, полиакриламид и др.);

— ковалентное связывание;

— мембранное удерживание микроорганизмов (носитель: клетчатка, диатомит, двухфазные эмульсии, мембраны различного происхождения).

Рис.78. Методы иммобилизации микроорганизмов: К — иммобилизованные клетки (21, с. 199)

Иммобилизация клеток микроорганизмов является перспективным способом интенсификации технологических процессов. Все шире их применяют не только в области синтеза ценных органических соединений, но и при очистке сточных вод и воздуха от загрязнений, а также для извлечения из них ценных веществ. Проблема длительного поддержания клеток микроорганизмов в жизнеспособном состоянии в ходе непрерывных и периодических процессов на «голодных» средах или в присутствии питательной среды является одной из важнейших задач настоящего времени. Не менее важной и интересной с научной и практической точек зрения является проблема иммобмлмзации клеток, сконструированных генной

инженерией, сохранение их в активном, жизнеспособном состоянии после иммобилизации. Наконец, важны усилия технологов для успешной реализации фундаментальных исследований в этой области, для создания крупномасштабных эффективных и экономичных процессов.

Более подробно по способам:

Наибольший практический интерес представляет простой и относительно дешевый метод иммобилизации клеток — адсорбция, при которой происходит физическое взаимодействие микроорганизмов и носителя (сорбента). В качестве адсорбентов используют самые различные материалы, природные и синтетические, например керамику, уголь, песок, дробленые раковины, металлическую крошку, капрон, полиуретан.

Главную роль ари адсобрции играет ионное и электростатическое взаимодействие носителя и поверхности клеток. Однако сродство того или другого микроорганизма к адсорбенту во многих случаях непредсказуемо.

При адсорбции можно выделить следующие основные этапы:

— первичная адсорбция;

— вторичная адгезия, обусловленная процессами образования клеточных метаболитов (полисахаридов, белков и т.д.);

— накопление последующих клеточных слоев на поверхности первичного клеточного слоя за счет поступления микроорганизмов в реактор при непрерывных процессах и/или их размножения.

Недостатком метода адсорбции является незначительная прочность удерживания клеток и ограниченное количество биомассы, адсорбируемой единицей носителя. Недостатки можно устранить при использовании крупнопористых носителей (пористых стекол, керамики).

Величина пор носителя должна превышать размер клеток в несколько раз. Например, такого рода адсорбенты применяли в США в установке, бессменно действующей в течение 2 лет, для переработки органических отходов с целью получения метана. Адсорбированные клетки применяют в процессе очистки сточных промышленных вод.

Ковалентное и поперечное связывание микроорганизмов к носителям начали применять позднее других методов иммобилизации вследствие токсичности используемых реагентов, например, глутарового и других альдегидов, цианурхлорида и др. Метод основан на образовании ковалентных связей молекул белков и других соединений клеточной стенки микроорганизмов с активированными бифункциональными реагентами носителями. Возможна предварительная обработки носителя, например, карбодиимидом, гексаметилендиамином с последующим привязиванием клеток. При этом исключается контакт с токсичным реагентом, активность клеток не снижается либо снижается в незначительной степени, сохраняется жизнеспособность клеток.

Для ковалентного привязывания дрожжевых клеток использовали оксиметакрилатный гель типа сефарон. Наличие доступных для практического использования синтетических носителей методом ковалентного привязывания клеток применили в пивоваренной промышленности, а также для получения безлактозного молока.

Непосредственное привязывание клеток друг к другу с помощью бифункциональных или полифункциональных реагентов типа альдегидов или аминов относится к «химическому поперечному связыванию». Этот метод применим для клеток, проводящих одностадийные процессы, например, с глюкозоизомеразной, пенициллинамидазной активностью. Так, колонка с поперечносшитыми клетками Streptomyces olivactus сохраняла неизменной глюкозоизомеразную активность более 40 сут. Метод ковалентного связывания и поперечной сшивки живых клеток микроорганизмов используется реже остальных методов иммобилизации.

