Вакцина. Оценка состояния иммунной системы
 Скачать 0.55 Mb.
|
|
Оценка состояния иммунной системы Иммунным статусом (иммунореактивностью) называют структурное и функциональное состояние иммунной системы индивидуума, определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей. Сила и форма иммунного ответа на один и тот же объект у разных людей может варьировать в широких пределах, а у одного и того же человека - в различные периоды жизни и время суток — в зависимости от биоритмов, обусловленных, например, колебаниями гормонального фона.В связи с этим при оценке иммунного статуса возможен большой размах колебаний иммунологических параметров даже в условиях физиологической нормы, с возможным коэффициентом вариации до 30%. Показания к оценке иммунного статуса: трансплантации органов и тканей; выявление различных видов иммунопатологии; хронически текущие инфекционные и ряд соматических заболеваний; злокачественные новообразования; проведение цитостатической, иммунодепрессивной и иммуномодулирующей терапии; подготовка операциям, к ЭКО и др. Оценка иммунного статуса базируется на комплексе показателей: данных иммунограммы, клинического обследования (сбор анамнеза, врачебный осмотр, рентгенологические, аппаратные обследования, клинико- лабораторные методы (анализ крови, анализ мочи и т. п.). Иммунограмма — это совокупность лабораторных методов иммунологического исследования крови или других биологических жидкостей, отражающих состояние различных звеньев иммунной системы человека. Одни и те же иммунологические тесты, входящие в структуру иммунограммы, можно группировать на основе различных принципов. Наиболее распространенными являются подразделения на тесты I уровня (ориентировочные) и II уровня (функциональные). Тесты 1 уровня могут быть выполнены в любой клинической им- мунологической лаборатории первичного звена здравоохранения и позволяют выявить грубые нарушения со стороны иммунной системы. К показателям иммунограммы I уровня относят определение: 1) количества популяций и субпопуляций лимфоцитов: общее количество (абсолютное в г/л и относительное в %) Т-лимфоцитов (СD3+), Th (СD4+), ЦТЛ (СD8+), NK (СD16+), В-лимфоциты (СD19+/СD20+); 2) концентрации сывороточных иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM); 3) фагоцитарной активности лейкоцитов; 4) сывороточного титра комплемента; 5) дополнительно - уровень ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов) при оценке аутоиммунных, лимфопролиферативных, хронических инфекционных заболеваний. Информативным показателем является иммунорегуляторный индекс (ИРИ) - сопоставление количества субпопуляций Т-лимфоцитов — СD4+Тh и СD8+ в периферической крови (в нормесоставляет 1,6-2,2). Определение содержания популяций и субпопуляций клеток иммунной системы, маркеров активации лимфоцитов и ряда других показателей при постановке иммунограммы основано на взаимодействии меченных флюоресцентной меткой моноклональных антител с соответствующими CD- антигенами клеток. Для детекции образующихся иммунных комплексов используют 2 основных методических приема: 1) люминесцентную микроскопию (непрямой МФА); 2) проточную цитофлюориметрию (the flowcytofluorimetry). Наиболее точным, автоматизированным методом является проточная цитофлюориметрия. Метод основан на пропускании через суспензию клеток иммунной системы лазерного излучения и регистрации в проточном цитофлюориметере (рис.23): 1) связывания клеток иммунной системы смеченными флюорохромами моноклональными антителами к поверхностным маркерам данной популяции или субпопуляции; 2) физических свойств этих клеток (диаметра ядра, размера и гранулярности клетки) Рис.23. Проточный цитофлюориметр Фотодетекторы преобразуют фотоны света в электронные сигналы, которые анализируются компьютером. Клетки выявляются на плотах - гистограммах, отображающих клеточные скопления с одинаковыми параметрами рассеивания света и спектра флюоресценции (рис.24). В зависимости от типа флюорохрома, который использовался при конъюгировании с моноклональными антителами, флюоресценция может иметь разный спектр, например, зеленый, жёлто-оранжевый. Каждая клетка может быть помечена одновременно, по крайней мере, четырьмя маркерами. Рис.24. Гистограммы распределения Т-клеток и их субпопуляций, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови с использованием комбинации моноклональных антител CD3/CD4/CD8/CD45 Тесты II уровня позволяют провести более тщательный анализ иммунного статуса и уточнить характер дефекта, выявленного на предыдущем этапе с помощью тестов 1 уровня. Они направлены на оценку функциональной активности лимфоцитов: выявление пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов иих адаптационного резерва проводят в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) под действием стимуляторов — митогенов или специфических антигенов с последующим подсчетом количества по- лучаемых бластных форм. регистрация CD-маркеров активации лимфоцитов (СD69, СD25, СD71, HLA-DR, СD23, СD95); определение уровней цитокинов, секретируемых клетками иммунной системы в ИФА, а также проточной лазерной цитофлюориметрии; определение компонентов комплемента. При интерпретации результатов иммунограммы следует иметь в виду ряд важных моментов: 1) решающее значение в постановке диагноза имеют клинические данные, иммунограмма несет вспомогательное диагностическое и прогностическое значение; 2) необходимо сопоставлять абсолютные и относительные (процентные) значения иммунологических показателей, учитывать данные общего анализа крови и предполагаемую стадию иммунного ответа; 3) первоочередное значение при оценке