Геном. Структурная_организация_геномов_вирусов,_прокариот_и_эукариот (1. Организация генома вирусов Организация генома прокариот
 Скачать 43.74 Kb.
|
|
Содержание Введение Организация генома вирусов Организация генома прокариот Геномы эукариот на примере растительной клетки Литература Введение Организация генома прокариот Геном прокариот может состоять из одной или нескольких крупных молекул ДНК, называемых хромосомами, и небольших молекул ДНК – плазмид. В хромосомах представлены практически все гены, необходимые для жизнедеятельности бактерии. Плазмиды же несут гены, необязательные для бактерии, без них клетка может обойтись, хотя в некоторых условиях они способствуют ее выживанию. Гены клеток эукариот распределены по хромосомам, образуя ХРОМОСОМНЫЙ уровень организации наследственного материала. Этот уровень организации служит необходимым условием сцепления генов и перераспределения генов родителей у потомков при половом размножении (кроссинговер). Вся совокупность генов организма в функциональном отношении ведет себя как целое и образует единую систему, называемую ГЕНОМОМ. 1. Организация генома вирусов Геном вирусов, заключенный внутри вирионов, может быть представлен одноцепочечными или двухцепочечными ДНК или РНК. Гены вирусов могут быть заключены в одной хромосоме или разделены на несколько блоков (хромосом), которые все вместе и составляют геном таких вирусов. Геном РНК-содержащих вирусов представлен только линейными молекулами РНК. Все известные ДНК- содержащие вирусы позвоночных имеют геном, заключенный в одной хромосоме, линейной или кольцевой, одно- или двухцепочечной. У некоторых вирусов, например, у вируса гепатита В, геном представлен кольцевой ковалентно замкнутой молекулой двухцепочечной ДНК, в обеих цепях которой в разных местах обнаружены одноцепочечные участки. У нескольких родов, например, адено-ассоциированных вирусов, комплементарные цепи ДНК находятся в различных вирусных частицах. Геном вирусов включает: Структурные гены. Занимают примерно 95 % вирусной хромосомы. Белки вирусов можно разделить на несколько групп: структурные, ферменты, регуляторы. Регуляторные последовательности, которые не кодируют белки: промоторы, операторы и терминаторы. Прочие некодирующие участки (сайты), в том числе: участок attP, обеспечивающий интеграцию вирусной хромосомы в хромосому клетки-хозяина; участки cos — липкие концевые участки линейных вирусных хромосом, обеспечивающие замыкание линейной хромосомы в кольцевую форму. Гены, кодирующие рРНК и тРНК, в геноме вирусов обычно отсутствуют (за исключением, генома о фага Т 4, который имеет гены, кодирующие тРНК). Геном вирусов отличается высокой плотностью упаковки информации. Например, у фага φ Х 174 в пределах одного гена может располагаться еще один ген (на рисунке кольцевая ДНК представлена в линейной форме). В частности, ген В находится в пределах гена А, а ген Е — в пределах гена D: У мелкого РНК-содержащего фага f2 ген регуляторного белка, блокирующего лизис (созревание вирионов и разрушение клетки), перекрывается с двумя другими генами, удаленными друг от друга: Экспрессия (транскрипция и трансляция) вирусных генов происходит в том случае, если геном вируса представлен двунитевой ДНК (у РНК-содержащих вирусов необходим перевод информации в ДНК). Из-за полярности ДНК транскрипция идет только в одном направлении, то есть ген имеет начало и конец. Тогда "правые" гены не будут транскрибироваться РНК-полимеразой, движущейся влево, и наоборот. При этом один и тот же ген может транскрибироваться с разных промоторов; в этом случае экспрессия генов контролируется разными механизмами. Особенности вирусов эукариот У вирусов эукариот обнаружены следующие особенности: Перекрывание генов (обезьяний вирус SV 40, вирус гриппа). 2. Интрон-экзонная структура генов. 3. Модификация белков после синтеза полипротеинов: весь геном транскрибируется в виде одной молекулы иРНК, которая служит матрицей для синтеза полипротеина — одного гигантского инертного белка, и лишь затем происходит расщепление полипротеина на белки, выполняющие определенные функции. ДНК-содержащие вирусы К ДНК-содержащим вирусам относятся многие вирусы бактерий — бактериофаги (или просто фаги). Некоторые мелкие фаги (например, фаг М 13) при репродукции не разрушают клетку. Репродукция крупных фагов (например, фага Т-4) приводит к гибели клетки. Фаг Т-4 — это один из наиболее сложно организованных вирусов. Белковый капсид включает не менее 130 белков, образующих головку, воротничок, сократимый хвост, базальную пластинку и хвостовые нити. Такое строение капсида позволяет впрыскивать ДНК в бактериальную клетку через толстую оболочку, поэтому подобные вирусы образно называют "живыми шприцами". Т-фаги могут существовать в виде профага длительное время. К ДНК-содержащим вирусам относятся возбудители многих заболеваний человека и животных: вирусы оспы, герпеса, гепатита В, аденовирусы млекопитающих и человека (вызывают желудочно-кишечные заболевания, ОРВИ, конъюнктивиты), вирусы бородавок