Включение в гели — в настоящее время этот метод иммобилизации имеет наибольшее применение. Метод отличается достаточной прочностью фиксации клеток. Микробная клетка заключается в полимерную сетку, в ячейки которой проникают молекулы субстрата. Чаще всего в качестве носителей применяют природные полимеры полисахаридного происхождения с карбоксильной группой (альгинат, каррагенан, агар, желатин, различные пектины) или с аминогруппой (хитозан), а также синтетические (полиакриламидный гель, фоточувствительные полимеры, полиуретаны, поливиниловый спирт и др.). В зависимости от их механических свойств и характера проводимого процесса полимеры могут использоваться в различной форме: гранул, мембран, волокон.

Вследствие нетоксичности, большей совместимости с пищевыми продуктами и относительной дешевизны, природные полимеры имеют преимущества перед синтетическими (полиакриламидом, полиуретаном и поливинил-хлоридом).

В начале применения метод включения в полиакриламидный гель (ПААГ) рекомендовался как универсальный для многих микроорганизмов. Однако в дальнейшем было отмечено отрацательное воздействие акриловых мономеров и самого процесса полимеризации на жизнеспособность и ферментативную активность многих микроорганизмов. Поэтому в ряде случаев ПААГ заменяют Ca-альгинатным гелем, каррагинаном и другими носителями. В тоже время, отмечаются и преимущества геля: простота приготовления, относительная дешевизна, возможность включения клеток любого размера и заданное их количество, прочность фиксации клеток, прочность гранул на стирание и разрыв.

Процесс полимеризации может оказывать значительное влияние на ферментативную активность клеток, как положительное, так и отрицательное. В тех случаях, когда должна быть изменена клеточная проницаемость, частичный положительный эффект достигаетсся уже в процессе полимеризации. Он может быть усилен под рействием различных факторов до

и после полимеризации. К таким факторам воздействия на активность клеток, включенных в ПААГ, относятсится тепловая обработка, замораживание и оттаивание, автолиз, обработка органическими растворителями, поверхностно-активными веществами, ультразвуком и др.

Примерами иммобилизации клеток методом включения в полиакриламидный гель (ПААГ) служит получение яблочной кислоты из фумаровой с помощью Brevibacterium ammoniagenes, аспарагиновой кислоты с использованием Escherichia coli.

Коррагинан

Поиски более экономичных и эффективных носителей для иммобилизации клеток микроорганизмов привели к полисахаридам природного происхождения. В результате был найден К-каррагинан (каппа-каррагинан) – полисахарид из морских водорослей, используемый как пищевая добавка. Полисахарид молекулярной массой 100 000 – 800 000 состоит из структурных единиц сульфата b-Д-галактозы и 3,6-ангидро- a- D - галактозы.

Процесс полимеризации достаточно прост. Разогретый до 45оС коррагинан смешивают с суспензией клеток, придают нужную форму частицам (шариков, мембран, волокон, трубок) и охлаждают и оставляют для затвердения. Для придания достаточной прочности осуществляют сшивку глутаровым альдегидом и обрабатывают гексаметилендиамином. Однако обработка повышает активность ферментов и стабильность одностадийных процессов, но снижает жизнеспособность клеток.

Известны разработки по иммобилизации живых клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae при получении этанола, бактерий Acetobacter aceti при получении уксусной кислоты, Gluconobacter suboxidans для получения сорбозы, Corinebacterium glutamicum при получении глутаминовой кислоты и др.

Процессы получения этанола и сорбозы в лаборатории с помощью живых клеток в коррагинане показали, что микроорганизмы в геле растут с такой же скоростью, что и свободные клетки

Иммобилизация клеток микроорганизмов коррагинаном нашла широкое применение в исследовательской практике, но промышленного применения пока не имеет.

Включение в альгинатные гели относится к мягим методам иммобилизации, т.к. клетки остаются живыми и могут осуществлять полиферментные процессы. Положительным качеством геля является возможность в нем размножаться, а также его способность к растворению при изменении рН и температуры, что позволяет выделять жизнеспособные клетки и облегчает изучение их свойств. Са- альгинатные гели обладают хорошими диффузионными свойствами, и в этот гель могут быть включены микроорганизмы и ферменты с очень большой молекулярной массой.Кислород, глюкоза и альбумин диффундируют в гель с той же скоростью, что и в водной среде.

