ол. Острый лейкоз классификация, симптомы, диагностика и лечение
 Скачать 99.73 Kb.
|
Лабораторная диагностика хронического лимфолейкозаКлинический анализ крови при хроническом лимфолейкозе. Первым лабораторным признаком заболевания является лейкоцитоз с относительным и абсолютным лимфоцитозом. Морфологически лимфоциты не отличаются от нормальных. Пролимфоцитов обычно не более 2%. Имеется редкий вариант хронического лимфолейкоза, при котором пролимфоцитов больше 10%, но меньше 55% (при количестве пролимфоцитов больше 55% диагностируется пролимфоцитарный лейкоз). Течение этого варианта заболевания значительно более агрессивное и приближается к пролимфоцитарному лейкозу. Закономерно обнаруживаются( тени Гумпрехта) клетки цитолиза — разрушенные ядра лейкемически измененных лимфоцитов (артефакт, образующийся при приготовлении мазка крови). При прогрессировании нарастают лейкоцитоз и лимфоцитоз, анемия и тромбоцитопения. Анемия и тромбоцитопения могут иметь аутоиммунный характер, что подтверждается обнаружением антител и положительным ответом на глюкокортикостероиды. Исследование костного мозга при хроническом лимфолейкозе. Диагностическое значение имеют обнаружение более 30% лимфоцитов в миелограмме (если аспират не разведен периферической кровью) и лимфоидная инфильтрация костного мозга по данным трепанобиопсии. Характер инфильтрации костного мозга имеет прогностическое значение: нодулярное и интерстициальное поражение более благоприятно, чем диффузное. Биохимические и иммунологические исследования при хроническом лимфолейкозе. При хроническом лимфолейкозе отсутствуют патогномоничные изменения биохимических показателей. В то же время характерны увеличение содержания мочевой кислоты (при лейкоцитозе), общей ЛДГ (отражает объем опухолевой массы и является неблагоприятным прогностическим признаком), а также гипогаммаглобулинемия, коррелирующая с частотой инфекционных осложнений. У большинства пациентов обнаруживается снижение уровня иммуноглобулинов G, М и А. Чрезвычайно большое значение для диагностики и дифференциального диагноза имеет определение иммунофенотипа. Характерный иммунофенотип при В-клеточном ХЛЛ: CD5+, CD19+, CD20+, CD22± , CD79a+, CD23+, CD43+, CDllct, CD10-, циклин D1-. Как правило, негативны FMC7 и CD79b. При проведении иммунофенотипирования рекомендуется оценивать экспрессию CD38, ZAP-70 и CD52. Экспрессия CD38 и/или ZAP-70 коррелирует с выявлением «u-CLL» и является плохим прогностическим признаком. Маркер CD52 — «мишень» для лечения моноклональным анти-CD52 антителом (Campath-1). Цитогенетические и молекулярно-генетические исследования при хроническом лимфолейкозе. При рутинном цитогенетическом исследовании изменения кариотипа обнаруживаются более чем у 50% больных ХЛЛ, при FISH-анализе — у 80%. К наиболее частым аномалиям относятся трисомия хромосомы 12 (20% случаев), делеция хромосом llq (20%), 13q и 14q (50%), 6q21 (5%) или 17р13 (локус р53 — 10% случаев). При изменениях кариотипа, особенно множественных, прогноз заболевания ухудшается. Выявлены ассоциации между хромосомными транслокациями и онкогенами, имеющими значение в лейкозогенезе: t(ll; 14) — с BCL-1 (следует отметить, что гиперэкспрессия BCL-1 чаще наблюдается при лимфоме мантийной зоны); t (14; 18) — с BCL-2 (экспрессия гена BCL-2, который препятствует развитию апоптоза, нарастает по мере прогрессирования ХЛЛ). Как уже отмечалось, мутация гена р53, которая выявляется у 10% пациентов, имеет неблагоприятное прогностическое значение. Диагноз В-клеточного хронического лимфолейкоза правомочен при наличии следующих признаков: 1) абсолютный лимфоцитоз периферической крови более 10 • 109/л; 2) при световой микроскопии лимфоциты имеют нормальную морфологию (меньше 10% атипичных лимфоцитов); 3) характерный иммунофенотип; 4) лимфоцитарная инфильтрация костного мозга (более 30% лимфоцитов при исследовании миелограммы, лимфоидная метаплазия костного мозга в трепанобиоптате). Дифференциальный диагноз проводится с заболеваниями, сопровождающимися лимфаденопатией и лимфоцитозом. К ним относятся другие лимфопролиферативные заболевания (неходжкинские лимфомы, волосатоклеточный лейкоз), вирусные (краснуха, корь, цитомегаловирус, ВИЧ-инфекция, герпес, инфекционный мононуклеоз) и некоторые бактериальные инфекции (токсоплазмоз, туберкулез). Клиническая картина при реактивных и опухолевых лимфаденопатиях и лимфоцитозах не имеет решающего значения для диагностики, однако следует учитывать ряд гематологических показателей (во всех случаях отсутствуют тени Гумпрехта, при вирусных инфекциях возможно появление небольшого количества плазматических клеток, для неходжкинских лимфом и волосатоклеточного лейкоза характерен полиморфизм лимфоцитов и другой иммунофенотип). Проведение дифференциальной диагностики и постановка окончательного диагноза хронического лимфолейкоза основаны на результатах гистологического исследования лимфатического узла и трепанобиопсии костного мозга, анализа миелограммы, иммунофенотипа лимфоцитов, данных серологических и культуральных исследований (для исключения инфекционных заболеваний). В соответствии с этой классификацией острые лейкозы подразделяются на: 1. Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ): Острый миелобластный лейкоз, вариант с t(8;21) (q22;q22) и вариант с перестройками 11q23; Острый промиелоцитарный лейкоз с t(l5;17) (q22;q11-12) и вариантами; Острый миеломонобластный лейкоз, вариант с inv(16)(p13;q22) или t(16;16)(p13;q22) и с патологической костномозговой эозинофилией, вариант с перестройками 11q23; Острый монобластный лейкоз, вариант с перестройками 11q23; Острый эритромиелоз, острый эритромегакариобластный лейкоз; Острый монобластный лейкоз новорожденных; Острый мегакариобластный лейкоз; Острый мегакариобластный лейкоз с миелофиброзом; Острыймиелобластныйлейкоз с миелофиброзом; Острый малопроцентныйлейкоз, вариант с 5 q -*; Вторичные миелобластные лейкозы; Острый макрофагальный лейкоз. 