человека. К ДНК-содержащим вирусам относятся и некоторые вирусы растений (вирус золотистой мозаики фасоли, вирус мозаики цветной капусты). Некоторые вирусы используются в генной инженерии для переноса генов от одних организмов к другим, например, обезьяний вирус SV 40. Вирионы ДНК-содержащих вирусов содержат ДНК. Объемом ДНК определяется количество белков в вирионе: один полипептид кодируется отрезком ДНК длиной примерно 1 тысяча нуклеотидов (нуклеотидных пар). После проникновения в клетку вирусная ДНК становится матрицей для синтеза ДНК и РНК. Примеры организации генома ДНК-содержащих вирусов 1. Кольцевая двухцепочечная ДНК длиной около 5 тпн. Обезьяний вирус SV 40. Мелкий эукариотический вирус. Вирионы в виде икосаэдра. Капсид белковый. Используется в генной инженерии как вектор переноса генов. Кодирует 5 белков. Вирусы бородавок человека. 2. Кольцевая одноцепочечная ДНК длиной около 5 тн; может быть как кодирующей, так и антикодирующей. Мелкие бактериофаги типа М 13. Не разрушают клетку. Капсид включает 8 белков Вирус золотистой мозаики фасоли. 3. Линейная двухцепочечная ДНК длиной 30-150 тпн. Бактериофаги типа Т 4. Вирионы крупные. Белковый капсид из 130 белков включает: головку, хвостовой отдел и хвостовые нити. Эти вирусы могут существовать в виде профага длительное время. Аденовирусы млекопитающих и человека. Вирионы средних размеров в виде икосаэдра. Капсиды белковые. Вызывают ОРВИ, конъюнктивиты, желудочно-кишечные заболевания, иногда обладают онкогенными свойствами. Вирусы оспы, герпеса и им подобные. Вирионы крупные. Имеется липопротеиновая оболочка. 4. Линейная одноцепочечная ДНК длиной около 5 тн; ДНК может быть как кодирующей, так и антикодирующей. У человека известны как спутники аденовирусов. 5. Двухцепочечная ДНК, замкнутая в кольцо из перекрывающихся сегментов. Длина ДНК — 3-8 тн. Вирус гепатита В. Вирион сферический, средних размеров. Имеется дополнительная оболочка из вирусных и клеточных белков. Кодирует 5 белков. Вирус мозаики цветной капусты. РНК-содержащие вирусы К РНК-содержащим вирусам относятся многие вирусы растений, возбудители заболеваний человека и животных: вирус полиомиелита, вирусы гриппа А, В и С, вирусы паротита (свинки), кори, чумы плотоядных животных (чумки), бешенства, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В отдельную группу выделяются арбовирусы, которые переносятся членистоногими (клещами, москитами), например, вирусы клещевого энцефалита, желтой лихорадки. Многие РНК-содержащие вирусы вызывают ОРВИ (например, коронавирусы), желудочно-кишечные заболевания (реовирусы птиц, млекопитающих и человека). Некоторые РНК-содержащие вирусы используются в биотехнологии, например, вирусы полиэдроза насекомых. Вирионы РНК-содержащих вирусов содержат РНК. После проникновения в клетку вирусная РНК становится матрицей для синтеза ДНК и РНК. Примеры организации генома РНК-содержащих вирусов 1. Линейная одноцепочечная мРНК (плюс-цепь) длиной около 4 тн; в виде единой молекулы или в виде нескольких разных молекул. Плюс-цепь сразу же может использоваться для трансляции. Вегетативно-репродуктивная фаза этих вирусов протекает в цитоплазме. В плюс-цепи закодирована РНК-репликаза (РНК-зависимая РНК-полимераза). Представители: Вирус табачной мозаики (ВТМ) — сегментированная РНК. Вирион нитевидный (18х 300 нм). ВТМ открыт Д.И. Ивановским в 1982 г. Вирус полиомиелита — несегментированная РНК. Вирионы мелкие, в виде икосаэдра. Капсид белковый. Вирус бешенства. Нитевидный вирион. Имеется дополнительная липопротеиновая оболочка. Арбовирусы (переносятся членистоногими: клещами, москитами) — вирусы клещевого энцефалита, желтой лихорадки. Морфология и размеры вирионов разнообразны, например, вирус энцефалита содержит 9 белков. Имеется дополнительная липопротеиновая оболочка... Мелкие бактериофаги (с несегментированной РНК). 2. Линейная одноцепочечная кРНК (минус-цепь, порядок нуклеотидов комплементарен по отношению к мРНК). Минус-цепь не может служить для трансляции и используется как матрица для синтеза плюс-цепи. Плюс-цепь служит для трансляции вирусных белков и используется как матрица для синтеза вирусной кРНК. Вегетативно-репродуктивная фаза этих вирусов также протекает в цитоплазме. Вирусы гриппа А, В, С. Вирус гриппа А содержит минус-цепь РНК, состоящую из 8 фрагментов. Фрагменты РНК связаны с вирусными белками и образуют спиральный нуклеокапсид. Поверх нуклеокапсида располагается гликолипопротеиновый суперкапсид. В составе вириона 10 белков. В состав суперкапсида входит два белка, определяющих антигенные свойства вируса: гемагглютинин и нейраминидаза. Кроме того, в состав вириона входит уже готовая РНК-репликаза, обеспечивающая синтез плюс-цепи на матрице минус-цепи. Вирусы паротита (свинки), кори, чумы плотоядных животных (чумки). Сферический вирион средних размеров. Имеется дополнительная липопротеиновая оболочка. 3. Линейная двухцепочечная РНК Мелкие бактериофаги. Вирионы мелкие, сферические или в виде икосаэдра. Капсид белковый. Вирусы полиэдроза насекомых. Вирионы мелкие, сферические или в виде икосаэдра. Капсид белковый. Используются в биотехнологии (для синтеза интерферона). Реовирусы птиц, млекопитающих и человека. Вирионы мелкие, сферические или в виде икосаэдра. Капсид белковый. Вызывают ОРВИ, желудочно-кишечные заболевания. РНК фрагментированная (10...11 фрагментов), кодирует 11 белков. 4. Две линейные одноцепочечные одинаковые молекулы мРНК длиной около 10 тн Ретровирусы. Способны интегрироваться в ДНК. В состав вирионов входит фермент обратная транскриптаза (ревертаза). Имеется дополнительная липопротеиновая оболочка. Многие ретровирусы вызывают онкологические заболевания: лейкозы, саркомы, опухоли молочных желез. К ретровирусам относится и вирус иммунодефицита человека, вызывающий СПИД. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Содержит одну плюс-цепь РНК, кодирует 13 белков. Сферический вирион. Имеется дополнительная липопротеиновая оболочка, включающая фрагменты мембран человека. Избирательно поражает Т-лимфоциты. Организация генома прокариот 2. Организация генома прокариот Прокариоты характеризуются отсутствием клеточного ядра, отделенного мембраной от цитоплазмы. Генетический аппарат представлен одной или несколькими кольцевыми молекулами ДНК. Однако сейчас описаны виды с линейными молекулами ДНК, а также виды у которых кольцевая молекула сочетается с линейной. Среди прокариот самый маленький размер генома у Mycoplasma genitalium (580 тысяч п.н.), самый большой — у Myxococcus Xanthus (9,5 млн. п.н.). У E.coli размер генома составляет 4,6 млн. п.н. Всего в настоящее время просеквенировано 50 прокариотических геномов (табл. 1). Таблица 1 Размер генома и количество генов у некоторых прокариот Вид Размер генома (мб) Количество генов Археи Archaeoglobus fulgidis 2,17 2493 Methanococcus jannaschii 1,66 1813 Thermoplasma acidophilum 1,56 1509 Эубактерии Escherichia coli 4,64 4397 Bacillus subtilis 4,21 4212 Haemophilus influenza 1,83 1791 Aquifex aeolicus 1,55 1552 Mycoplasma pneumoniae 0,82 710 Mycoplasma genitalium 0,58 503 Ранее считалось, что бактериальный геном организован в виде одноцепочечной кольцевой молекулы ДНК. Однако в настоящее время у ряда бактерий обнаружены геномные ДНК в виде линейных молекул. Например, Borrelia burgdorferi — возбудитель болезни Лайма у человека и некоторые виды Streptomyces имеют геномы в виде линейной ДНК. Практически все бактерии имеют плазмиды, несущие несущественные гены. Однако Borrelia burgdorferi содержит приблизительно 17 плазмид, имеющих, по крайней мере, 430 генов и некоторые из них существенные, например гены для биосинтеза пуринов и мембранных белков. При расшифровке генома Vibrio cholera обнаружили наличие двух циклических хромосом. Хромосома 1 (2,96 мб) содержит 2770 открытых рамок считывания и хромосома 2 (1,07 мб) содержит 1115 открытых рамок считывания, некоторые из которых являются существенными генами, например, генами рибосомных белков. Хромосома 2, вероятно, образовалась из плазмиды, захваченной предшественником данного вида. Плотность генов в хромосомах бактерий очень высока: в среднем около 1 гена на тысячу пар оснований. E. coli имеет большой геном — 4,6 мегабаз с 4288 протеин-кодирующими генами. Так близко расположенные гены обуславливают наличие очень высокой пропорции ДНК, кодирующей белки (около 85-90%). У бактерий средний размер ДНК-последовательностей между генами составляет 110-125 п.н. Типично, что менее 1% бактериальной ДНК является некодирующей, и она обычно представлена в форме транспозонов. Порядок расположения генов на бактериальной хромосоме не совсем случаен. Гены, вовлеченные в определенную функцию, часто располагаются один за другим, организованы в оперон и транскрибируются совместно на одну мРНК. Анализ полностью секвенированых геномов бактерий выявил 16 консерватиных кластеров, содержащих 2 и более генов (гены рРНК, субъединицы АТФ-синтетазы, РНК-полимеразы и др.). Для бактериальных геномов характерны опероны. У E. сoli 27% предсказанных транскрипционных единиц являются оперонами. Имеют редкие случаи перекрывания генов, когда один ген находится внутри другого на той же нити ДНК. В организме Aquifex aeolicus большая часть генов является полицистронными транскрипционными единицами, которые можно было бы назвать оперонами. Однако, в отличие от классического оперона, содержащего гены одного биохимического пути, у Aquifex aeolicus один оперон содержит 6 генов. Два для рекомбинации ДНК, один для синтеза липидов, один для синтеза нуклеиновых кислот, один для синтеза белков, один для обеспечения подвижности клеток. В генах архебактерий и бактерий обнаружены интроны, которые ранее считались типичными для эукариот. У прокариот обнаружены также и интеины — участки, кодирующие самосплайсирующиеся полипептидные цепи (ранее они были обнаружены и дрожжей). Эти последовательности обеспечивают пострансляционное вырезание внутреннего пептида с последующим лигированием концевых пептидов. Такой сплайсинг происходит автокаталитически. В настоящее время