Механическая прочность шариков или волокон из альгината позволяет их использовать в разнообразных непрерывных и периодических процессах. Са- альгинатный гель использован в промышленном масштабе для синтеза этанола в Японии [20]. Причем, альгинетные гранулы, содержащие дрожжи и приготовленные в асептических условиях с низким рН (4,0), обеспечивают отсутствие посторонних микроорганизмов в течение четырех месяцев.

Фотопоперечносшитые и уретановые полимеры

Фотопоперечносшитые и уретановые полимеры пригодны для включения клеток, органелл, ферментов. Все применяемые реагенты не токсичны для клеток, поэтому метод перспективен для живых клеток, органелл и лабильных ферментов.Суть метода заключается в том, что водную суспензию клеток смешивают с расплавленным фоточувствительным преполимером, дабавляют

в кристаллическом виде инициатор реакции полимеризации – этиловый эфир бензоина, еще раз перемешивают и выливают на ограниченное бортиками кварцевое стекло для получения мембраны. Смсь облучают УФ-лучами. Образуется плотная мембрана, используемая для мембранного реактора, или после ее измельчения для периодического флуидизированного реактора. При этом методе иммобилизации возможно включение живых вегетативных клеток и спор с последующим размножением в геле в присутствии питательной среды.

Так, например в Японии успешно осуществляют синтез этанола дрожжами Saccharomyces cerevisiae, введенными в фоточувствительный полимер.

Клетки микроорганизмов, иммобилизованные указанным способом, применяют также для получения акриламида из акрилонитрила, в дальнейшем используемого в отбеливании бумаги в промышленном масштабе. А также для реакций трансформации малорастворимых в воде соединений, например стероидов и эфиров ментола.

Кроме рассмотренных нами способов иммобилизации клеток микроорганизмов применяют другие полимеры: различные целлюлозы, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и др. В настоящее время продолжается поиск новых эффективных методов иммобилизации, используют комбинации различных методов, позволяющих улучшить свойства носителей. Наиболее перспективными методами иммобилизации для живых клеток считаютсяадсорбция на крупнопористых органических носителях и включение в Са- альгинатный гель, фоточувствительные полимеры, каррагинан и полиакриламидный гель.

19. Физические факторы, влияющие на жизнедеятельность микроорганизмов.

Абиотические факторы окружающей среды — это физико-химические условия среды обитания. К физическим факторам относятся температура, влажность среды, осмотическое давление, разные виды лучистой энергии.

20. Влажность среды. Температура.

Влияние температуры

Важнейшим фактором внешней среды является температура. Она определяет скорость размножения микроорганизмов, а также интенсивность протекания химических реакций в процессах обмена веществ в клетках. При переходе к крайним температурам жизненные процессы вначале замедляются, а затем или приостанавливаются, и жизнь переходит в скрытую форму, или вообще прекращаются. По отношению к температуре микроорганизмы подразделяют на три группы: психрофилы, мезофилы и термофилы.

Психрофилы, (холодолюбивые); факторы, определяющие возможность роста при низких температурах. Область температур роста психрофилов лежит в пределах от -10 до +200С и выше. В свою очередь, психрофилы делятся на облигатные и факультативные. Облигатные психрофилы не способны к росту при температуре выше 200С, а верхняя граница роста факультативных форм намного выше. Принципиальное сходство между ними – способность к росту при 0ОС и минусовых температурах.

Существование двух типов психрофилов объясняется особенностями их мест обитания. Облигатные психрофилы приспособились к устойчивым холодным условиям (глубины морей и океанов, ледяные пещеры).

Психрофилы второго типа приспособились к обитанию в неустойчивых холодных условиях. В природе большинство психрофилов представлено факультативными формами. Способность психрофилов расти в условиях

низких температур связывают в первую очередь с особенностями их ферментов и мембранных липидов. Обязательное условие возможности роста психрофилов при минусовых температурах – нахождение воды в жидком состоянии. К ним относятся в основном обитатели холодных источников, северных морей, обитатели почв полярных зон, микроорганизмы, развивающиеся в холодильниках на охлажденных продуктах и вызывающие их порчу. В эту группу входят многие светящиеся морские бактерии.

Мезофилы предпочитают температуры средних значений. Для них оптимум температуры составляет 25 — 40 °С, максимум — в пределах 45 — 50 °С. Мезофилы — наиболее распространенная в природе группа микроорганизмов, обитающих в воде, воздухе, почве, в живых организмах. К представителям этой группы относятся дрожжи, мицелиальные грибы, молочнокислые бактерии, бактерии кишечной группы (стафилококки, фекальные стрептококки) и многие другие. Вызывающие порчу пищевых продуктов возбудители пищевых отравлений и заболеваний человека в ос-новном представляют собой мезофилы.

Группу термофилов делят на 4 группы:

Термотолерантные виды растут в пределах от 10 до 55…600С, оптимальная область лежит при 35…400С. Основное их отличие от мезофилов – способность расти при повышенных температурах, хотя оптимальные температуры роста для обеих групп находится на одном уровне.

Факультативные термофилы имеют максимальную температуру роста между 50 и 650С, но способны также к размножению при комнатной температуре (200С); оптимум приходится на область температур, близких к верхней границе роста. Особенность этой группы микроорганизмов – способность к росту в пределах температур от 20 до 400С.

К облигатным термофилам отностят виды, обнаруживающие способ-ность расти при температурах около 700С и не растущие ниже 400С. Оптимальная температурная область облигатных термофилов примыкает к их верхней температурной границе роста.

Наконец, недавно обнаружены микроорганизмы, выделенные в подгруп-пу экстремальных термофилов. Для них характерны следующие температурные параметры: оптимум в области 80…1050С, минимальная граница роста 600С и выше, максимальная – до 1100С.

Термофилы довольно широко распространены в природе. Они могут обитать в горячих источниках, в почвах и водоемах жарких стран, в песках пустынь, в кишечнике человека и животных, так как большинство термофилов образуют устойчивые споры.

В бродильных производствах важную роль играют термотолерантные микроорганизмы, имеющие максимальную температуру роста при 40 — 50 °С, но растут они также и при комнатной температуре.

С жизнедеятельностью термофилов связано явление термогенеза (самосогревание) больших скоплений органических веществ (навоз, торф, сено, силос, зерно, хлопок, крупы, мука и др.). Термофилы встречаются в продуктах, прошедших тепловую обработку (в консервном, сахарном и других производствах). К термофилам и психрофилам относятся в основном бактерии.

Высокие температуры микроорганизмы переносят значительно хуже, чем низкие. Повышение температуры выше максимальной всегда приводит к гибели клетки. Большое значение имеет не только степень нагревания, его продолжительность, но и вид микроорганизма, а также химический состав субстрата (питательной среды), pH и др.

Неспороносные бактерии при нагревании влажных субстратов до 60—70 °С погибают в течение 15 — 30 мин, при 80 —100°С — через 0,5—3 мин.

Дрожжи и мицелиальные грибы погибают уже при 50—60°С. Более устойчивы к нагреванию термофилы.

Влияние влажности

На жизнедеятельность микроорганизмов большое влияние оказывает влажность среды. Вода входит в состав их клеток (до 85 %) и поддерживает тургорное давление в них. Питательные вещества могут проникать внутрь клетки лишь в растворенном состоянии, и в растворенном виде удаляются из клетки продукты обмена. Все химические реакции, протекающие в клетках, требуют также присутствия водной среды. В связи с этим обезвоживание субстрата (продукта) и клеток микроорганизмов приводит к задержке их развития, они остаются недеятельными, хотя и могут сохранять жизнеспособность. При увеличении влажности жизнедеятельность микроорганизмов восстанавливается.

Микроорганизмы в зависимости от их отношения к влажности среды делятся на гидрофитов (влаголюбивых), мезофитов (средневлаголюбивых) и ксерофитов (сухолюбивых). Большинство бактерий и дрожжей гидрофиты. Многие мицелиальные грибы — мезофиты, но среди них встречаются как гидрофиты, так и ксерофиты. Для бактерий минимальная влажность субстрата, в частности пищевых продуктов, при которой они еще могут развиваться, составляет 20—30 %, для мицелиальных грибов — 11 —13 %, т. е. они могут расти на едва увлажненных субстратах.

Для развития микроорганизмов важна не абсолютная величина, т. е. общее содержание влаги в субстрате, а ее доступность. Химически связанная вода, например в коллоидах клетки (белки, полисахариды и др.), недоступна для микроорганизмов, в частности она не может служить растворителем питательных веществ. Микроорганизмы развиваются только при наличии доступной влаги. Доступность содержащейся в субстрате (продукте) влаги носит название активности воды (aw). Этот показатель вы-ражает отношение давления паров воды над субстратом (Р) к давлению

паров воды над чистой водой (Р0) при одной и той же температуре:

аw = Р/Ро

значение активности воды (aw) лежит в интервале от 0 до 1 и характеризует относительную влажность субстрата. Активность дистиллированной воды равна 1, активность воды абсолютно обезвоженного вещества равна 0.

Показатель активности воды более надежно характеризует качественное содержание влаги, необходимой для роста микроорганизмов, чем абсолютная величина влажности субстрата (продукта), которая изменяется в зависимости от относительной влажности воздуха. Микроорганизмы могут осуществлять жизнедеятельность при aw = 0,999...0,62. Более низкая активность воды в субстрате задерживает развитие микроорганизмов. Для каждого микроорганизма существуют минимальные значения aw (критический предел), ниже которых его развитие прекращается. Для большинства бактерий, в том числе и спорообразующих, aw = 0,95...0,90, за исключением галофилов (солелюбивых), у которых aw = 0,75. Для большинства дрожжей aw= 0,88, за исключением осмофилов, для которых аш = 0,8. Таким образом, чтобы затормозить развитие большинства бактерий в продукте и предотвратить его порчу, активность воды в нем следует снизить до 0,8, для предотвращения развития дрожжей — до 0,7, мицелиальных грибов — до 0,6.

Существуют разные пути снижения активности воды с целью сохране-ния пищевых продуктов от микробной порчи: сушка, вяление, добавление в продукт различных растворимых веществ (сахар, соль), а также заморажи-вание.

В высушенном состоянии многие микроорганизмы сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени. Например, брюшнотифозные бактерии, многие стафилококки и микрококки, молочнокислые бактерии могут сохраняться в сухом виде неделями и месяцами, а уксуснокислые бактерии погибают быстро. Устойчивы к

высушиванию многие дрожжи и особенно споры бактерий и мицелиальных грибов; в высушенном состоянии споры сохраняют способность к прорастанию в течение нескольких десятков лет.

На этом свойстве основано хранение производственных культур микроорганизмов. Например, широко применяют сухие закваски молочнокислых бактерий в производстве кисломолочных продуктов, маргарина, в медицине. До 2 лет сохраняют активность и часто применяются сушеные дрожжи в производстве пива, хлеба.

Для сохранения сухих продуктов и чистых культур микроорганизмов без порчи необходимо поддерживать определенное значение температуры и относительной влажности воздуха в складских помещениях.

При сублимационной сушке (высушивание под высоким вакуумом в замороженном состоянии) качество и пищевая ценность продуктов (витамины, вкусовые и биологические достоинства) сохраняются значительно лучше. Однако микроорганизмы хорошо переносят такое высушивание и даже после многолетнего пребывания в этом состоянии сохраняют жизнеспособность. В связи с этим к продуктам, подвергающимся такой обработке, следует предъявлять строгие санитарно-гигиенические требования.

21. Действие на микроорганизмы высокой и низкой температуры.

Отношение микроорганизмов к высоким температурам

Повышение температуры среды по сравнению с оптимальной оказывает на микроорганизм более неблагоприятное воздействие, чем ее понижение. Отношение разных микроорганизмов к температурам, превышающим максимальную для их развития, характеризует их термоустойчивость, которая у разных микроорганизмов неодинакова.