2. Острые лимфобластные лейкозы: Острый В-лимфобластный лейкоз взрослых, цитогенетические варианты с – t(9;22)(q34;q11); – t(1;19)(q23;p13); – t(12;21)(p12;q22); – и с перестройками 11q23. иммунофенотипические варианты – ранний пре-В (про-В); – пре-В; – В. Острый В-лимфобластный лейкоз детей – цитогенетические варианты; – t(9;22)(q34;q11); – t(1;19)(q23;p13); – t(12;21)(p12;q22); – и с перестройками 11q23; 9 иммунофенотипические варианты – ранний пре-В (про-В); – пре-В; – В. Острый плазмобластный лейкоз; Острый Т-лимфобластный лейкоз взрослых; Острый Т-лимфобластный лейкоз детей Острый Т-лимфобластный лейкоз с апластическим синдромом 3. Острые бифенотипические лейкозы 4. Острые недифференцируемые лейкозы. Прогноз Прогноз при остром лейкозе во многом зависит от возраста больного и правильном выборе тактики терапии. Для больных острым лимфобластным лейкозом в возрасте 5–10 лет ремиссия в 100% случаев, выздоровление – в 90%. Для больных острым миелобластным лейкозом в возрасте до 30 лет ремиссия в 95% случаев, выздоровление – в 20% Методы измерения клеток на гематологических проточных анализаторах 1. Кондуктометрия является наиболее распространенным способом проточного анализа клеток крови и широко используется для проведения рутинных исследований в гематологических лабораториях. Кондуктометрический детектор представляет собой капилляр диаметром порядка 70 мкм и длиной, обычно составляющей 0,75 диаметра, через который с большой скоростью пропускается суспензия клеток, находящихся в растворе электролита. По обе стороны от капилляра (апертуры) находятся электроды, между которыми поддерживается постоянный ток. Поскольку электрическое сопротивление клетки значительно выше сопротивления электролита, в момент прохождения клетки через апертуру ее электрическое сопротивление резко возрастает. Амплитуда регистрируемого при этом импульса прямо пропорционально зависит от объема вытесненного электролита и отражает объем клетки. Подсчет количества объектов в единице объема пробы позволяет проанализировать их концентрацию. Более детальный анализ заключается в изучении распределения клеток по объему. В литературе кондуктометрический метод обозначают DC (от англ. direct current -- измерение сопротивления). Радиочастотный анализ (RF -- radio frequency) является разновидностью кондуктометрического метода и используется на некоторых гематологических анализаторах. При прохождении апертурного отверстия объектом в токе высокой частоты также возникают сигналы, амплитуда которых зависит от размеров ядра, плотности ядерного матрикса и цитоплазматических включений (см. рис. 1). Эти сигналы в большей степени отражают характер внутренней структуры клетки. 2. Регистрация свето-рассеяния и поглощения. Светорассеяние обусловлено клеточным размером, формой, плотно-стью, окрашиванием и гра-нулярностью внутрикле-точных структур. Рассеянный свет от клеток и частиц состоит из дифракционных, рефракционных и отражающих компонентов. Светорассеяние для характеристики клеток измеряется разными путями.При малых углах относительно оси падающего света преобладает дифракция. Рассеяние вблизи первого минимума переднего светового дифракционного изображения используют для измерения размера объектов. С возрастанием угла рассеивания увеличивается значение рефракционных эффектов. Поскольку рефракционные лучи пересекают внутренность клетки, регистрируемые при этом сигналы в большей степени отражают внутриклеточную микроструктуру.Преломление зависит от поглощения и может применяться для измерения способности клеток окрашиваться поглощающими красителями. Ослабление осевого света (поглощение) также используется для проточного анализа. 3. Флюориметрия -- измерение флюоресценции красителей, связанных с избирательными клеточными структурами -- главное в применении проточной цитометрии. Флюоресценция имеет 3 основных преимущества в проточных исследованиях: 1) флюоресцентное излучение прямо пропорционально специфическим клеточным компонентам; 2) концентрация красителя для исследования клетки очень низкая; 3) нефлюоресцирующие соединения могут становиться флюоресцирующими при взаимодействии с внутриклеточными структурами или ферментами. Наибольшее применение в цитофлюориметрии нашли методики анализа распределения клеток по содержанию ДНК и флюоресцентная метка клеток антителами (иммунофенотипирование), которые можно применять одновременно (на одном образце). Основные линии поглощения и излучения флюорохромов, наиболее часто используемых в проточной Интенсивность флюоресцентного сигнала, а, следовательно, и качество измерений зависят от различных инструментальных характеристик. Сюда входят интенсивность возбуждающего света, скорость движения объектов в потоке, спектр возбуждения красителя, квантовая эффективность красителя, собирающая и передающая эффективность световой оптики и чувствительность фотоэлектронных умножителей. 4. Изучение поляризации флюоресценции позволяет охарактеризовать такое важное биологическое свойство, как вязкость или текучесть мембран, которое отражает функциональное состояние клетки. При поляризации лазерного излучения флюоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет. В том случае, если молекулы заметно вращаются, их ориентация меняется до начала флюоресцентного излучения и интенсивность поляризованного света уменьшается 5. Анализ сигнала волновой формы можно использовать для измерения ядерного и цитоплазматического диаметра. При этом применяется "щелевой" анализ -- лазерный луч фокусируют до диаметра 1 мкм, а измеряемые клетки пересекают его с постоянной скоростью. Регистрируемые флюоресцентные сигналы имеют волновую форму, которая отражает структуру и размеры объекта вдоль оси, перпендикулярной к щели. Такой подход использовался для анализа структуры хромосом млекопитающих. Иммунофенотипическая