Общая микробиология
 Скачать 1.12 Mb.
|
20.Основные типы биологического окисления субстрата бактериями. Аэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы, анаэробы.Примеры.Дыхание- биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О2), при анаэробном- связанный кислород ( -NO3 , =SO4, =SO3). По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов. 1.Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим атмосферный О2 для дыхания.(Микобактерии туберкулеза) 2.Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO2, например до 10% концентрации. (Campylobacter coli) 3.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.(Кишечная палочка) 4.Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях - низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов.(Clostridium perfringens) Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ). В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H2O2- перекись водорода, -О2 - свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH2). Дыхание, или биологическое окисление, основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление — присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным). Анаэробиоз— жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения. 21. Рост и размножение бактерий. Фазы размножение бактерий Рост — формирование структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки Размножение— самовоспроизведение, приводящее к увеличению количества бактериальных клеток в популяции. Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки. Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью). Репликация происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация. Различают размножение в жидкой и твердой питательной среде В жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура — непрерывной. Рост периодической культуры, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз: 1. лаг-фаза; 2. фаза логарифмического роста; 3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий; 4. фаза гибели бактерий.   Лаг-фаза — период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4—5 ч. Бактерии увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеиновых кислот, белка. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования. Фаза гибели характеризуется отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др. Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий. Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают её. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. Существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях. Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиотикоподобным действием. 22. Механические и физические способы создания анаэробных условий Механические методы удаления кислорода 1. Посев анаэробной культуры уколом в высокий столбик сахарного агара или среды Вильсон-Блера. Это наиболее простой способ. 2.Способ Виньяля-Вейона. В расплавленный и остуженный до 50°С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. В среде вырастают ясно видимые снаружи колонии бактерий, которые можно извлечь, распилив трубку. 3. Метод Перетца. В пробирку с растопленным и остужённым до 450 сахарным агаром вносится и размешивается исследуемая культура. Смесь выливается в стерильную чашку Петри, охлаждается. На поверхность накладывается стерильное стекло. Чашку в закрытом виде помещают в термостат на 18-20 часов. Под стеклом вырастают колонии, которые извлекают, отодвинув стекло Физические методы удаления кислорода 1.Аанаэростат, из которого воздух выкачивается насосом. Можно использовать вместо анаэростата эксикатор. 2. Аппарат Киппа, где воздух заменен индифферентным газом -водородом. 3. Среде Китта-Тароцци: ( МясоПептонный Бульон, 0,5 % глюкозы и кусочками свежих органов животных, например, печени или с мясным фаршем). Кусочки органов, а также глюкоза обладают рецидивирующими свойствами, поглощают О2. Перед посевом её кипятят и заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. 23. Химические и биологические способы создания анаэробных условий. Химические методы удаления кислорода 1.Прибор Омелянского, где для поглащения кислорода используется пирогаллол. 2. Среда Вильсон – Блера (железо - сульфитный агар). Черные колонии образует C.perfringens за счет образования сульфата железа (FeS) Биологический метод удаления кислорода по Фортнеру В чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины, на одну половину засевают облигатный аэроб – «чудесную» палочку (S.marcescens), на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24-48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы 24. Питательные среды для культивирования бактерий. Требования, предъявляемые к ним. Их классификация Требования В первую очередь, бактерии нуждаются в азоте, углероде и водороде для построения собственных белков. Водород и кислород для клеток поставляет вода. Источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения (мясо говяжье, рыба, мясо-костная мука, казеин), а также пептиды, пептоны. Можно использовать и заменители мяса – плаценту, кровяные сгустки, дрожжи. Следовательно, в состав сред должны быть введены источники питательных веществ и вода, а также ростовые факторы (витамины группы В, ферменты). Универсальным источником их