Терморезистентность (термоустойчивость) — способность микроорганизмов выдерживать длительное нагревание при температурах,

превышающих температурный максимум их развития. Наиболее термоустойчивы споры бактерий. Во влажной среде их гибель наступает при 120 —130 °С через 20—30 мин, в сухом состоянии при 160 —170 °С — через 1 —2 ч. Термоустойчивость спор различных бактерий неодинакова.

Споры большинства дрожжей и мицелиальных грибов по сравнению со спорами бактерий менее устойчивы к нагреванию и погибают довольно быстро при температуре 65 — 80 °С.

Температуры, превышающие максимальную, вызывают явление «теплового шока». При таком непродолжительном воздействии микроорганизмы могут реактивироваться, а при длительном наступает их гибель.

Рис. 79. Способы стерилизации

Механизм губительного действия температур еще недостаточно ясен. С одной стороны, известно, что нагревание вызывает денатурацию белков. Гибель микроорганизма при этом неизбежна, так как невозможно восстановить свойства белков цитоплазмы, ЦПМ, рибосом и других структур клетки; активность ферментов, которые тоже являются белками, также

необратимо теряется.

С другой стороны, установлено, что на температуру, при которой происходит денатурация белка, существенно влияет содержание в нем воды. В связи с этим молодые вегетативные клетки, богатые свободной водой, погибают при нагревании быстрее, чем старые, частично обезвоженные. Одна из причин высокой термоустойчивости спор бактерий — малое содержание в них свободной воды, так как большая ее часть в спорах находится в связанном состоянии.

Высокую устойчивость термофилов связывают с тем, что белки и ферменты их клеток более устойчивы к температуре по сравнению с мезофилами, благодаря чему скорость синтеза различных клеточных структур превышает скорость их разрушения под действием высоких температур.

Термоустойчивость одних и тех же микроорганизмов может изменяться в зависимости от химического состава обрабатываемой среды, ее pH, содержания доступной воды (аw), присутствия защитных веществ. Например, жиры и белки предохраняют микроорганизмы от воздействия повышенной температуры.

В пищевой промышленности и в практической микробиологии применяют термическую и химическую стерилизации.

Важнейшим условием проведения микробиологических работ является полное исключение развития посторонних микроорганизмов в исследуемых культурах и материалах. С этой целью в микробиологической практике используют только стерильные питательные среды, посуду, материалы и инструменты. Под стерилизацией понимают полное уничтожение вегетативных клеток и спор микроорганизмов. Выбор ее способа определяется особенностями материала, подлежащего этому процессу, его физическими свойствами и химическим составом.

Химические методы применяются при дезинфекции. Дезинфекция – это способ уничтожения микроорганизмов при помощи сильнодействующих химических веществ, так называемых антисептиков. К ним относятся

неорганические кислоты, щелочи, хлорная известь, йод и др. Из органических веществ – этиловый и бутиловый спирты, альдегиды, органические кислоты и растворители.

Широкое распространение при проведении микробиологических работ нашли физические способы стерилизации – термическая и холодная. К термическим относятся фламбирование, обработка горячим воздухом или прокаливанием в пламени горелки, тиндализация (или дробная стерилизация), обработка текучим паром, автоклавирование. К холодным – стерилизация фильтрованием, обработка ионизирующим и ультрафиолетовым излучениями, обработка ультразвуком.

Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяются особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими свойствами и химическим составом, целью исследования.

Стерилизация горячим воздухом (сухим жаром). Стерилизацию проводят в электросушильном шкафу. Применяют для стерилизации стеклянной посуды, металлических и других термостойких предметов. Все стерилизуемые предметы предварительно аккуратно заворачивают в бумагу. Стерилизацию проводят при 165-180ºС в течение 2 час. Выше 180ºС температуру в сушильном шкафу не поднимают, так как ватные пробки и бумага начинают обугливаться. После остывания простерилизованную посуду и материалы вынимают из шкафа и хранят до использования в специально отведенном для этого шкафу.