выявлено несколько десятков интеинов. Большинство этих генов связаны с нуклеиновым обменом (гены ДНК-полимеразы, ДНК-геликазы и др.). Паралогичные и ортологичные гены. Гомологичные гены в геномах различных организмов называют ортологами, в отличие от паралогов — гомологичных генов внутри одного генома. Паралоги возникают путем внутригеномных дупликаций. Паралоги могут эволюционировать с приобретением новой функции. Ортологи происходят от одного гена в общем предковом организме; они сохраняют одну и ту же функцию в процессе эволюции. Паралоги составляют значительную часть в геномах бактерий — до 50% генов. Ортологи являются эволюционно консервативными. К ним относятся "гены домашнего хозяйства" и гены шаперонов, участвующих в сворачивании других белков и объединении макромолекулярных комплексов. Эти гены отвечают за стабильность основных физиологических процессов. Микоплазма гениталиум была использована как модель для изучения минимального набора генов. Геном данного паразита кодирует 468 белковых молекул. 240 генов из них являются ортологами. Были найдены еще 16 существенных гена. Всего в минимальный набор было включено 256 генов. Это гены компонентов системы трансляции, транскрипции, репликации, репарации, путей синтеза нуклеотидов, путей анаэробного метаболизма (в основном гликолиза), группа белков с шаперон-подобными функциями. Значительное сокращение генетической информации связано с паразитическим образом жизни микоплазмы. В ее геноме отсутствуют многие гены биосинтеза аминокислот, имеется очень мало генов для синтеза витаминов, предшественников нуклеиновых и жирных кислот. Все эти вещества микоплазма получает от хозяина. Если из генома вычесть консервативный минимальный набор генов, то остаются гены экологической специфичности, определяющие специфические фенотипические характеристики вида. Например, у микоплазмы 10% генома составляют гены адгезинов и поверхностных антигенов, которые участвуют в продуцировании антигенных вариантов поверхностных белков, смена которых позволяет избежать иммунного ответа. Археи — типичные экстремофилы, живущие при очень высоких температурах, высоких концентрациях солей, высоком давлении и экстремальной рН, Несмотря на сходство с эубактериями, во многих аспектах метаболизма архебактерии похожи на эукариот. Геном Methanococcus jannaschii был расшифрован в 1996 году. Кольцевая двуцепочечная ДНК размером 1,7 мб содержит 1738 генов, кодирующих белки. Геном имеет три хромосомы — большую, кольцевую хромосому размером 1, 66 мб и две маленькие кольцевые хромосомы размером 58,4 и 16,5 кб. Большинство генов этого организма (58%) не похожи ни на какие другие известные гены. Геномы растений Размер генома растений, размер и число хромосом вариабельны. Так, у видов рода Trillium 5 пар хромосом примерно по 10 млрд.п.н. каждая, а у Arabidopsis 5 пар хромосом всего лишь по 20 млн.п.н. на хромосому. У мхов и у папоротников хромосомы моноцентричны. Центромера хромосом цветковых растений может быть локализованной или диффузной. Хромосомы с диффузной центромерой описаны у некоторых представителей однодольных (Cyperacea, Juncaceae, Liliaceae). Кинетохор цветковых растений трехслоен, часто имеет вид "чаши и шара". На концах хромосом всех исследованных мхов, голосеменных и покрытосеменных кроме представителей семейства Alliaceae находится последовательность (TTTAGGG)n. Ядрышковый организатор мхов и цветковых растений содержит аргентофильные белки. Как правило, хромосомы цветковых растений несут крупные С-сегменты, которые лежат не только в прицентромерных районах, но также у теломер и в интерстициальных районах хромосом. Растения с диффузной центромерой имеют рассеянные по хромосомам С-сегменты. В хромосомах растений G/R-подобной исчерченности длительное время обнаружить не удавалось, что объясняли большей чем у животных конденсацией хромосом в митозе. Однако затем было показано, что можно подобрать такие условия обработки препаратов, при которых хромосомы некоторых растений демонстрируют структурную неоднородность внутренних районов хромосом — вдоль по длине их плеч лежат темно и светлоокрашенные сегменты, в той или иной степени похожие на G/R-блоки хромосом животных. Среди голосеменных такой тип дифференциального окрашивания описан у сосен Pinus resinosa и P. ormadi. Среди цветковых растений G-подобную исчерченность наблюдали в прометафазных хромосомах двух видов лилейных, сельдерея, бобовых, нескольких видов злаков. Природа этой исчерченности неясна. Как и у животных G-сегменты хромосом растений это "структурные блоки" — на единицу площади препарата в темноокрашенных сегментах хромосом растений ДНК больше. Однако в отличие от животных, у растений после окрашивания АТ- и GC-специфичными красителями рисунок одинаков, т.е. структурная неоднородность здесь не коррелирует с АТ- обогащенностью. В некоторых случаях G-подобные сегменты хромосом растений демонстрируют основные характеристики C-сегментов, в частности, они насыщены сат-ДНК, реплицируются в конце S-фазы, т.