ДОКЛАД НА ПРЕДЗАЩИТУ 23042018. Объектом нашего исследования
 Скачать 24.42 Kb.
|
ВВЕДЕНИЕАктуальность. В течение последних двух десятилетий нативные биологически активные соединения белкового происхождения, в основном ферменты, склонны превращаться из объектов фундаментальных исследований в важные инструменты техники в широком смысле этого слова. Получение комплексов высокомолекулярных соединений и лекарственной формы с пептидной структурой позволяет увеличить стабильность и скорость циркуляции лекарственного вещества в кровяном русле, одновременным уменьшением иммуногенности. Одна из наиболее перспективных областей применения ферментов - в медицине. Сегодня, механизм развития многих заболеваний человека выясняется на молекулярном уровне. Это стало возможным, благодаря эндогенным ферментам в организме; изменения их активности определяют возникновение и развитие соответствующих заболеваний. Вот почему энзимная терапия все больше привлекает внимание врачей, а сами ферменты все чаще занимают важное место в терапевтическом арсенале практической медицины. Теперь можно производить чистые ферменты по относительным недорогим методам практически в неограниченных количествах и даже улучшать некоторые их свойства. Объектом нашего исследования стал белковый конъюгат супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и хондроитин сульфата (ХС). Целью работы является продемонстрировать перспективы использования белкового конъюгата супероксиддисмутазы и каталазы на основе природного полимерного носителя хондроитин сульфата как антиоксидантного препарата. Задачи:
\ ПЕРЕХОД К ОСНОВНОЙ ЧАСТИОднако возможности массового использования нативных белков осложнены.
Создание иммобилизованных ферментов во многом решило эти проблемы. В 1953 Н.Грубхофер и Д.Шлейт сделали прорыв в направлении создания прочных конъюгатов из ферментов: они впервые применили ковалентное связывание белков. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом преимуществ перед своими нативными формами.
Суть химической иммобилизации сводится к созданию новых ковалентных связей между белком и подобранным носителем, который, во-первых, обеспечивает высокую прочность, образующегося конъюгата, а во-вторых, приводит к существенному изменению свойств, таких как:. субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность Это достигается не только путём связывания с нерастворим носителем, но и при помощи внутримолекулярной или межмолекулярной «сшивки» с бифункциональными реагентами или же присоединением фермента к растворимому полимеру. Перечисленные свойства важны для расширения области практического использования ферментов. Фактором, способствующим длительному, в том числе 1)непрерывному, функционированию иммобилизованных ферментов является их повышенная стабильность, 2)сохранение активности в течении длительного времени как при хранении, так и при циркулировали в системе кровообращения. Эти преимущества особенно важны для доставки ферментов, представляющие собой альтернативу для заместительной терапии ферментом Назначение иммобилизованных ферментов поистине реализовано в процессе создании биферментных конъюгатов. Тяжелые сердечно-сосудистые заболевания – это бич XXI века. Если 30 лет назад эти заболевания касались только населения в возрасте от 50лет, то сегодня этими заболевания страдает и молодёжь. Статистика показывает: инфаркт помолодел, и теперь он случает у людей в возрасте 30 лет. Устрашающее, не так ли? И всему виной - воздействие окислительного стресса. Это процесс ассоциируется с избыточностью образования активных форм кислорода. Процесс окисления происходит в то время, когда наш организм поглощает кислород, который мы дышим, и наши клетки преобразовывают его в энергию. Этот процесс также создает свободные радикалы, которые взаимодействуют с молекулами внутри наших клеток, что приводит к повреждению сердечно-сосудистых стенок, митохондрий и ДНК, других биомолекул [5]. Окисление происходит:
Окислительный стресс происходит, когда количество свободных радикалов превышает количество антиоксидантов. Именно тогда окисление повреждает наши клетки, белки и ДНК. Поэтому значимость разработки средств антиоксидантной защиты организма является актуальной проблемой в науке и медицине. На базе «Российского кардиологического научно-производственного комплекса Министерства здравоохранения Российской Федерации» разрабатывается антиоксидантный препарат на основе производных супероксиддисмутазы и каталазы, модифицированный хондроитинсульфатом. Научных работники РК НПК МЗ РФ изучали сопряжение нативных форм СОД и КАТ как средство антиоксидантной защиты, и пришли к выводу: для того, чтобы защитить сосудистую стенку тромба, необходимо одновременное действие СОД и КАТ. Добиться этого, стало возможным в результате получения биферментного конъюгата, в рамках которого СОД была ковалентно присоединена через гликозаминогликан сосудистой стенки – хондроитинсульфат (ХС) – к КАТ (был получен аддукт СОД-ХС-КАТ). Эффективному блокированию O•2-и H2O2 достигается сопряжённым действием СОД и КАТ. Благодаря их единовременному действию продукт одного ферментативного превращения при участии СОД (H2O2) становится субстратом второго ферментативного превращения с участием КАТ. Каталаза – это достаточно большой белок (молекулярная масса 240-250 кДа), состоящий из четырёх одинаковых субъединиц, рекомендовано использовать сшиваюший агент с молекулярной массой 150 кДа, вот почему был выбран хондроитинсульфат [20]. Сшивка белков ХС призвана нацеливать биферментный конъюгат к зонам сосудистого поражения. Известно, что участки атеросклеротического поражения сосудов имеют повышенное содержание ХС. Например, на модели артериального тромбоза у крыс, индуцированного обработкой сосуда насыщенным раствором хлористого железа, биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ проявлял антитромботический эффект в дозах на два порядка меньше, чем для смеси нативных СОД и КАТ, и на порядок меньших, чем для смеси модифицированных ХС СОД и КАТ. Необходимо сказать несколько слов о размерах конъюгата СОД-ХС-КАТ. Водорастворимая форма полученного биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ позволяет осуществлять как внутривенное, так и пероральное введение. По молекулярным размерам конъюгат входит в нижнюю часть наношкалы, превращаясь в наночастицу (с ориентировочными размерами (17–20) × (14–18) × (8–12) нм). Одним из самых главных преимуществ нанокапсул - высокая проникающая способность, позволяющая проникать в трудно доступные зоны организма, например, в головной мозг. Наноразмер позволяет им длительное время циркулировать в кровотоке. Результаты и их обсуждениеМодификация КАТ хондроитинсульфатом проводили схеме. На первом этапе осуществлялась активация ХС. Для этого ХС растворяли в натрий-фосфатном буфере при ph-6, а затем добавляли бензохинонон. Смесь инкубировали в темноте при Т=25 в течение 1,5ч. Для сшивания СОД-ХС-КАТ используют бензохиновый метод связывания, так как при химической иммобилизации затрагиваются аминогруппы белков. Такое сшивание позволяет сохранить остаточную католическую активность модифицированного фермента. В колонке с сефадексом проводили разделение ХС от избытка бензохинона, используя в качестве элюента (подвижная фаза) - натрий-фосфатном буфере при ph-6. Связывание КАТ с активированным ХС осущевлялось так: Активировнный ХС растворяли в натрий фосфатном буфере, а затем добавляют КАТ. Затем инкубация в темноте в течение 1,5ч. К полученной системе добавляют СОД инкубируют еще 20ч при Т=25 pH=8,8. Выделение измененных форм КАТ проводили методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом S-300. Кроме того, для наработки препаратов использовали ультрафильтрацию инкубационной смеси( процесс мембранного разделения, а также фракционирования и концентрирования веществ, осуществляемые путем фильтрования жидкости под действием разности давлений до и после мембраны.) . Выделенные препараты лиофилизоровали. Лиофилизация (от др.-греч. λύω — растворяю и φιλέω — люблю) — способ мягкой сушки веществ, при котором высушиваемый препарат замораживается, а потом помещается в вакуумную камеру, где и происходит возгонка (сублимация) растворителя. Преимущества такого способа высушивания — отсутствие воздействия высоких температур на препарат, сохранение дисперсной фазы препарата, возможность использования летучих растворителей. Содержание белка в конъюгате определяется по методу Бредфорда. В полученном препарате СОД-ХС-КАТ определялось содержание белка при оптической плотности 0,176 нм. По данным графика можно сделать вывод: при оптической плотности 0,176 нм содержание белка в продукте составляет 7,4 мкг/мл. Измерение ферментативной активности КАТ осуществляли спектрофотометрически по уменьшению поглощения (исчезновению перекиси водорода) при длине волны 240нм, а СОД - по ингибированию восстановления нитротетразоля синего в системе ксентин-ксантиоксидаза при длине волны 560нм. За единицу активности КАТ принимается количество фермента, необходимое для разложения 1 мкМ перекиси водорода за 1 мин. За единицу активности СОД принимается количество фермента, необходимое для подавления восстановления нитротетразоля синего на 50% в условиях эксперимента. ЗаключениеПроведенное биомедицинское исследование биферметного конъюгата СОД-ХС-КАТ доказывает эффективность биохимического сопряжения активностей СОД и КАТ для защиты сосудистой стенки от пагубного воздействия окислительного стресса. Совокупность полученных результатов обосновывает актуальность выяснения механизма лечебного действия антиоксидантных ферментов, способствуя определению направлений развития антиоксидантной терапии, приемов и средств её осуществления. |