иммунограммы имеет соотношение комплекса показателей иммунограммы; 4) однотипные изменения показателей иммунограммы могут наблюдаться при принципиально разных патологических процессах; 5) необходим учет индивидуальных особенностей пациента (возраста, пола и др.). Методы иммуноанализа Преимуществами методов иммуноанализа по сравнению с другими группами серологических реакций являются: высокие специфичность и чувствительность; стандартность; автоматизация процесса; возможность регистрации низкомолекулярных белков. Область применения: иммунодиагностика инфекционных заболеваний бактериальной, вирусной, паразитарной этиологии; иммунодиагностика неинфекционной патологии (аллергические, аутоиммунные заболевания, иммунодефициты, опухоли и др.); оценка иммунного статуса, оценка напряженности противоинфекционного иммунитета иммуногенетические исследования. Несмотря на очевидные преимущества этих методов и обширную область использования в практике, они требуют наличия дорогостоящего оборудования и диагностических тест-систем. ИФА, РИА и МФА принципиально отличаются между собой системой меток, ковалентно соединяемых с одним из компонентов-участников, и способами регистрации результатов. Так, в ИФА используется ферментная метка (пероксидаза хрена) и хромогенный субстрат (ТМБ - 3,5- тетраметилбензидин), изменяющий цвет при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазы, что определяет использование приборов, работающих на принципе спектрофотометрии, для учета результатов по регистрации оптической плотности пробы; для РИА - радиоактивная метка (I 125 ) с регистрацией радиоактивности комплекса с помощью гамма-счетчика, а для МФА — флюорохромы и металлы лантаноидной группы, способные флюоресцировать при облучении сине-фиолетовым спектром (ФИТЦ — флюоресцеина изотиоционат натрия), с регистрацией в люминесцентном микроскопе. Безусловный лидер этого направления — ИФА, располагающий большим разнообразием коммерческих тест-систем и отличающийся сравнительной (в группе реакций иммуноанализа) простотой регистрации результатов. ИФА Существуют множество вариантов постановки ИФА, которые подразделяются на: гомогенные, когда оба компонента (антиген и антитело) находятся в жидкой фазе, отличающиеся простотой и быстротой постановки, но в то же время ориентированные только на качественный анализ и определение низкомолекулярных белков; гетерогенные, или твердофазные (ELISA - Enzyme-Linked immunosorbent Assay), в которых один из компонентов фиксируется на твердой фазе, наиболее часто используемые в лабораторной практике. В качестве «твердой фазы» используют полистироловые или поливиниловые планшеты с плоским дном, шарики, пленки или пробирки, обладающие высокой сорбционной способностью, в лунках которых адсорбируют антигены (или антитела). При последовательном добавлении к связавшимся с полистиролом антигенам или антителам других компонентов реакции, образуется иммунный комплекс, который выявляется с использованием ферментативной реакции. Основные варианты твердофазного ИФА : прямой ИФА, непрямой ИФА, «сандвичи-ИФА». Непрямой ИФА (рис. 20) – предназначен преимущественно для выявления искомых антител в сыворотке крови обследуемых. Широко используется для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний (аллергических - определение общего IgE и специфического IgE к различным аллергенам, аутоиммунных заболеваний - определение антител к инсулину, ДНК, аутоантигенами др., онкологических), оценки иммунного статуса. Компоненты: 1) антиген – стандартный препарат, который в производственных условиях сорбирован на планшете; 2) искомые антитела – содержатся в сыворотке крови иди других образцах от обследуемых; 3) неспецифический конъюгат – антитела любого вида животных против Fc-фрагмента человеческих антител, меченые ферментной меткой; 4) субстратно-индикаторная смесь, состоящая соответственно из перекиси водорода в малой концентрации и ТМБ (3,5-тетраметилбензидин) - хромогенного индикатора, изменяющего цвет при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазной метки. субстратно-индикаторная смесь неспецифический конъюгат искомые антитела известный антиген планшет Рис. 20. Схема непрямого ИФА Техника постановки Последовательность внесения в лунки планшета компонентов при постановке различных вариантов ИФА однотипна и включает этап сорбции «базового» компонента на твердой фазе, а затем этапы «контакта» последовательно вносимых компонентов, после каждого из которых выполняют промывку планшета для удаления не связавшихся компонентов реакции. Учет ИФА проводят по изменению цвета реакционной смеси в лунках только с использованием приборов (мультискана или ридера), измеряющих оптическую плотность в каждой из лунок. Одной из модификаций ИФА и хорошей альтернативой является Dot– ИФА. Это метод точечного иммуноферментного анализа (dot-Elisa-точечный твердофазный иммуноферментный анализ), позволяющий снизить стоимость диагностических процедур и не требующий дорогого оборудования. В dot- ИФА минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку (мембрану) в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Субстраты, дающие нерастворимые продукты ферментативной реакции, на белом нитроцеллюлозном фильтре в присутствии индикатора образуют легко различимые цветные пятна, в результате чего отпадает нужда в дорогих фотометрах. Фильтры с результатами анализа можно хранить в темноте в течение многих лет. Простота постановки позволяют использовать ее как экспресс-метод, в полевых или домашних условиях. Метод dot-ИФА позволяет определять как антигены живых или разрушенных вирусов и бактерий, так и антитела. |