о., по-видимому, являются интеркалярными сегментами гетерохроматина. Множественные, рассеянные по хромосомным плечам хромомеро-подобные сегменты внутренних районов хромосом злаков проявляются вследствие дифференциальной реакции хроматина на холодовую блокаду конденсации, что напоминает поведение гетеро/эухроматина на холоду и позволяет рассматривать феномен индуцируемой холодом дифференциальной окрашиваемости внутренних районов хромосом растений как частный случай аллоциклии (гетеропикноза)- дифференциальной конденсации эу- и гетерохроматина в ответ на внешние воздействия. После Q-окрашивания на хромосомах высших растений ярко или тускло (в зависимости от АТ-обогащенности сат-ДНК) флуоресцируют С-сегменты. Внутренние районы хромосом обычно флуоресцируют равномерно или получаемый рисунок исчерченности соответствует распределению блоков гетерохроматина и структурных блоков внутренних районов хромосом. В известных нам случаях, репликационная исчерченность внутренних районов хромосом растений (RB-бэндинг), в общем, соответствует С-сегментации. Одной из особенностей генома растений является наличие добавочных хромосом. В-хромосомы (или добавочные хромосомы) — это группа хромосом, различных по структурным и функциональным особенностям. В-хромосомы встречаются как в половых клетках, так и в соматических. Однако их присутствие не является строго обязательным, в отличие от хромосом основного набора (А-хромосом). В-хромосомы описаны у 510 видов двудольных растений, 1007 видов однодольных растений, 263 видов животных (в основном у насекомых). Число В-хромосом изменяется от 1-2 до 12. Значительное число В-хромосом (более 10) снижает плодовитость растений. ДНК В-хромосом в основном представлена высокоповторяющимися последовательностями. На большое содержание гетерохроматина указывает то, что в клеточном ядре В-хромосомы расположены на внутренней стороне ядерной оболочки, для них характерно эктопическое взаимодействие и поздняя репликация в клеточном цикле. Морфология В-хромосом может быть различной. Описаны бесструктурные глыбы хроматина; небольшие округлые или вытянутые сильно гетеропикнотические тельца; иногда В-хромосомы имеют характерный для политенных хромосом рисунок дисков, пуфы и часто ядрышки. При митотическом делении В-хромосомы ведут себя как и А-хромосомы. Однако у некоторых видов описано явление соматической элиминации В-хромосом, когда В-хромосомы обнаруживаются в микроспорах, но не в клетках корня. В-хромосомы могли возникнуть из А-хромосом в результате гибридизации разных видов; в результате хромосомных перестроек, которые могут привести к образованию маленьких центрических сегментов; в результате амплификации прицентромерных участков А-хромосом; в результате нерасхождения некоторых А-хромосом и возникновения трисомии или тетрасомии; в результате делеций в хромосомах с диффузной центромерой. После возникновения В-хромосомы начинается инактивация расположенных в ней генов и потеря генетического материала в результате делеций. В 2000 г. появилась публикация о полном секвенировании генома горчицы малой — арабидопсиса, в 2001 г. — о предварительном (черновом) секвенировании генома риса. Изучение геномов растений — задача значительно более сложная, чем исследование генома человека и других животных. Это связано со следующими обстоятельствами: геномы растений огромны, достигают у некоторых видов растений десятков и даже сотен миллиардов пар нуклеотидов: геномы основных хозяйственно важных растений (кроме риса, льна и хлопка) по размерам либо близки к геному человека, либо превышают его во много раз; число хромосом колеблется в широких пределах — от двух у некоторых видов до нескольких сотен у других, причем не удается выявить строгой корреляции между размером генома и числом хромосом; огромное количество полиплоидных форм с близкими, но не идентичными геномами; чрезвычайная обогащенность геномов растений (до 99%) "незначащей" ДНК, что резко затрудняет стыковку отсеквенированных фрагментов в общий крупноразмерный участок ДНК (контиг); неполное (по сравнению с геномами дрозофилы, человека и мыши) морфологическое, генетическое и физическое картирование хромосом; практически невозможно выделять в чистом виде индивидуальные хромосомы с помощью методов, обычно применяемых с этой целью для хромосом человека и животных; затруднено хромосомное картирование отдельных генов с помощью гибридизации in situ, обусловленной как высоким содержанием в геномах растений "незначащей" ДНК, так и особенностями структурной организации хромосом растений; эволюционная отдаленность растений от животных, что серьезно осложняет использование для изучения геномов растений сведений, полученных при секвенировании генома человека и других животных; длительный процесс размножения большинства растений, что существенно замедляет их генетический анализ. Геном Arabidopsis thaliana (Резуховидка Таля) Из множества растительных организмов для исследования были выбраны два — арабидопсис, представляющий класс двудольных (размер генома 125 млн. п.