служат экстракты из белков животного и растительного происхождения, белковые гидролизаты. Для микробов с более сложными пищевыми потребностями в состав сред включают нативные субстраты – кровь, сыворотку, асцитическую жидкость, яичный желток, кусочки печенки, почек, мозговой ткани и др. Среды должны быть сбалансированными микроэлементным составом и содержать ионы железа, меди, марганца, цинка, кальция, натрия, калию, иметь в своем составе неорганические фосфаты. Допускается применение веществ, которые устраняют действие ингибиторов роста и токсигенности микробов (отдельные аминокислоты, активированный уголь). Среды должны иметь определенную вязкость, плотность, иметь определенную влажность (до 20 % воды), быть изотоническими, прозрачными и обязательно стерильными. Плотность среды достигается добавлением агара. Он представляет собой полисахарид, получаемый из водорослей. Плавится при температуре 100°С, остывает при температуре 45-50°С. Классификация Простые: Жидкие: ПВ (пептонная вода), МПБ (мясопептонный бульон); Плотные: МПЖ (Мясо-пептонная желатин), МПА (мясопептонный агар) Сложные: Специальные: сахар. МПА, МПБ, сывороточный. МПА, кровяной МПА, асцитический МПА Обогащения, накопления: селенитовый МПБ, среды Мюллера, Кауффмана, Китт-Тароцци Элективные: Ру (так и читается ру), 1% щелочная ПВ (пептонная вода) Диференциально-диагностические: 1) для определения сахаролитических свойств (среды Гисса , Эндо, Левина) 2) для определения протеолитических свойств (свернутая сыворотка, МПЖ, кусочки мышц, белка куриного яйца) 3) для определения пептолитических свойств (МПБ, ПВ) 4) для определения гемолитических свойств (кров.МПА) 5) для определения редуцирующих свойств (среды с разными красителями) 25. Основные питательные среды. Состав, назначение. Назначение МПБ, МПА (мясопептонный бульон/агар): универсальная среда для многих видов патогенных и непатогенных бактерий. МПБ Состав: мясной настой + 1% пептон + 0,5%NaCl, > кипячение 15 мин > установление pH 7,2-7,4 > фильтрация > стерилизация при 120°С 20 мин. МПА Состав: 1л МПБ + 15-25гр нарезанного агар-агара > кипячение >pH 7,4-7,6 > фильтрация > стерилизация при 120°С 20 мин 26. Элективные питательные среды. Состав, назначение. Примеры. Назначение:Предназначены для избирательного роста определённых микроорганизмов. Позволяют направленноотбирать из исследуемого материала определённые виды бактерий. а) Среда Мюллера Назначение: для изучения чувствительности дрожжей и грибков к антимикотикам диско-диффузионным методом. Состав: Мел, стерилизованный сухим жаром или Кальция карбонат (CaCO ) сухой стерильный Бульон Хоттингера, содержащий 120 - 130 мг% аминного азота Раствор Люголя (калия йодид (KI), йод кристаллический, вода дистиллированная Натрия тиосульфат, 50-процентный Приготовление. В стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, после чего в каждый флакон наливают 90 мл бульона Хоттингера. Стерилизуют 30 мин. при температуре 121 °С (рН 7,2 - 7,4). В каждый флакон добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора натрия тиосульфата с соблюдением правил асептики, хорошо смешивают и разливают по пробиркам. Дальнейшая стерилизация не требуется. б) Селенитовая среда Назначение. Эту среду используют для определения ферментации углеводов (глюкозы) в аэробных и анаэробных условиях. Состав: Натрия гидроселенит (NaHSeO ) без примеси теллура Пептон Натрия гидрофосфат безводный Натрия дигидрофосфат безводный Лактоза Вода дистиллированная Приготовление. Среду готовят из двух основных растворов. Раствор 1. Определяют пропорцию натрия гидрофосфата и натрия дигидрофосфата с используемым образцом пептона и натрия гидроселенита для установления pH 6,9 - 7,1. С этой целью регулируют соотношение фосфатов. Подтитровка нужна всегда при изменении серии любого из входящих в среду основных ингредиентов. После установления соотношения фосфатов к раствору добавляют пептон и лактозу. Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром по 30 мин. два дня. Количество фосфатов в рецепте среды дано в расчете на безводные препараты. При отсутствии таковых заранее заготовленные навески "выветривают" 15 - 16 сут. в термостате. Раствор 2. 10-процентный раствор натрия гидроселенита готовят на стерильной дистиллированной воде перед употреблением. Перед началом работы во флакон с 50 мл раствора 1 добавляют 2 мл раствора 2, разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки с соблюдением правил асептики и закрывают плотно пробками. Дальнейшая стерилизация не требуется. Основной раствор (первый) для среды можно хранить в холодильнике 1 - 2 мес. При приготовлении среды следует использовать высококачественный пептон. в) Среда Раппопорта Состав: желчный бульон, глюкоза, индикатор Андреде (сальмонелла) 27. Дифференциально-диагностические среды. Состав, назначение. Примеры Назначение: Применяют для изучения биохимических свойств. Эти среды позволяют отличать один вид бактерий от других по характеру их ферментативной активности или культуральным проявлениям. Среда Эндо —для выделения Escherichiacoli. Обладает слабыми селективными свойствами, компоненты среды подавляют рост грамположительных бактерий. Назначение: Среда предназначена для выделения энтеробактерий в санитарной бактериологии и обнаружения