Общая эпизоотология и инфекционные болезни. Ч. I-Ананьева Н.Б. Общая эпизоотологияи инфекционныеболезни
 Скачать 0.93 Mb.
|
|
2. Комплексный метод диагностики инфекционных болезней Эпизоотологический Клинический Патоморфологический: Патологоанатомический гистологический Бактериологический: Микроскопия (световая, люминесцентная) Выделение возбудителя Биопроба Вирусологический: Микроскопия (люминесцентная, световая, электронная) Выделение вируса Иммунологический Гематологический Копрологический Клинико-лабораторный: а) исследование крови б) кала, мочи и др. секретов и экскретов. Эпизоотологический метод. Представляет собой систему из- учения проявлений эпизоотического процесса. Для характеристики последнего необходимо собрать точную информацию о восприим- чивых видах, источнике и резервуаре возбудителя болезни, меха- низме его передачи, воротах инфекции, интенсивности проявления эпизоотического процесса, сезонности, предрасполагающих факто- рах, заболеваемости, смертности, летальности. Кроме того, особое внимание обращают на факторы, определяющие пути дальнейшего распространения заболевания – выполнение противоэпизоотиче- ских мероприятий и условия внешней среды. Чтобы охарактеризовать эпизоотическое состояние хозяйства, сопоставляют и оценивают обобщенные эпизоотологические пока- затели, получаемые путем статистической обработки данных пер- вичного учета заболеваний и профилактических мероприятий. Клинический метод. При клиническом исследовании живот- ных, подозреваемых в заболевании инфекционной болезнью, необ- 13 ходимо всегда строго соблюдать правила работы, предусмотренные соответствующей инструкцией. Клиническое исследование рекомендуют начинать с измере- ния температуры тела животного. Далее осматривают животное в нефиксированном состоянии: обращают внимание на положение тела реакцию на различные раздражители, прием корма и воды, ха- рактер фекалий, особенности дефекации и мочеиспускания. Затем приступают к исследованию отдельных систем и органов по схеме, общепринятой в клинической диагностике болезней. Клинические признаки инфекционной болезни зависят от мно- гих факторов: вида и локализации возбудителя, течения, формы проявления и стадии болезни, резистентности организма и других причин. Во всех случаях клинические признаки одной и той же ин- фекционной болезни у животных даже одного вида сильно варьи- руют. Патоморфологический метод. Включает в себя патологоанато- мический и гистологический методы исследований. Патологоана- томический метод считают важным, но не всегда окончательным методом диагностики. Например, если при вскрытии трупа живот- ного (птицы) отмечают характерные изменения – туберкулы, то сразу же диагностируют туберкулез, при обнаружении в селезенке свиньи краевых геморрагических инфарктов – чуму, кровоизлия- ний на границе мышечного и железистого желудка у кур – болезнь Ньюкасла и т. д. Порядок патологоанатомического исследования: оценивают состояние трупа, кожи и слизистых оболочек. Исследуют поочеред- но лимфатическую систему, серозные покровы, мышцы и суставы, органы дыхания, сердце и кровеносные сосуды, печень, селезенку, почки, глотку, пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстый ки- шечник, мочевой пузырь, органы воспроизводства, головной и спинной мозг. Однако во многих случаях наряду с патологоанатомическим применяют и метод лабораторных исследований (гистологических, бактериологических и др.). С помощью гистологического метода устанавливают точный диагноз при таких болезнях, как – бешен- ство (тельца Бабеша–Негри), ринопневмония (внутриядерные включения типа Коудри), оспа (тельца-включения). Бактериологический метод. Это ценный метод диагностики инфекционных болезней. Для бактериологического исследования 14 от больных или павших животных необходимо правильно взять патологический материал и грамотно оформить сопроводительный документ. Поступивший биоматериал обрабатывают в зависимости от предполагаемой болезни, делают мазки-отпечатки, красят их со- ответствующими методами, выделяют чистую культуру посевом на питательные (элективные) среды, заражают чувствительных лабо- раторных животных биоматериалом или выделенной чистой куль- турой (табл. 1). На основании обнаружения патогенных микроорганизмов в поступившем материале устанавливают диагноз. Вирусологический метод. Для вирусологического исследова- ния в лабораторию направляют патологический материал от боль- ных животных, взятый в период проявления у них клинических признаков (температурная реакция, угнетение, воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, сопровождающиеся сероз- ными или слизистыми истечениями из носовой полости, диарея, образование везикул, афт, иногда аборты), или вынужденно уби- тых (павших) животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их гибели. Вирусологический метод диагностики включает в себя: об- наружение возбудителя в патологическом материале различными методами (электронная, люминесцентная или световая микроско- пия, заражение культуры клеток, лабораторных животных и т. д.), выделение и идентификацию вируса в различных серологических реакциях, биопробу. Гематологический метод. В лабораторию для гематологиче- ского исследования отправляют кровь, которую берут с соблюде- нием правил асептики из яремной вены в пробирки с антикоагу- лянтом – 10 %-м раствором трилона Б, гепарина, цитрата натрия из расчета 0,02 мл раствора на 1 мл крови. Гематологический метод используют как вспомогательный, а при некоторых инфекционных болезнях (лейкоз крупного ро- гатого скота, инфекционная анемия лошадей) – в качестве ос- новного метода диагностики. При лейкозе крупного рогатого скота диагноз основан на обнаружении в периферической кро- ви повышения содержания лейкоцитов основного лимфоидного ряда в 1–10 3 мл крови, а при инфекционной анемии лошадей – на основании снижения содержания эритроцитов в 1 × 10 3 мл кро- ви, гемоглобина и замедленной скорости оседания эритроцитов (СОЭ). 15 Та блиц а 1 Бактериологический метод диагностики некоторых инфекционных болезней 16 Иммунологический метод. Включает в себя серологическую диагностику – в лаборатории исследуют сыворотки крови для об- наружения антител и аллергическую пробу, с помощью которой в хозяйствах выявляют животных, больных туберкулезом, парату- беркулезом, бруцеллезом, сапом, реже – сибирской язвой, листери- озом, туляремией. Иммунологические методы, используемые в эксперимен- тальных исследованиях и клинической практике, достаточно раз- нообразны. С их помощью можно определять иммунный статус животных в норме и при патологии, осуществлять контроль за восстановлением иммунологической компетентности организма в процессе лечения методами иммунотерапии. Для определения пер- вичного или вторичного иммунодефицита необходимо использо- вать лабораторные методы, которые позволяют определить коли- чество и функциональную активность Т-, В-клеток и нейтрофилов. Кроме того, проводится количественное определение компонентов комплемента в сыворотке крови для установления их роли в иммун- ной дисфункции. При этом, выбор методов и рекомендаций по их практическому применению представляет определенную проблему, поскольку многие из них не являются рутинными в ветеринарной клинической практике и используются только в научно-исследова- тельских лабораториях или находятся на стадии разработок. Тем не менее, некоторые методы могут служить важным инструментом распознавания и понимания иммунодефицитов животных. С помощью иммунологических исследований решаются две ос- новные задачи: Определение антигенов. Когда неизвестным компонентом реакции является антиген. Для его обнаружения в исследуемом материале используют диагностические иммунные сыворотки крови, содержащие высокоспецифичные антитела, которые были получены от животных после их вакцинации определенными ан- тигенами. Определение антител. В этом случае неизвестен состав антител в сыворотке крови. Их определяют по взаимодействию с заведомо известными антигенами (диагностикумами – стандартными препа- ратами, используемыми в качестве антигена в иммунологических или, как их еще называют, серологических реакциях). Положитель- ный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител (иммуноглобулинов), специфичных к примененному антигену. При исследовании антител к инфекционным заболеваниям, например к лептоспирозу или токсоплазмозу, достоверные ре- 17 зультаты получают при исследовании «парных» проб сывороток. Сначала анализируют кровь больного, взятую в первые дни забо- левания. Затем, через 10–14 дней, изучают повторную пробу и на основании динамики нарастания антител ставят окончательный диагноз. Иммунологические реакции протекают в две фазы: Специфическое связывание антител и антигенов. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут. Неспецифическое проявление реакции, характеризующееся внешними признаками образования иммунных комплексов анти- ген-антитело. Эта фаза может развиваться в течение нескольких минут или часов. Внешние проявления некоторых реакций зависят от свойств антигена (размеры частиц, физико-химическое состояние), класса и вида антител, а также условий проведения теста (консистенции сре- ды, концентрации солей, рН, температуры), в том числе от методов постановки «меток» на образовавшийся иммунный комплекс. В зависимости от механизма и учета результатов иммуноло- гические методы исследования подразделяют на: реакции, осно- ванные на явлении агглютинации; реакции, основанные на яв- лении преципитации; реакции с участием комплемента; реакции нейтрализации, реакции с использованием химических и физи- ческих методов (иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализы). Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio – склеивание) – склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов – натрия хлорида. В этой реакции антигенами являются крупные частицы – ми- кробные клетки, эритроциты, лейкоциты и т.д., которые склеи- ваются антителами и выпадают в осадок на дно пробирки в виде иммунных комплексов в форме хлопьев или зерен, видимых невоо- руженным глазом. Это возможно благодаря особенностям строения молекулы антител, которые имеют форму буквы Y с двумя идентич- ными антигенсвязывающими участками – по одному на конце каж- дой из двух “ветвей”. Связывание антигенных детерминант приво- дит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участ- ков два, они могут сшивать антигены. Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, 18 такая сеть может выпасть из раствора в осадок. На этом основано определение групп крови и совместимо- сти переливаемой крови пе- ред гемотрансфузией, когда эритроциты склеиваются антителами той или иной специфичности (рис. 1). При диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглю- тинации проводят в двух направлениях: – определяют вид выделенного от больного животного микро- ба-возбудителя с помощью диагностической агглютинирующей сы- воротки, содержащей специфические антитела; – обнаруживают антитела в сыворотке больного животного, используя стандартный микробный диагностикум, включающий антигены. Титром агглютинирующей сыворотки является ее наи- большее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглю- тинация соответствующего антигена. Для обнаружения лептоспироза у животных и человека ис- пользуют реакцию микроагглютинации (РМА), которую проводят на специальных планшетах в микрообъемах. При этом легко наблю- дать образование клеточного осадка на дне лунки. Отличаясь чувствительностью, реакция агглютинации также используется для идентификации антител к растворимым, мел- кодисперсным антигенам. В этом случае она называется реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА). Для этого антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперс- ных частицах или клетках, например на эритроцитах или частицах латекса. Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки крови, содержащей антитела к данному антигену. Для определения возбуди- теля к капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) до- бавляют взвесь бактерии, выде- ленных от больного животного. Образуется хлопьевидный осадок (рис. 2). К разведениям агглютинирую- щей сыворотки добавляют взвесь Рис. 1. Схема реакции агглютинации Рис. 2. Ориентировочная реакция агглютинации на стекле 19 бактерий, выделенных от больного (рис. 3). Агглютинация с О-диаг- ностикумом (бактерии, уби- тые нагреванием, сохранив- шие O- антиген) происходит в виде мелкозернистой агглю- тинации. Агглютинация с Н – диа- гностикумом (бактерии, уби- тые формалином,сохранившие жгутиковый Н-антиген) – крупнохлопчатая и протекает быстрее. Реакция преципитации (от лат praecipilo осаждать) – это фор- мирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципи- татом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк- вивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса (рис. 4). Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольце- преципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое рас- пространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др. Преципитация или осаждение иммунных комплексов проис- ходит вследствие взаимодействия антител с растворимыми анти- генами. В результате чего происходит их агрегация, что проявля- ется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата). Различные разновидности реакции преципита- ции проводят либо в жидкой среде, либо чаще всего в твердых гелях агара. Метод, основанный на реакции преципитации, также называется методом иммунодиф- фузии. Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки, вырезанные в агароз- ном геле, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаж- Рис. 3. Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного животного Рис. 4. Схема реакция преципитации 20 дается в виде линии преципитации. Этот метод используется для диагностики инфекционного гепатита у животных. Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образу- ют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание ком- племента комплексом антиген – антитело. Если же комплекс анти- ген – антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы 1-я фаза – инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) – вы- явление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и ге- молитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген – антитело происхо- дит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенси- билизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная) (рис. 5). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), ком- племент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к ком- плексу эритроцит – антиэритроцитарное антитело, вызывая гемо- лиз (реакция отрицательная) (рис. 6). Рис. 5. Схема реакции связывания комплемента с сывороткой больного Рис. 6. Схема реакции связывания комплемента с сывороткой здорового 21 Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси анти- ген – антитело животным или в чув- ствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреж- дающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммун- ной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия ком- плекса антиген – антитело. Антитела иммунной сыворотки способны ней- трализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувстви- тельные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных анти- генов антителами, т.е. их нейтрализацией (рис.7) Иммунологические методы с использованием химических и физических меток. Эти методы обладают высокой чувствительностью и специфич- ностью, и нашли широкое применение в лабораторной диагностике болезней животных и человека. Иммунофлуоресцентный анализ основан на использовании антител меченных флюоресцирующими веществами (флюорох- ромами). Меченые антитела связываются с антигеном, образуя иммунные комплексы, которые можно выявить с помощью флю- оресцентной микроскопии. Этот метод часто используют в имму- ногистохими, т. е. для определения локализации антигена в клетках и тканях. При этом можно установить распределение антигена в тканях и клетках. С другой стороны имму- нофлуоресценция позво- ляет обнаружить антитела, направленные к известному антигену данной ткани или клетки. Существуют три модификации иммунофлю- оресцентного анализа: пря- мой, непрямой и конкурент- ный (рис. 8). Рис. 7. Реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток: А - цитопатогенный эффект (ЦПЭ) в результате размноже- ния вирусов; Б - ЦПЭ отсутствует в резуль- тате нейтрализации вирусов антителами Рис. 8. Схема иммунофлуоресцентного метода Кунса : а –прямой метод; б –непря- мой метод; Аг –антиген; Ат – антитело; АГС – антиглобулиновая сыворотка 22 Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для выявления антигенов, например, вирусов в зараженных клетках, обнаружения бактерий и риккетсий в мазках, а также различных клеточных антигенов. Так, для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате в цитоплазме нервных клеток вы- являются глыбки ярко-зеленого цвета. Непрямая иммунофлюоресценция – материал, содержащий известный антиген, переносят на предметное стекло и инкубиру- ют в присутствии исследуемой сыворотки крови для образования иммунных комплексов, а затем после отмывания не связавшихся реагентов выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей антисывороткой. Связанные с субстратом антитела выявляют с по- мощью флюоресцентного микроскопа. |