Тиндализация (или дробная стерилизация). Применяется для стерилизации жидкостей и питательных сред, компоненты которых разлагаются при температуре выше 100ºС. При этом прогревание стерилизуемого объекта до 50-100ºС проводят не менее 3-х раз с промежутками в 15-24 час. В период между прогреваниями стерилизуемый объект выдерживают при температуре 18-30ºС для прорастания сохранившихся в нем спор микроорганизмов. Предполагается, что

возникающие из спор вегетативные клетки погибают при последующем нагревании, не успев образовать новые споры.

Стерилизация текучим паром это прогревание жидкостей в парах кипящей воды. Обработку текучим паром проводят в течение 3-х дней по 30-40 мин ежедневно. Время прогревания отмечается с момента энергичного выделения пара. В промежутках между стерилизацией жидкости оставляют при 18-20ºС или выдерживают в термостате для проращивания спор.

Автоклавирование. Это наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации. Он основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного, т.е. при температуре выше 100ºС и осуществляется в специальных аппаратах – автоклавах. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает особую эффективность данного способа.

Пастеризация — это процесс уничтожения вегетативных клеток микроорганизмов путем нагревания продукта до 50 — 60 °С в течение 15 — 30 мин или до 70 — 80 °С в течение 5 — 10 мин. Иногда ее производят кратковременным нагреванием до 90 — 100°С. При пастеризации остаются жизнеспособными некоторые термоустойчивые бактерии и споры многих микроорганизмов. Пастеризуют многие пищевые продукты: молоко, вино, пиво, икру осетровых рыб, фруктовые соки и др.

В тех случаях, когда субстраты не выдерживают нагревания (витамины, антибиотики, белоксодержащие среды и др.), применяют методы холодной стерилизации. Это — обеспложивание субстратов с применением мембранных фильтров, обработка разными видами электромагнитных излучений и применение химических дезинфицирующих средств.

Отношение микроорганизмов к низким температурам

К низкой температуре микроорганизмы более устойчивы. Несмотря на то что размножение и биохимическая активность микроорганизмов при

температуре ниже минимальной прекращаются, гибель самих клеток чаще всего не наступает, а они переходят в состояние анабиоза («скрытой жизни»), В таком состоянии многие микроорганизмы, и особенно их споры, остаются жизнеспособными в течение длительного времени. При повышении температуры споры прорастают в вегетативные клетки и начинают активно размножаться.

Микроорганизмы погибают при замерзании среды, в которой они обитают, или когда происходят резкие скачки температуры, например при многократно повторяющемся замораживании и оттаивании.

Причиной гибели микроорганизмов при низкой температуре служит нарушение обмена веществ клетки в результате инактивирования ферментов, когда значительно замедляются внутриклеточные химические превращения веществ. Кроме того, в результате вымораживания воды происходит повышение осмотического давления среды, а следовательно, снижение активности воды в ней, что тоже ведет к нарушению обмена веществ.

Низкие температуры используют для сохранения скоропортящихся продуктов. Их хранят либо в охлажденном состоянии при температуре от +10 до —2 °С, либо в замороженном виде при температуре от —12 до — 30 °С.

Некоторые микроорганизмы временно выдерживают очень низкие температуры. Кишечная и брюшнотифозная палочки в течение нескольких дней не погибают при температурах от —172 до —190 °С. Споры бактерий сохраняют способность к прорастанию даже после 10-часового пребывания при температуре —252 °С (температура жидкого водорода). Некоторые мицелиальные грибы и дрожжи сохраняют жизнеспособность после воздействия температуры —190 °С (температура жидкого воздуха) в течение нескольких дней, а споры мицелиальных грибов — в течение нескольких месяцев.

Сроки хранения продуктов в охлажденном виде непродолжительны. Холодильные камеры необходимо регулярно дезинфицировать и поддерживать в них определенную температуру и относительную влажность воздуха.

Замороженные продукты остаются доброкачественными более длительное время, чем охлажденные. В замороженном виде хранят плоды, овощи, мясо, рыбу и др. Размораживать пищевые продукты следует непосредственно перед их употреблением.

Большое значение в сохранении качества продуктов имеют санитарно-гигиенические условия охлаждения продуктов, хранения их в холодильниках и размораживания.