эшерихий фекального происхождения, а также для выделения патогенных эшерихий. Состав: Сухой питательный агар, экстракт кормовых дрожжей, лактоза, фуксин основной, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий сульфит безводный, натрий углекислый, агар. Свойства: Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют на среде бесцветные прозрачные колонии, лактозопозитивные микробы – колонии красного цвета. Среда Левина Назначение: Среда предназначена для выделения из инфицированного материала шигелл, сальмонелл, эшерихий и других энтеробактерий. Состав: Панкреатический гидролизат кильки, лактоза, сахароза, натрий фосфорнокислый двузамещенный, эозин, метиленовый синий, натрий хлористый, агар. Свойства: Лактозонегативные микроорганизмы растут на среде в виде прозрачных бесцветных колоний, лактозопозитивные окрашены в фиолетовый цвет. Среда Плоскирева Назначение: Среда предназначена для выделения шигелл и сальмонелл из инфицированного материала. Состав: Панкреатический гидролизат кильки, натриевые соли желчных кислот, лактоза, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий лимоннокислый, натрия тиосульфат, йод металлический, натрий углекислый, нейтральный красный, бриллиантовый зеленый, агар. Свойства: Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу (шигеллы, сальмонеллы), образуют на среде бесцветные прозрачные колонии, лактозопозитивные микробы (кишечная палочка) – колонии малинового цвета. 28. Методы выделения чистых культур аэробов (механические и биологические). Колония, чистая культура Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Штамм - культура микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами. Колония представляет собой видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде Механические Рассев шпателем по Дригальскому Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На первую чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности агара. Затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в третью чашку Петри и аналогичным образом производят посев. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний (сплошной pocт) на третьей - минимальное в виде отдельно расположенных колоний. Метод истощающего штриха В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив её на 4 сектора и последовательно засеяв штрихом. Для этого материал берут петлёй и проводят ею на расстоянии 5 мм друг от друга ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие секторы. При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток. После рассева чашки переворачивают вверх дном, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри, не мешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате 1-7 суток, так как скорость роста различных микроорганизмов неодинакова. Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастают обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки. Метод прогревания Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 минут. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают, образуя колонии только спорообразующих бактерий. Метод обогащения Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов. Метод заражения лабораторных животных Этот метод используется для выделения чистой культуры из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, или в том случае, когда в исследуемом материале очень мало патогенных микроорганизмов. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных. Например, для выделения пневмококка из мокроты заражают белую мышь. Это животное весьма чувствительно к данному микробу и резистентно к другим микробам, находящихся в мокроте. В связи с этим пневмококк быстро размножается в организме мыши, а другие микробы погибают. Через 18-20 часов после заражения мышь забивают и кровь, взятую из сердца, засевают на питательную среду. Так как в крови содержится один пневмококк, то на питательной среде вырастает чистая культура. Биологические Метод Шукевича Применяется для выделения подвижных микроорганизмов. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, находящегося в пробирке. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы "вползают" на его поверхность. Из верхней части роста производят высев в конденсационную воду свежей питательной среды. Производя таким образом несколько пересевов, в конце концов получают чистую культуру подвижной бактерии. Метод ингибирования Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определённые вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. 29. Метод Дригальского, назначение, этапы: I, ΙΙ, III, IV Метод Дригальского основан на механическом разобщение на поверхности плотной питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуемого материала. I этап. 1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовление мазка, окраска по Граму). 2. Посев в чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового материала, засевают вторую и третью чашки. 3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С. II этап. 1. Макроскопическое изучение колонки по величине, форме, окраске, характеру поверхности, краев, консистенции колонии. 2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовление мазка, окраска по Граму). 