н.), и рис из класса однодольных (420-470 млн. п.н.). Эти геномы невелики по сравнению с геномами других растений и содержат сравнительно немного повторяющихся участков ДНК. Основанием для выбора арабидопсиса послужили не только небольшие размеры его генома, но и мелкие размеры организма, что позволяет легко выращивать его в лабораторных условиях. Короткий репродуктивный цикл, благодаря чему можно быстро проводить опыты по скрещиванию и отбору, детально изученную генетику, легкость осуществления манипуляций со сменой условий произрастания и с испытанием действия на растения различных мутагенных факторов и патогенов. Арабидопсис не имеет хозяйственной ценности, поэтому его геном, наряду с геномом мыши, получил название справочного или модельного. Интенсивная работа по секвенированию генома арабидопсиса была начата в 1996 г. международным консорциумом, в который вошли научные учреждения и исследовательские группы из США, Японии, Бельгии, Италии, Великобритании и Германии. В декабре 2000 г. стала доступной обширная информация, подводившая итоги определения первичной структуры генома арабидопсиса. Для секвенирования использовали классическую, или иерархическую, технологию: сначала изучали отдельные небольшие участки генома, из которых составляли более крупные участки (контиги), а на финальном этапе — структуру индивидуальных хромосом. Ядерная ДНК генома арабидопсиса распределена между пятью хромосомами. В 1999 г. были опубликованы результаты секвенирования двух хромосом, а появление в печати сведений о первичной структуре остальных трех завершило секвенирование всего генома. Из 125 млн. пар нуклеотидов определена первичная структура 119 млн., что составляет 92% всего генома. Лишь 8% генома арабидопсиса, содержащих крупные блоки повторяющихся участков ДНК, оказались недоступными для изучения. По полноте и тщательности секвенирования геномов эукариот арабидопсис остается пока в первой тройке чемпионов наряду с одноклеточным дрожжевым организмом Saccharomyces cerevisiae и многоклеточным организмом животного Саеnorhabditis elegance. В геноме арабидопсиса обнаружено около 15 тыс. индивидуальных генов, кодирующих белки. Приблизительно 12 тыс. из них содержатся в виде двух копий на гаплоидный геном, так что общее число генов составляет 27 тыс. Число генов у арабидопсиса не сильно отличается от числа генов у таких организмов, как человек и мышь, однако размеры его генома в 25-30 раз меньше. С этим обстоятельством связаны важные особенности в структуре отдельных генов арабидопсиса и общей структуры его генома. Гены арабидопсиса компактны, содержат лишь несколько экзонов, разделенных короткими (около 250 пар нуклеотид) некодирующими интронами. Промежутки между отдельными генами составляют в среднем 4.6 тысяч пар нуклеотидов. Для сравнения: гены человека содержат многие десятки и даже сотни экзонов и интронов, а межгенные участки имеют размеры от 10 тысяч пар нуклеотидов и более. Предполагают, что наличие небольшого компактного генома способствовало эволюционной устойчивости арабидопсиса, поскольку его ДНК в меньшей степени становилась мишенью для воздействия различных повреждающих агентов, в частности, для внедрения в геном вирусоподобных повторяющихся фрагментов ДНК (транспозонов). Из других молекулярных особенностей генома арабидопсиса следует отметить обогащенность экзонов гуанином и цитозином (44% в экзонах и 32% в интронах) по сравнению с генами животных, а также присутствие дуплицированных генов. Геном арабидопсиса разделен на пять хромосом. Хромосомы 2 и 4 имеют много тандемных генных дупликаций (239 дупликаций на хромосоме 2, захватывающие 539 генов), а также большие дупликации, вовлекающие четыре блока ДНК суммарной длиной 2,5 мегабаз. Некоторые дупликации, захватывающие 37 генов на хромосоме 4, также присутствуют и на хромосоме 5. Предполагают, что такое удвоение произошло в результате четырех одномоментных событий, заключавшихся в удвоении части генов арабидопсиса, или слияния родственных геномов. Эти события, имевшие место 100-200 млн. лет назад, — проявление общей тенденции к полиплоидизации, характерной для геномов растений. Однако некоторые факты показывают, что у арабидопсиса удвоенные гены не идентичны и функционируют по-разному, что может быть связано с мутациями в их регуляторных участках. Геном риса Еще одним объектом полного секвенирования ДНК стал рис. Геном этого растения тоже невелик по сравнению с другими видами высших растений (12 хромосом, дающих в сумме 420-470 млн. п.н.), всего в 3.5 раза больше, чем у арабидопсиса. Однако, в отличие от арабидопсиса, рис имеет огромное хозяйственное значение. Отдельные исследователи приступили к изучению генома риса еще в 80-х годах прошлого столетия, но серьезного масштаба эти работы достигли лишь в 90-х. В 1991 г. в Японии была создана программа по расшифровке структуры генома риса, объединившая усилия многих исследовательских групп. В 1997 г. на базе этой программы был организован Международный проект "Геном риса". Его участники решили сконцентрировать усилия на секвенировании одного из подвидов риса (Oriza sativajaponica), в изучении которого к тому времени уже были достигнуты значительные успехи. В рамках этой программы прошла апробацию стратегия "похромосомного" иерархического разделения генома, которую участники международного консорциума использовали при расшифровке генома риса. Однако, если при изучении генома человека с помощью различных приемов выделяли фракции отдельных хромосом, то материал, специфичный для индивидуальных хромосом риса и их отдельных участков, получали методом лазерной микродиссекции (вырезания микроскопических объектов). На предметном стекле микроскопа, где находятся хромосомы риса, под воздействием лазерного луча выжигается все, кроме хромосомы или ее участков, намеченных для анализа. Оставшийся материал используют для клонирования и секвенирования. Опубликованы многочисленные сообщения о результатах секвенирования отдельных фрагментов генома риса, осуществленного с высокой точностью и детальностью, характерной для иерархической технологии. Считали, что определение полной первичной структуры генома риса будет завершено к концу 2003-середине 2004 г. и результаты вместе с данными по первичной структуре генома арабидопсиса будут широко использоваться в сравнительной геномике других растений. Однако в начале 2002 г. две исследовательские группы — одна из Китая, другая из Швейцарии и США — опубликовали результаты полного чернового (приблизительного) секвенирования генома риса, выполненного с помощью технологии тотального клонирования. В отличие от поэтапного (иерархического) изучения, тотальный подход основан на одномоментном клонировании всей геномной ДНК в одном из вирусных или бактериальных векторов и получении значительного (огромного для средних и крупных геномов) количества отдельных клонов, содержащих различные отрезки ДНК. На основании анализа этих секвенированных участков и наложения друг на друга идентичных концевых участков ДНК образуется контиг — цепочка стыкованных между собой последовательностей ДНК. Общий (суммарный) контиг представляет собой первичную структуру всего генома или, по крайней мере, индивидуальной хромосомы. В таком схематичном изложении стратегия тотального клонирования кажется несложной. На деле она встречает серьезные трудности, связанные с необходимостью получения огромного количества клонов (принято считать, что изучаемый геном или его участок должен быть перекрыт клонами, по крайней мере, 10 раз), гигантским объемом секвенирования и чрезвычайно сложной работой по стыковке клонов, требующей участия специалистов по биоинформатике. Серьезным препятствием на пути тотального клонирования служат разнообразные повторяющиеся участки ДНК, число которых, как уже упоминалось, резко возрастает по мере увеличения размера генома. Поэтому стратегию тотального секвенирования используют преимущественно при изучении геномов вирусов и микроорганизмов, хотя она и была успешно применена для исследования генома дрозофилы. Для секвенирования генома риса упомянутые выше исследовательские группы взяли два его подвида, наиболее широко культивируемые в азиатских странах, — Oriza saliva L. ssp indicaj и Oriza saliva L. sspjaponica. Результаты их исследований во многом совпадают, но во многом и различаются. Так, представители обеих групп заявили, что ими достигнуто перекрывание контигами приблизительно 92-93% генома. Показано, что около 42% генома риса представлено короткими повторами ДНК, состоящими из 20 пар нуклеотидов, и большинство подвижных ДНК-элементов (транспозонов) находится в межгенных участках. Однако сведения о размерах генома риса существенно различаются. Для японского подвида размер генома определен равным 466 млн. пар нуклеотидов, а для индийского — 420 млн. Причина такого расхождения не ясна. Оно может быть следствием различных методических подходов в определении размеров некодирующей части геномов, то есть не отражать истинного положения дел. Но не исключено, что 15%-ное различие в размере изученных геномов действительно существует. Второе серьезное расхождение выявилось в числе обнаруженных генов: для японского подвида — от 46022 до 55615 генов на геном, а для индийского — от 32000 до 50000. Причина такого расхождения не ясна. Возможно, что пробелы в знаниях генома риса будут устранены при сопоставлении данных "чернового секвенирования" с результатами детального, иерархического секвенирования, проводимого участниками Международного проекта "Геном риса". Сравнение свойств геномов арабидопсиса и риса показало, что большая часть генов (до 80%), выявленных в геноме арабидопсиса, обнаружена и в геноме риса, однако приблизительно для половины генов, обнаруженных у риса, пока не удалось найти аналогов (ортологов) в геноме арабидопсиса. В то же время 98% генов, первичная структура которых установлена для других злаков, выявлены в геноме риса. Вызывает недоумение существенное (почти в два раза) расхождение в числе генов у риса и арабидопсиса. При этом данные черновой расшифровки генома риса, полученные с помощью тотального секвенирования, практически не сопоставлены с обширными результатами изучения генома риса методом иерархического клонирования и секвенирования, то есть не осуществлено то, что сделано в отношении генома дрозофилы. Поэтому остается неясным, отражает ли различие числа генов у арабидопсиса и риса истинное положение дел или же оно объясняется различием в методических подходах. В отличие от генома арабидопсиса, сведения о генах-двойниках в геноме риса не приведены. Не исключено, что их относительное количество может быть больше у риса, чем у арабидопсиса. В пользу такой возможности косвенно свидетельствуют данные о наличии полиплоидных форм риса. Что касается функции генов растений, то мы знаем о них менее одной десятой того, что нам известно о генах человека (табл. 2). Даже у арабидопсиса, геном которого по степени изученности намного превосходит геном человека, функция почти половины его генов остается неизвестной. Между тем у растений, кроме генов, общих с животными, имеется значительное число генов, специфичных только для них. Речь идет о генах, вовлеченных в транспорт воды и синтез клеточной стенки, отсутствующей у животных, о генах, обеспечивающих образование и функционирование хлоропластов, фотосинтез, фиксацию азота и синтез многочисленных ароматических продуктов. Полное секвенирование генома дает близкие к истинным сведения об общем количестве генов данного организма, позволяет поместить в банки данных более или менее подробные и достоверные сведения об их структуре, облегчает работу по выделению и изучению индивидуальных генов. Однако секвенирование генома отнюдь не означает установления функции всех генов. Один из наиболее перспективных подходов функциональной геномики базируется на выявлении работающих генов, на которых идет транскрипция (считывание) мРНК. Этот подход, в том числе использующий современную технологию микрочипов, позволяет одновременно выявлять до десятков тысяч функционирующих генов. Недавно с помощью такого подхода начато изучение геномов растений. Для арабидопсиса удалось получить около 26 тыс. индивидуальных транскриптов, что резко облегчает возможность определения функции практически всех его генов. Знание генов, механизмов их экспрессии и регуляции чрезвычайно важно для развития биотехнологии и получения трансгенных растений. Очевидно, что структурные исследования геномов растений будут базироваться на подходах и методах сравнительной геномики с использованием в качестве основного материала результатов расшифровки геномов арабидопсиса и риса. Существенную роль в развитии сравнительной геномики растений будут, без сомнения, играть сведения, которые рано или поздно предоставит тотальное секвенирование геномов других растений Так, было показано, что ген, ответственный за яровизацию, расположен в локусе VRn-AI хромосомы 5А гексаплоидной пшеницы и локусе Hd-6 хромосомы 3 риса. Развитие этих исследований явится мощным толчком к идентификации, выделению и секвенированию многих функционально важных генов растений, в частности генов, ответственных за устойчивость к болезням, засухоустойчивость, приспособленность к различным условиям произрастания. Можно предвидеть дальнейшее совершенствование хромосомных технологий, прежде всего метода микродиссекции. Его использование резко расширяет возможности геномных исследований, не требуя огромных затрат, как, например, тотальное секвенирование геномов. Получит дальнейшее распространение метод локализации на хромосомах растений отдельных генов с помощью гибридизации in situ. В настоящий момент его применение ограничено огромным числом повторяющихся последовательностей в геноме растений, а возможно, и особенностями структурной организации хромосом растений. Хромосомные технологии в обозримом будущем приобретут большое значение и для эволюционной геномики растений. Эти технологии, относительно недорогие, позволяют быстро оценивать внутри- и межвидовую вариабельность, изучать сложные аллополиплоидные геномы тетраплоидной и гексаплоидной пшеницы, тритикале; анализировать эволюционные процессы на хромосомном уровне; исследовать образование синтетических геномов и введение (интрогрессия) чужеродного генетического материала; выявлять генетические взаимоотношения между индивидуальными хромосомами различных видов. Литература Акифьев и др. Диминуция хроматина // Генетика. 2002. № 5. С. 595-601. Зеленин А.В., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В. Введение в геномику растений // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. С. 339-348. Ayala F.J., Coluzzi M. Chromosome speciation: human, Drosophila, and mosquitoes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 6535-6542. Муравенко О.В., Лемеш В.А., Саматадзе Т.Е. и др. Сравнение геномов трех близкородственных видов льна и их гибридов с использованием хромосомных и молекулярных маркеров // Генетика. 2003. Т. 39. С. 510-518. Arabidopsis thaliana genome sequence // Nature. 2000. V. 408. P. 791-826. |