характеристика лейкозных клеток при остром лейкозе При выявлении в образце неопластических клеток и определении их количества должны быть решены две основные задачи ИФТ гемобластозов: 1) идентификация патологических клеток, 2) иммунофенотипическая характеристика бластов, в том числе * определение линейной принадлежности бластов и уровня их дифференцировки, * определение степени гетерогенности клеток патологической популяции за счет выявления различных патологических клонов или наличия клеток на разных стадиях дифференцировки, * получение подробной фенотипической характеристики каждой выявленной субпопуляции патологических клеток. Определение линейной принадлежности лейкозных бластов является обязательной частью обследования пациентов с подозрением на гемобластоз. Для этого может быть достаточной оценка экспрессии маркеров скрининговой панели: Ї линейную принадлежность клеток определяют: (а) миелоидные маркеры: МПО, СD13, СDЗЗ; (б) лимфоидные маркеры: маркеры Т-лимфоцитов СD2, СD7, суСDЗ и sСDЗ; маркеры В-лимфоцитов СD10, СD19, суСD22 и sСD22; незрелость клетки характеризуют ТdТ, СD34, НLА-DR. Определение линейной коммитированности опухолевых клеток тем проще, чем больше дифференцировочных маркеров выявляется на их мембране. Трудности в определении линейной принадлежности бластов чаще всего связаны с отсутствием экспрессии линейных маркеров на поверхностной мембране клеток и с существованием перекрестной экспрессии линейных антигенов. Поверхностные линейно-ассоциированные маркеры не выявляются при опухолевой трансформации самых ранних клеток -- предшественников гемопоэза или (в отдельных случаях) утрачиваются при опухолевой прогрессии и/или после химиотерапии. При отсутствии экспрессии линейных маркеров на поверхностной мембране клеток необходимо выявлять маркеры линейной принадлежности (миелопероксидаза -- МПО, СDЗ, СD79б, СD22) в цитоплазме, что требует введения дополнительных шагов в протокол пробоподготовки. Чтобы избежать необходимости последовательного проведения дополнительных окрашиваний, логичнее с самого начала включить в диагностическую панель несколько сочетаний маркеров для выявления внутриклеточных антигенов. Это требует минимального увеличения времени пробоподготовки за счет фиксации и пермеабилизации, но компенсируется получением абсолютно достоверной информации о линейной принадлежности бластов. В некоторых случаях острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) на бластах могут быть выявлены антигены, в норме (на зрелых клетках) ассоциирован-ные с лимфоцитами (СD2, СD7, СD19), а при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) -- ассоциированные миелоидными клетками (СD13, СD14, СD15, СDЗЗ, wСD65) или реже с натуральными киллерами (СD56, СD57). Поэтому для безошибочного определения линейной принадлежности бластов необходимо использовать не один, а несколько линейно-ассоциированных маркеров. Наиболее специфичными маркерами В-линейности являются суСD79б и поверхностные или цитоплазматические иммуноглобулины. Для ОЛЛ заинтересованность В-линии подтверждается экспрессией по крайней мере двух из трех линейных маркеров (суСD22, СD19, суСD79б). Для установления варианта В-клеточного ОЛЛ необходимо оценить экспрессию ТdТ, СD34, СD19, СD79б, суСD22, cyIgм, sIg, k- и л-цепей иммуноглобулина. Наиболее специфичными маркерами Т-ряда являются поверхностный и/или цитоплазматический СDЗ и Т-клеточный рецептор (ТСR). Предшественники Т-клеток ОЛЛ обычно положительны по СD7 и отрицательны по СD19. Для установления варианта Т-ОЛЛ необходимо оценить экспрессию СD1а, СD2, сyСDЗ, СD4, СD5, СD8, СD16, СD56, варианта ТСR. Одновременное отсутствие или аномальная реактивность с маркерами СD7 и СD19 при наличии позитивной реакции с миелоидными маркерами является доказательством нелимфоидного происхождения лейкоза даже при отсутствии МПО. Для миелоидных клеток наиболее высокоспецифичными маркерами являются МПО и лизоцим. До настоящего времени иммунологическая классификация миелолейкозов разработана недостаточно, но требует оценки экспрессии значительного числа маркеров. Исключением являются мегакариоцитарные маркеры СD61, СD41, СD42 и эритроидный антиген гликофорин А, с помощью которых можно верифицировать мегакариобластный лейкоз (ОМЛ, вариант М7) и острый эритромиелоз (ОМЛ, вариант М6), но именно эти формы максимально узнаваемы клинически и морфологически и редко требуют проведения ИФТ с диагностической целью. При обнаружении на бластных клетках одновременной яркой экспрессии антигенов различных гемопоэтических линий, т. е. при подозрении на бифенотипический лейкоз (БФЛ) дополнительным шагом интерпретации данных ИФТ является балльная оценка экспрессии маркеров. Она проводится, согласно рекомендациям Европейской группы по изучению лейкозов, если в популяции лейкозных бластов не менее 10-- 20% клеток одновременно несут миелоидные и лимфоидные маркеры. Каждый маркер оценивается определенным баллом. Диагноз БФЛ ставится при оценке больше двух баллов для миелоидной и одного -- для лимфоидной линии. Предполагая БФЛ, надо обращать внимание на внутриклеточную экспрессию не одного, а как минимум двух маркеров миелоряда, чтобы избежать ошибочной гипердиагностики. Практически у всех пациентов с ОЛ фенотип патологических клеток является аберрантным, т. е. не полностью соответствующим какому-то определенному уровню дифференцировки нормальной клетки крови. Эта аномальная экспрессия отражает генетические изменения, лежащие в основе опухолевого перерождения лейкозной клетки. Таким образом, именно аберрации антигенной экспрессии позволяют отделять/дискриминировать здоровые клетки от патологических при анализе биологического материала пациентов с подозрением на онкогематологическое заболевание. Достаточно большое количество диагностических маркеров и соответственно большой объем получаемой при ИФТ информации обусловливают необходимость применения алгоритма ее интерпретации. В основе его лежит привычный двухшаговый подход: последовательно оценивается антигенная экспрессия маркеров, необходимых для первичной диагностики заболевания и полноценного описания патологической популяции при мониторинге заболевания, в том числе при резидуальной болезни. ИФТ-характеристика опухолевых клеток во многом определяется тем, какие МКА и в каких комбинациях выбраны лабораторией. Различные сочетания антител могут давать сходную информацию, но ни один не является оптимальным для всех диагностических ситуаций. Некоторые комбинации могут показаться повторяющимися или лишними, однако надо помнить, что опухолевые клетки часто демонстрируют патологическую экспрессию антигенов, т. е. такую характеристику, которая может быть пропущена при использовании неадекватного числа маркеров. Необходимо, чтобы лаборатория была хорошо знакома с особенностями каждой комбинации антител и с особенностями ее связывания с нормальными и патологическими клетками. Рестрицированная, сокращенная панель может ограничивать возможность выявления минимальной остаточной болезни и даже приводить к ошибочной диагностике первичного заболевания. Данные ИФТ являются обязательной составной частью исследований, так же как и демографическое описание пациента, характеристика течения заболевания, морфология и цитохимия клеток крови и костного мозга, цитогенетика. Полноценный развернутый диагноз ОЛ может и должен быть получен с помощью всего арсенала клинико-лабораторной информации [8]. Заключение Иммунофенотипирование является современным и одним из важнейших методов лабораторной диагностики заболеваний крови. Благодаря внедрению в медицинскую практику МАТ, стало возможным исследовать фенотипы как нормальных клеток крови (лейкоцитов) и костного мозга, так и генетически измененных, лейкозных клеток, и, как следствие, осуществлять с их помощью дифференциальную диагностику гемобластозов. Для проведения иммунофенотипической диагностики специально подбираются панели антител, включающих минимум маркеров (CD), позволяющих идентифицировать определенный тип лейкоза. Однако в некоторых ситуациях - БФЛ, лейкозы с коэкспрессией миелоидных/лимфоидных антигенов - для безошибочного определения линейной принадлежности бластов необходимо дополнять панель соответствующими маркерами. Особенно незаменимым метод иммунофенотипирования признан в диагностике острых лейкозов. Он активно применяется для выявления таких вариантов ОМЛ как острый миелобластный лейкоз с минимальной дифференцировкой (М0), острый эритромиелоз (М6) и острый мегакариобластный лейкоз (М7), а также абсолютно необходим в дифференциации всех трех вариантов ОЛЛ. Важно отметить роль ИФТ в установлении нозологической формы заболевания для назначения оптимального лечения конкретного пациента, определении изменения иммунофенотипа опухоли на фоне лечения, а также выявлении прогностических рисков, хотя с учетом растущих возможностей современной полихимиотерапии последняя задача представляется весьма неоднозначной. Принципы проточной цитофлюориметрии В основе проточной цитофлюориметрии лежит проведение фотометрических флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света. Фотометрические каналы используются для оценки размеров клеток и внеклеточных структур. Частицы, отличающиеся по размерам, по-разному рассеивают свет, при этом характер рассеивания зависит от соотношения длины волны света и диаметра частиц. Если размер частиц меньше длины облучающего монохроматического света лазера (например, внутриклеточные структуры), то существенное количество света рассеивается под углом 90° (боковое светорассеяние). В том случае, когда длина волны облучения сопоставима с размерами рассеивающихся частиц, характер рассеивания меняется. Световая волна как бы огибает частицу, взаимодействует с ней и отклоняется от прямолинейного распространения на небольшой угол - малоугловое или прямое светорассеяние. Такой тип рассеивания возникает взаимодействии света с поверхностью клеток разного размера. При одновременной регистрации бокового и прямого светорассеяния возможно выделить все клеточные популяции лейкоцитов. В этом случае удается определить физические свойства любой неокрашенной клетки (размер, гранулярность) и, таким образом, разделить анализируемую клеточную популяцию отдельные субпопуляции (например, лейкоциты периферической крови лимфоциты, моноциты и гранулоциты). Флюоресцентный канал применяется для изучения клеточных маркеров, для чего используются МАТ, меченные различными флюорохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток (белкам, ДНК, РНК). После окрашивания клеток МАТ происходит специфическое связывание последних с клеточными структурами и регистрация флюоресценции, индуцированной излучением лазера. Техника регистрации флюоресценции состоит в следующем. При облучении клеток длиной волны, возбуждающей флюорохром, происходит поглощение света. Затем флюорохром испускает свет, но уже меньшей интенсивности (большей длины волны), чем поглощенный. Кроме того, флюорохром испускает свет во все стороны, поэтому флюоресценцию можно регистрировать под любым углом по отношению к облучаемому свету. Как правило, регистрацию проводят под прямым углом, однако для монохроматического лазерного облучения это не является обязательным условием, так как испускаемый флюоресцентный свет всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет лазерного облучения [4]. Материалом для иммунофенотипирования могут служить стабилизированные периферическая кровь (кровь необходимо брать натощак с 8 до 10 часов утра) и костный мозг, ликвор, выпотные жидкости и клеточные суспензии различных тканей (лимфатические узлы, селезенка и др.). В качестве антикоагулянта используются гепарин (50 U/ml) или калиевые соли ЭДТА (К2 или К3ЭДТА в концентрации 1,6-2,2 мг/мл). Выбор антикоагулянта определяется тактикой исследования. Стабилизированные гепарином кровь или костный мозг могут храниться более длительный срок (в течение 3 дней) и использоваться для дополнительного цитогенетического исследования. Следует помнить, что кровь, стабилизированная гепарином, не пригодна для подсчета клеток в гематологических анализаторах и морфологического исследования. Преимущества использования в качестве антикоагулянта ЭДТА: меньшая потеря миелоидных клеток вследствие снижения адгезии их к стенкам пробирки; снижение агрегации тромбоцитов, агрегаты которых затрудняют вы деление гейта бластных клеток небольшого размера; материал может быть использован для подсчета клеток в гематологическом анализаторе и морфологического исследования. При применении в качестве антикоагулянта К-ЭДТА образцы крови или костного мозга пригодны для цитометрического исследования в течение 24 часов от момента взятия материала. При более длительном хранении образца необходимо оценить жизнеспособность клеток. В случае определения менее 80% жизнеспособных клеток материал не подлежит исследованию, так как возможна потеря антигенов, особенно слабо экспрессированных на клеточной поверхности. Взятие плевральной, асцитической, перикардиальной, спинномозговой и других жидкостей осуществляется в контейнер с забуференным физиологическим раствором или средой RPMI без добавления антикоагулянта [4]. Принцип метода Суспензия предварительно окра-шенных флюоресцирующими краси-телями клеток помещается в контейнер для проб проточного цитометра. Через наконечник специальной конструкции под давлением клеточная суспензия впрыскивается в центр быстро движущегося в том же направлении потока жидкости. Клетки, подхваченные потоком жидкости, выстраиваются друг за другом, образуя «цепочку» - принцип гидродинамического фокусирования, благодаря которому создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей жидкостью. Измерения происходят в проточной кювете прибора при пересечении клеткой луча аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 25 мВт, длина волны 488 нм), где молекулы флюоресцентных красителей, связанные с клетками, переходят в возбужденное состояние. Возвращаясь через короткое время в исходное состояние, молекулы испускают кванты света с иными длинами волн. Это вторичное излучение, имеющее строго определенную для каждого флюорохрома длину волны, проходя через оптическую систему прибора (линзы, фильтры, двухцветные зеркала), регистрируется высокочувствительными детекторами (фотоэлектронными умножителями), преобразующими его в электрические сигналы, поддающиеся компьютерной обработке. Проточные цитофлюориметры могут быть оборудованы одним, двумя или более лазерами. В случае использования двух или более лазеров в исследования могут быть включены флюорохромы, возбуждаемые на разных длинах волн (488 нм, 635 нм, 407 нм и др.). Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток производится по пяти основным параметрам: две характеристики светорассеяния клеток: FSC (forward side scatter) - показатель прямого светорассеяния и ортогональный SSC (90°) (side scatter) - показатель бокового светорассеяния; три канала детекции специфического флюоресцентного сигнала красителя на разной длине волны. Как уже было сказано выше, канал прямого светорассеяния (FSC-канал) используется для регистрации рассеивания света от поверхности клеток под малыми углами (1-10°), что позволяет определять их размеры. Канал бокового светорассеяния (SSC-канал) позволяет регистрировать рассеиваемые клеточными структурами лучи под углами до 90°. Отражение лазерных лучей происходит как от поверхности ядер клеток, так и от различных внутриклеточных структур. Этот параметр отражает оптическую плотность цитоплазмы клеток, характер клеточных включений и гранулярность клетки. Термин «гранулярность» имеет специфическую цитофлюориметрическую нагрузку и не является отражением морфологического понятия «гранулярности или зернистости». Под понятием «гранулярность», которую отражает параметр SSC, следует понимать всю совокупность образований, формирующих клетку, включая любые клеточные органеллы и ядро. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также о неоднородности гранулярности цитоплазмы. Анализ информации, получаемой прибором по каналам светорассеяния, дает возможность разделить лейкоциты периферической крови на три популяции - лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Лимфоциты характеризуются наименьшими размерами, наиболее крупные - гранулоциты, моноциты занимают промежуточное положение по параметрам FSC. Наиболее низкие характеристики SSC имеют лимфоциты, промежуточные - моноциты и высокие показатели SSC - у гранулоцитов. Параметры светорассеяния позволяют произвести анализ в определенном гейте - клеточной популяции с заданными характеристиками («регион интересoв»). При добавлении к клеточной суспензии МАТ, конъюгированных с флюорохромами, происходит связывание клеток, возбуждение флюоресценции и последующая ее регистрация при длине волны 488 нм (рис. 6). Использование нескольких флюоресцентных меток позволяет проводить одновременный двух-, трехцветный и более анализ, так как каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны. Наиболее часто в качестве красящей метки применяется флюоресцеинизотиоционат (FITC), который улавливается FL-1-детектором (зеленый спектр), фикоэритрин (РЕ) - FL-2-детектором (красный спектр), менее часто - тандем цианин-5/фикоэритрин и пиридин хлорофилл (PerCp, Су5/РЕ) - FL-3-детектором и аллофикоцианин (АРС) - FL-4-детектором. Номер канала зависит от конструкции используемого прибора. При воздействии лазерным лучом флюоресцентные красители, входящие в состав реагентов, генерируют различные цвета, что позволяет определять два и более антигена одновременно. С этой целью современные модели приборов могут быть оснащены двумя или более лазерами и четырьмя или более фотоумно- жителями, что позволяет регистрировать различные флюорохромы на разных длинах волн. При выборе сочетаний флюорохромов для одно- временного определения нескольких клеточных маркеров следует учитывать длину волны источника света и способность оптической системы прибора разделять и одновременно регистрировать сигналы от используемых флю- орохромов. В проточном цитофлюориметре свет преобразуется в электрические сигналы, которые обрабатываются, и в конечном итоге определяется количественная величина каждого измеряемого параметра. Эти величины дискретизируются и передаются в компьютер для вывода на дисплей и анализа. Использование многоцветного проточноцитометрического исследования позволяет одновременно получить информацию о нескольких антигенах на поверхности клеток. Иммунологические маркеры, наиболее часто используемые в дифференциальной диагностике лейкозов Разработка в 1975 г. гибридомной технологии получения моноклональных антител (МАТ) предоставила возможность изучить линейно-cпецифические, дифференцировочные, активационные антигены клеток. В 1982 г. в Париже было проведено I Рабочее совещание по созданию единой номенклатуры МАТ, на котором МАТ со сходной специфичностью были объединены в группы (кластеры). Первоначальное значение понятия «кластер дифференцировки» (CD - Cluster of Differentiation) подразумевало набор МАТ, распознающих одну и ту же антигенную структуру на поверхности клеток. Со временем термин «кластер дифференцировки» стал означать саму структуру на клеточной мембране, отражающей фенотип клетки. К настоящему времени известно более 247 антигенных структур - CD, локализованных на мембране клеток различных ростков гемопоэза. Линейно неограниченные (нерестриктироваииые) антигены - антигены, экспрессия которых не ограничена одной клеточной линией. К ним относят CD34, CD38, HLA-DR, TdT (терминальная дезоксинуклеотидилтранс-фераза). Линейно ассоциированные (линейно-специфические) антигены -- антигены, которые специфически экспрессируются на некоторых линиях миелоидной (CD13, CD33, CD117, CD65, МПО, CD14, CD15, CD41, CD42, CD61 и др.) или лимфоидной дифференцировки (CD 19, CD22, cIg, sIg, CD5, CD3 и др.). Дифференцировочные антигены - антигены, отражающие стадии дифференцировки клеток (цитоплазматический IgM, к-, л-легкие цепи Ig, CD34, CD10, СD1а и др.). Активационные антигены отражают активацию клеток (CD25, CD38, HLA-DR и др.). Линейно неограниченные (нерестриктированные) антигены TdT - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, внутриклеточная ДНК-полимераза. В норме определяется в ядре незрелых В- и Т-лимфоидных клеток и исчезает по мере их созревания. TdT-позитивные клетки присутствуют только в костном мозге и тимусе. Наличие фермента более характерно для клеток лимфоидного ряда, однако многочисленные исследования выявили его также в миелобластах, поэтому присутствие TdT является, скорее, признаком клеточной незрелости, чем маркером лимфобластов. Он чаще встречается при вариантах ОМЛ Мо и М1, высока его корреляция с другими ранними маркерами при ОМЛ, такими, как CD34 и HLA-DR, с отсутствием более зрелых миелоидных маркеров (CD65, CD14). Наличие TdT+-клеток помогает дифференцировать лимфобластную лимфому от крупноклеточной и лимфомы Беркитта. Прогностическая значимость этого маркера спорна. CD34 - трансмембранный протеин, который экспрессирован на 1-3% мононуклеарных клеток костного мозга человека, в периферической крови он присутствует на 0,01-0,05% клеток. Это антиген гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, который, являясь молекулой клеточной адгезии способствует независимому соединению гемопоэтических стволовых клеток с клеточными элементами стромы костного мозга. Высока корреляция его экспрессии с HLA-DR и TdT. CD34 обнаруживается в 70% случаев детского ОЛЛ и 58% - взрослого ОЛЛ. Прогностическое значение экспрессии CD34 различное - благоприятное при В- и неблагоприятное при Т-клеточном ОЛЛ у детей. При ОМЛ у детей экспрессия CD34 выявлена в 50% случаев, чаще при М4- и М5-вариантах, у взрослых в 40%, преимущественно при варианте М0. Экспрессия этого антигена расценивается как неблагоприятный прогностический фактор. CD38 - интегральный трансмембранный гликопротеин II типа. Антиген CD38 экспрессирован на 99% СD34+ -клеток костного мозга. Популяция СD34+ -, CD38+ -клеток может не содержать других дифференцировочных антигенов. Предполагается, что CD34+-, СD38-клетки являются примитивными стволовыми клетками, по мере снижения интенсивности экспрессии антигена CD34 возрастает экспрессия антигена CD38. Этот антиген экспрессируется также на активированных Т- и В-лимфоцитах, НК-клетках, моноцитах, плазматических клетках и медуллярных тимоцитах. Появление антигена CD38 зависит от дифференцировки и активации клеток. Так, CD38 присутствует на ранних стадиях В-клеточного онтогенеза, исчезает в процессе созревания В-лимфоцитов и снова появляется на последней стадии дифференцировки плазматических клеток. Подобно этому экспрессируется на лимфоидных клетках Т-линии. Большинство покоящихся зрелых лимфоцитов обеих линий этот антиген не содержат. HLA-DR - один из антигенов гистосовместимости II класса, экспрессирован на всех стадиях дифференцировки В-клеток, кроме плазматических, а также на моноцитах, макрофагах и активированных Т-лимфоцитах. Он представлен также на определенной стадии незрелых миелоидных клеток. Примитивные гемопоэтические предшественники экспрессируют CD34, но не содержат антиген HLA-DR, тогда как более дифференцированные предшественники экспрессируют как CD34, так и HLA-DR. В нормальной дифференцировке миелоидных клеток HLA-DR отсутствует на более зрелых клетках гранулоцитарного ростка, начиная с промиелоцитов. По-видимому, отсутствие HLA-DR может учитываться наряду с морфоцитохимическими характеристиками для установления группы наиболее дифференцированных острых миелоидныx лейкозов. Линейно-ассоциированные и дифференцировочные антигены CD45 - общелейкоцитарный антиген, т. е. антиген, представленный на мембране всех лейкоцитов человека. Уровень экспрессии CD45 нарастает по мере дифференцировки гемопоэтических клеток от незрелых предшественников до форм. Молекула CD45 слабо экспрессируется на всех клетках пула стволовых гемопоэтических клеток, максимальные уровни характерны для зрелых лимфоцитов, промежуточные уровни экспрессии демонстрируют миелоидные клеточные элементы. Различия в уровнях экспрессии антигена CD45 на гемопоэтических клетках широко используются при цитофлюориметрическом анализе клеток при острых лейкозах, позволяя точно разграничить гейт бластных клеток. Существуют три изоформы CD45 (RO, RA, RB). CD45RA - выявляется на наивных Т-клетках, CD45RO - на Т-клетках памяти. CD71 - антиген, известный как рецептор трансферрина, представлен на клетках с высокой пролиферативной активностью, экспрессируется активированными Т- и В-лимфоцитами, макрофагами и эритробластами. Он коэкспрессирован с антигеном CD34 на некоторой части клеток костного мозга, что доказывает наличие его экспрессии на стволовой клетке. Высокий уро-вень экспрессии CD71 характерен для эритроидных клеток-предшественников. Он имеет значение в обмене железа и клеточном росте. CD10 - нейтральная эндопептидаза, традиционно обозначается как «общий острой лимфобластной лейкемии антиген» (Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen - CALLA). Он экспрессирован на клетках, включая ранние Т- и В-клетки-предшественники, активированные и пролиферирующие В-клетки, а также на зрелых нейтрофилах, эндотелиальных клетках и стромальных клетках костного мозга. Предполагается его роль в процессе В-клеточного развития. Ранее экспрессия CD10 рассматривалась как признак «лимфоидности». Впоследствии было установлено, что CD10 является дифференцировочным антигеном миелоидных клеток и присутствует также на зрелых гранулоцитах. CD19 - интегральный мембранный гликопротеин II типа из суперсемейства иммуноглобулинов. Присутствует на всех В-клетках, включая предшественники, утрачивается на плазматических клетках. Он также присутствует на фолликулярных дендритных клетках, незрелых клетках миеломоноцитарного ряда. Экспрессия CD 19 отсутствует на нормальных Т-лимфоцитах, НК-клетках, моноцитах и гранулоцитах. Функция CD 19 - участие в В-клеточном развитии, активации и дифференцировке. CD20 - антиген В-лимфоцитов, фолликулярных дендритических клеток. CD22 - трансмембранный гликопротеин из суперсемейства иммуноглобулинов. Он экспрессирован в цитоплазме предшественников В-клеток и на мембране зрелых В-лимфоцитов. Его экспрессия исчезает после активации В-клеток, предшествующей стадии плазматической клетки, он отсутствует на Т-лимфоцитах крови, гранулоцитах, моноцитах. Этот антиген является посредником адгезии к эритроцитам, Т- и В-клеткам, моноцитам и нейтрофилам. CD23 - низкоаффинный рецептор IgE. В слабой степени экспрессирован на зрелых В-лимфоцитах. Высокий уровень характерен для фолликулярных дендритных клеток и особенно для трансформированных вирусом Эпштейна-Барра В-лимфобластов. Для В-клеток CD23 является маркером дифференцировки, который утрачивается иммуноглобулинсекретирующими клетками. CD23 также экспрессируется на моноцитах, гранулоцитах, тромбоцитах, Т-лимфоцитах, клетках Лангерганса. СD1а - мембранный гликопротеин, экспрессирован главным образом на кортикальных тимоцитах, клетках Лангерганса, интердигитирующих клетках и на части В-клеток. Существуют его различные изотипы: CDla, -b, -с, -d, -e. Его функция состоит в пептидной презентации (CD1d), липидной презентации (CDlb), взаимодействии с CD4- и СD8-клетками. CD2 - мономерный гликопротеин, ранее описанный как рецептор для эритроцитов барана розеткообразующих Т-клеток. Он присутствует на тимоцитах, большинстве зрелых Т-лимфоцитов, большом числе НК-клеток. CD3 - это комплекс из 5 различных полипептидных цепей. CD3 - часть большего комплекса, который включает Т-клеточный рецептор (TCR). Он присутствует на зрелых Т-клетках и тимоцитах. Его функция состоит в активации и функционировании Т-клеток. CD4 - трансмембранный гликопротеин. Экспрессирован на Т-лимфоцитах-хелперах, моноцитах, хотя плотность распределения ниже, чем на CD4+-лимфоцитах. СD4+-лимфоциты активируют индукцию и «помогают» в синтезе иммуноглобулинов В-клетками. CD5 - простая цепь трансмембранного гликопротеина, обнаруживается на.зрелых Т-лимфоцитах, тимоцитах, его нет на гранулоцитах и моноцитах. Основная функция - Т-клеточная костимуляция, активация тимоцитов, пролиферация, секреция ИЛ-2 и увеличение концентрации Са2+. CD5 обнаружен также на субпопуляции зрелых В-клеток. CD7 - трансмембранный гликопротеин, обнаружен на зрелых Т-лимфоцитах и их предшественниках, а также на большинстве НК-, пре-В-лимфоцитаx. Зрелые В-лимфоциты и гранулоциты его не содержат. Функциональная роль CD7 - сигнальная трансдукция. Приводятся доказательства коэкспрессии антигена CD7 и CD34 на стволовой клетке. Выявлена экспрессия CD7 на бластных клетках при ОМЛ, что является неблагоприятным прогностическим фактором. Его экспрессия на лейкемических клетках ОМЛ в сочетании с CD34, вероятно, свидетельствует о ранних стадиях дифференцировки. CD8 - дисульфидно-связанный димер. Экспрессируется на субпопуляции цитотоксических Т-лимфоцитов, субпопуляции НК-клеток (экспрессия слабая), на большинстве тимоцитов, которые часто коэкспрессируют CD4, на некоторых дендритических клетках. СD16 - низкоаффинный IgG-рецептор, состоящий из двух изоформ, одна из которых экспрессируется на НК-клетках, моноцитах, макрофагах, а другая - в основном на нейтрофилах. Он является активатором рецептора для НК-клеток и медиатором антителозависимой цитотоксичности. CD11b - один из рецепторов адгезии, экспрессирован на гранулоцитах, моноцитах, макрофагах, НК-клетках и СD8+-субпопуляции Т-лимфоцитов. CD13 - трансмембранный гликопротеин. Он присутствует в крови на большинстве клеток миелоидного ряда, включая нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и моноциты, а также на их предшественниках, его нет на Т- и В-лимфоцитах, тромбоцитах и эритроидных клетках. CD14 - мембранный гликопротеин, функционирует как высокоаффинный рецептор для липополисахаридного и липополисахарид-связывающего протеин-комплекса на гранулоцитах и моноцитах/макрофагах. Обнаружена сильная экспрессия на моноцитах/макрофагах и слабая - на нейтрофилах. Он также слабо экспрессирован на В-лимфоцитах, но его нет на Т-лимфоцитах, НК-клетках, тромбоцитах и эритроцитах. CD14 выявлен на клетках Лангерганса, фолликулярных дендритических клетках и гистиоцитах. CD15 - антиген, экспрессирующийся на моноцитах, гранулоцитах и их предшественниках, на клетках Лангерганса. Березовского-Штернберга, множестве опухолевых клеток. CD33 - панмиелоидный маркер, а также маркер большинства моноцитов/макрофагов. Он экспрессирован на нормальных коммитированных клетках-предшественниках миелоидной линии, но его нет на полипотентной стволовой клетке, его экспрессия усиливается по мере дифференцировки клеток. Функция этого антигена в миелоидных клетках неизвестна. CD42a - антиген, который формирует комплекс с антигеном CD42b. Этот комплекс является рецептором для фактора Виллебранда и тромбина, способствует адгезии тромбоцитов и агрегации на участках сосудистых повреждений. Он обнаруживается на тромбоцитах и мегакариоцитах. CD61 - тромбоцитарный гликопротеин GPIIIa, экспрессируется на тромбоцитах и мегакариоцитах, способствует агрегации тромбоцитов, является рецептором для фактора Виллебранда. CD79a - б-цепь В-клеточного рецептора. Экспрессирован на всех стадиях дифференцировки В-лимфоцитов, включая плазматические клетки, когда антиген локализуется внутри клетки. CD79b - в-цепь В-клеточного рецептора. Экспрессируется на В-клеточной линии позже, чем CD79a, поэтому бластные клетки про-В-ОЛЛ и common-ОЛЛ CD79b - негативны. Отмечается низкая его экспрессия при ХЛЛ и волосатоклеточном лейкозе. CD117 - трансмембранный гликопротеин (c-kit), рецептор для фактора роста стволовых клеток, экспрессирован на миелоидных клетках-предшественниках. Обладает большей специфичностью для клеток миелоидной линии по сравнению с CD13, CD33. CD138 (синдекан 1) - экспрессия специфична для плазматических клеток Лабораторная и инструментальная диагностика лейкозов Анализ крови Подозрение на лейкоз возникает при наличии клинических симптомов и следующих изменений периферической крови: нормохромная нормоцитарная анемия; количество лейкоцитов может быть различным - низким (ниже 5 109/л), нормальным (от 5 109/л до 20 109/л), повышенным (свыше 20 109/л, достигая в некоторых случаях 200 109/л); нейтропения (не зависит от общего количества лейкоцитов); абсолютный лимфоцитоз; тромбоцитопения (присутствует почти всегда); "лейкемический провал" - присутствие бластов, зрелых форм на фоне отсутствия промежуточных форм; при остром миелобластном лейкозе можно обнаружить азурофильные гранулы и палочки Ауэра. Пункция костного мозга Пункция костного мозга - основной метод исследования при лейкозах. Его применяют с целью подтверждения диагноза и идентификации (морфологической, иммунофенотипической, цитогенетической) типа лейкоза. Аспирация костного мозга может быть затруднена в связи с его обеднением (подавление гемопоэза) и увеличенным содержанием в нём волокнистых структур. Миелограмма (количественное определение всех клеточных форм костного мозга) при острых лейкозах: увеличение содержания бластных клеток более 5% и до тотального бластоза; морфология бластов различна в зависимости от типа лейкоза; увеличение промежуточных форм; лимфоцитоз; красный росток кроветворения угнетён (за исключением острого эритромиелоза); мегакариоциты отсутствуют или их количество незначительно (за исключением острого мегакариобластного лейкоза). Цитохимическое исследование - основной метод диагностики форм острых лейкозов. Его проводят с целью выявления специфических для различных бластов ферментов. Так, при OJUI определяется положительная ШИК-реакция на гликоген, отрицательная реакция на липиды, пероксидазу, хлорацетатэстеразу. При острых миелобластных лейкозах - положительная реакция на миелопероксидазу, липиды, хлорацетатэстеразу. ШИК-реакция зависит от формы острого миелоидного лейкоза. Иммунофенотипирование бластов проводят автоматизированным методом на проточном цитофлюориметре или иммуноферментным методом на стекле с использованием световой микроскопии. Последний имеет то преимущество, что его можно проводить параллельно с цитохимическим исследованием. Иммунофенотипирование позволяет определить с помощью моноклональных AT наличие или отсутствие кластеров дифференцировки бластных клеток (CD-маркёры). Его проведение в первую очередь необходимо для точной диагностики ОЛЛ, а также в трудных случаях дифференциальной диагностики острых лимфобластных и миелобластных лейкозов. Это принципиальный момент, поскольку лечение этих форм разное. Цитогенетическое исследование лейкозных клеток позволяет определить хромосомные аномалии и дальнейший прогноз. Другие обязательные первичные методы исследования Исследование ликвора. Повышенный цитоз за счёт бластов указывает на нейролейкемию. Рентгенологическое исследование органов грудной клетки: расширение тени средостения за счёт увеличения внутригрудных лимфатических узлов, лейкемиды в лёгких. Биохимический анализ крови, ЭКГ, эхокардиография, ЭЭГ необходимы для определения исходных показателей функций жизненно важных органов и проводятся перед началом и во время химиотерапии, поскольку применяемые цитостатики обладают кардиотоксичными, гепатотоксичными и нефротоксичными свойствами. УЗИ: увеличение печени и селезёнки, очаги лейкемоидной инфильтрации в паренхиматозных органах. |