3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным ога-ром. 4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С. III этап. Проверка культуры на чистоту (макроскопическим — однородный рост, микроскопическим- однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признакам клетки). Идентификация проводится по: - ферментативным свойствам. - антигенным свойствам фагочувствительности токсигенности и другим признакам IV этап - проверка культуры на чистоту, вирулентность, антигенную структуру - учет результатов, оформление заключения (по морфологическим, культуральным, БХ-признакам) 30. Выделение чистой культуры анаэробов (I, II, III, IV, V этапы) I этап — обогащение на среде Китта — Тароцци, предварительно прокипяченной в течение 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются. II этап — получение изолированных колоний на средах Китт — Тароцци обнаруживается помутнение с пузырьками газа. III этап - Выделение чистой культуры проводится по одному из следующих методов: А) по Цейсслеру — каплю материала со среды Китт — Тароцци засевают в чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же шпателем производят посев во второй и третьей чашках; Б) по Вейнбергу: каплю материала со среды Китт — Тароцци переносят в растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки Виньял — Вейона и инкубируют в термостате В) по Вильсон-Блеру – колонии в глубине питательной среды черного цвета IV этап - обращают внимание на особенности роста чистой культуры возбудителей на соответствующих средах, проверяют ее на чистоту и проводят идентификацию. Идентифицируют выделенные чистые культуры анаэробных микроорганизмов подобно аэробным по морфологическим, культуральным, биохимическим и биологическим признакам. Обязательно используют определение токсигенних свойств возбудителей в биологической пробе и реакции нейтрализации на лабораторных животных. Внекоторых случаях определяют антигенные свойства микроорганизмов. V этап – учет результатов 31. Вирусологический метод исследования: назначение, принцип метода. Методы культивирования и индикации вирусов. Назначение: для изучения биологии вирусов и их идентификации Принцип:Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.). Методы молекулярной биологии с их помощью удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков Метод культуры ткани и клетокиспользуют в диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Вторичные культуры – пересеянные первичные культуры. При дальнейшем пассировании формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. 32. Методы культивирования микоплазм, риккетсий, хламидий и вирусов. Культивирование микоплазм Микоплазмы культивируются на питательных средах с добавлением сыворотки и углеводов. Они растут только в изотонических или гипертонических средах. На плотных питательных средах в течение нескольких суток образуются очень мелкие колонии. Микоплазмы можно выращивать также на курином эмбрионе или культуре клеток. Культивирование риккетсий и хламидий Риккетсии и хламидии — облигатные внутриклеточные паразиты. Для их культивирования используют культуры клеток, куриный эмбрион и заражение животных. Методы культивирования вирусов Вирусы — строгие внутриклеточные паразиты, поэтому их можно выращивать только в живых клетках. Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы и культуры клеток. Лабораторные животные: белые мыши (для вирусов гриппа, Коксаки), кролики (вирус бешенства). Индикацию, то есть обнаружение вируса, проводят на основании развития типичных признаков заболевания и изменений органов животного. Куриные эмбрионы 5-19-дневной инкубации пригодны для культивирования большинства вирусов: Преимущества метода: стерильность и отсутствие скрытых вирусных инфекций, возможность получения вирусов в больших количествах, простота техники работы. В зависимости от цели и от вида вируса материал вносят на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, желточный мешок, амниотическую полость. Индикацию вирусов проводят по характеру колоний вируса на хорионаллантоисной оболочке. В аллантоисной жидкости вирусы обнаруживают по реакции гемагглютинации. Эта реакция основана на способности вируса гриппа и некоторых других вирусов агглютинировать (склеивать) куриные эритроциты. 33. Современные принципы классификации и номенклатура вирусов Классифицируют вирусы по: • тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (одна или две), особенности воспроизводства вирусного генома; • размер и морфология вирионов; • наличие суперкапсида; • чувствительность к эфиру и дезоксихолату; • место размножения в клетке; • антигенные свойства Различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Среди РНК- содержащих вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию. Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом. Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), нитевидной (филовирусы), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы. Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид. Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный Мбелок. Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спиральный, икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии. Икосаэдрический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа). Классификация вирусов по Балтимору (I) Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК и не имеющие РНК-стадии (например, герпесвирусы, поксвирусы, паповавирусы,мимивирус). (II) Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу ДНК (например, парвовирусы). В этом случае ДНК всегда положительной полярности. (III) Вирусы, содержащие двуцепочечную РНК (например, ротавирусы). (IV) Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности (например, пикорнавирусы, флавивирусы). (V) Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК негативной или двойной полярности (например, ортомиксовирусы, филовирусы). (VI) Вирусы, содержащие одноцепочечную положительную молекулу РНК и имеющие в своем жизненном цикле стадию синтеза ДНК на матрице РНК, ретровирусы (например, ВИЧ). (VII) Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК и имеющие в своём жизненном цикле стадию синтеза ДНК на матрице РНК, ретроидные вирусы (например, вирус гепатита B). 34. Понятие о вирионе и вирусе, определение. Морфология и структура вирионов Вирусы – неклеточные формы жизни, имеющие геном, окруженный белковой оболочкой, являющиеся облигатными паразитами. Известны вирусы бактерий, грибов, растений, животных. Внеклеточная форма - вирион - включает в себя все составные элементы (капсид, нуклеиновую кислоту, структурные белки, ферменты и др.). Внутриклеточная форма – вирус- может быть представлена лишь одной молекулой нуклеиновой кислоты По морфологии выделяют вирусы палочковидные (например, возбудитель лихорадки Эбола), пуле-видные (вирус бешенства), сферические (герпесвирусы), овальные (вирус оспы), а также бактериофаги, имеющие сложную форму. Общее строениезрелая вирусная частица (вирион) состоит из нуклеиновой кислоты, белков и липидов, либо в его состав входят только нуклеиновые кислоты и белки Виды вирионов. Структура и состав вирионов Различают простые и сложные вирионы. Простые вирионы состоят из нуклеиновой кислоты, окруженной снаружи белковой оболочкой, которую называют капсидом, сложные — имеют дополнительную внешнюю оболочку (суперкапсид). Структура и химический состав простых вирионов. В состав простых вирусов (вирус табачной мозаики), входят только капсидные белки, но у некоторых из них содержатся также геномные, или терминальные белки. Капсидные белки простоорганизованных вирионов обычно состоят из 1-3 вирусоспецифических белков (полипептидных цепей). По характеру расположения капсомеров вирусы делят на три группы: с кубическим (большинство патогенных для человека вирусов), спиральным (вирус растений) и смешанным типом симметрии (редко). Структура и химический состав сложных вирионов. Сложно устроенные вирусы в капсиде имеют много разновидностей белков. Кроме капсидных и геномных белков могут также содержать ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусного генома. В суперкапсиде сложных вирусов преобладают гликопротеиды. Они образуют поверхностные «шипы». Суперкапсидные вирусные гликопротеиды выполняют две основные функции: 1) распознают специфические клеточные рецепторы и взаимодействуют с ними и 2) обусловливают проникновение вируса в клетки, инициируя слияние его оболочек с клеточными мембранами. Углеводы гликопротеидов обеспечивают сохранение конформации белка и его устойчивость к протеазам. 35. Репродукция вирусов. Стадии взаимодействия вируса с клеткой хозяина. Особенности репродукции ДНК- и РНК- вирусов Репродукция состоит из таких стадий: адсорбция вируса на клетке; проникновение вируса в клетку; «раздевание» вируса; биосинтез вирусных компонентов в клетке; формирование вирусов;выход вирусов из клетки. Адсорбция. Это прикрепление вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на рецепторах. Проникновение в клетку. Существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе происходит впячивание клеточной мембраны и образование вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. «Раздевание». Удаление защитных вирусных оболочек и освобождение внутреннего компонента вируса. Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса. Биосинтез компонентов вируса. Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства. Формирование (сборка) вирусов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически «узнавать» друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются. Выход вирусов из клетки. Различают два основных типа выхода вирусного потомства из клетки. Первый тип — взрывной —одновременный выход большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Характерен для вирусов без суперкапсидной оболочки. Второй тип — почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5—6 ч (вирусы гриппа, натуральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы и др.). Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репродукции. Особенности репродукции ДНК- и РНК- вирусов Репликация ДНК-вируса У ДНК-содержащих вирусов репликация происходит при участии клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. У однонитевых ДНК-содержащих вирусов сначала образуется комплементарная нить (репликативная форма), которая служит матрицей для дочерних молекул ДНК. Трансляция ДНК-вируса У ДНК вирусов при участии ДНКзависимой РНК-полимеразы синтезируются и-РНК, которые поступают на рибосомы клетки, где и синтезируются вирусные белки. У двунитевых ДНК-содержащих вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина это собственный геномный белок. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки, используют содержащуюся там клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу. РепликацияРНК-вируса. Репликация вирусных РНК осуществляется через репликативную форму РНК. Эта форма синтезируется благодаря РНК-зависимой РНК-полимеразе - это геномный белок, который есть у всех РНК-содержащих вирусов. Репликативная форма РНК минус-нитевых вирусов служит не только матрицей для синтеза дочерних молекул вирусной РНК (минус нитей), но и выполняет функции и-РНК, т.е. идет на рибосомы и обеспечивает синтез вирусных белков (трансляция). У плюс-нитевых РНК-содержащих вирусов функцию трансляции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется через репликативную форму (минус-нить) при участии вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз. У реовирусов имеется уникальный механизм транскрипции. Он обеспечивается специфическим вирусным ферментом - ревертазой (обратной транскриптазой), и называется обратной транскрипцией. Суть ее состоит в том, что в начале на матрице вирусной РНК при участии обратной транскрипции образуется транскрипт, представляющий собой одну нить ДНК. На нем с помощью клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется вторая нить и формируется двунитевой ДНК-транскрипт. С него обычным путем через образование и-РНК происходит реализация информации вирусного генома. 36. Типы взаимодействия вирусов с клеткой: продуктивный, абортивный, интегративный, примеры Продуктивный тип— завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитолитическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма). Абортивный тип— не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов. (вирус гепатита D) Интегративный тип— характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация). Характерен для для вируса гепатита В, ВИЧ, умеренных ДНК-содержащих бактериофагов, онкогенных вирусов, 37. Классификация клеточных культур, применяемых в вирусологии, способы получения. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые),полуперевиваемые и перевиваемые. Приготовление первичной культуры клеток складывается из таких этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови. Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование invitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей. Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться invitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др. К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых. 38. Бактериофаги. Морфология и структурные особенности. Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой Бактериофаги – вирусы бактерий. Фаги, как и просто организованные вирусы человека, состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белковой оболочки - капсида. В зависимости от формы, структурной организации и типа нуклеиновой кислоты фаги подразделяют на несколько морфологических типов. К I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, взаимодействующие с мужскими особями бактерий. Геном фагов представлен однонитевой ДНК, заключенной в спиральный капсид. II тип включает мелкие РНК-содержащие и однонитевые ДНК-содержащие фаги, геном которых находится внутри икосаэдрического капсида (головки) с аналогом отростка. К III типу относятся икосаэдрические фаги с коротким отростком, содержащие двунитевую ДНК. IV и V типы - сложные по морфологии ДНК-содержащие фаги, имеющие форму сперматозоида: икосаэдрический капсид головки соединен с длинным хвостовым отростком. V тип фагов отличается от VI типа тем, что чехол их отростков способен к сокращению. Классификация бактериофагов По специфичности Полифаги – фаги, лизирующие близкородственные бактерии. Монофаги – фаги, способные взаимодействовать с бактериями одного вида (видоспецифические). Типовые фаги – фаги, вызывающие лизис отдельных вариантов определенного вида бактерий. По назначению 1. Лечебно-профилактические применяют местно в виде орошения, полоскания, примочек путем аппликации на раневую или ожоговую поверхность и парентерально, фаги можно вводить в полости: брюшную, плевральную, суставную и в полостные органы. Также вводят энтерально, т.е. через рот и ректально. Защитное свойство фага длиться 5-7 суток. 2. Диагностические применяют в диагностической практике с целью идентификации чистой культуры микроба-возбудителя, выделенного от больного до вида, до фаговара, а также для косвенного определения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды или в выделениях больных при постановке реакции нарастания титра фага (РНТФ). Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой. Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки. Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина. Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты. Деление клетки Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь. Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогения). Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели: Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка. Нуклеиновая кислота фага реплицируется, и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим. Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима |