П. Г. Демидова Кафедра органической и биологической химии А. С. Лебедев В. Ю. Орлов Лабораторный контроль лекарственных средств в соответствии с правилами glp и gmp учебнометодическое пособие
 Скачать 0.85 Mb.
|
|
Специфичность (specificity) Способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество при наличии сопутствующих компонентов. Изучение специфичности необходимо осуществлять в ходе валидации испытаний на идентификацию, примеси и количе- ственное определение (все типы методик). Процедуры подтвер- ждения специфичности зависят от целевого назначения аналити- ческой методики. Доказательство специфичности валидируемой методики обычно основывается на рассмотрении полученных с ее исполь- зованием данных анализа модельных смесей известного состава. Специфичность валидируемой методики может быть доказана также соответствующей статистической обработкой результатов анализов реальных объектов, выполненных с ее использованием, и, параллельно, с использованием другой, заведомо специфичной методики (специфичность которой доказана). Специфичность для различных видов испытаний означает следующее. 1. При испытании на идентификацию — подтверждение того, что методика позволяет идентифицировать именно опреде- ляемое вещество. 2. При испытании на примеси — подтверждение того, что методика позволяет правильно распознать примеси в образце (например, испытание на родственные соединения, тяжелые ме- таллы, содержание остаточных растворителей и т. д.). 3. При количественных испытаниях — подтверждение то- го, что методика позволяет установить содержание или актив- ность именно определяемого вещества в образце. Примеры тестов на специфичность: 1. Качественные реакции (не всегда высокая специфичность, часто требуется дополнительное подтверждение). 2. Определение физико-химических констант (в основном для субстанций): температура плавления, показатель преломле- ния, температура кипения (для растворителей), pH раствора, те- сты на растворимость и т. д. 15 3. Физико-химические методы: ИК-спектроскопия, УФ-спектроскопия (идентичность спектров, идентичность мак- симумов), ВЭЖХ (время удерживания, сигнальные отношения, соответствие спектральных характеристик) и т. д. Предел обнаружения методики (limit of detection) Наименьшее количество (концентрация) определяемого ве- щества в образце, которое может быть обнаружено (или прибли- женно оценено) с использованием валидируемой методики. Возможны различные подходы к определению предела обна- ружения в зависимости от того, является методика инструмен- тальной или неинструментальной. Выделяют визуальную оценку, оценку по соотношению «сигнал/шум», по стандартному откло- нению сигнала и наклону калибровочной кривой, по стандартно- му отклонению калибровочного раствора. Визуальная оценка может использоваться как для неинстру- ментальных, так и для инструментальных методик. Предел обна- ружения устанавливается путем анализа проб с известными кон- центрациями определяемого вещества и определения его мини- мального содержания, при котором оно достоверно обнаружива- ется (положительный контроль). Подход по соотношению «сигнал/шум» применим только к аналитическим методикам, для которых наблюдается шум базо- вой линии. Определение отношения «сигнал/шум» проводится методом сравнения сигналов, полученных от проб с известными низкими концентрациями, с сигналами, полученными от холо- стых проб, и установления минимальной концентрации, при ко- торой определяемое вещество может быть достоверно обнаруже- но. Для оценки предела обнаружения приемлемой считается ве- личина отношения «сигнал/шум» от 3:1 до 2:1. При оценке ПОМ (LOD) по наклону калибровочной кривой применяется следующая формула (1): 3.3* y S LOD b (1) S y — стандартное отклонение аналитического сигнала (ам- плитуда, площадь и т. д.); b — тангенс угла наклона калибровочной кривой. 16 Оценка ПОМ может проводиться и по стандартному откло- нению холостой пробы. При этом измеряется величина аналити- ческого сигнала для достаточного количества холостых проб и рассчитывается стандартное отклонение (2) их значений (S): 2 2 1 ( ) 1 n i i Y Y S S n (2) S 2 — выборочная дисперсия; n – 1 — число степеней свободы; Y i — действительное значение сигнала. При оценке ПОМ по стандартному отклонению калибровоч- ного раствора следует провести анализ одного и того же стан- дартного раствора 8–20 раз. Концентрация стандартного раствора должна соответствовать сигналу, который примерно в 5–20 раз больше уровня шума (лучше брать концентрации в большую сто- рону, нежели в меньшую), или самой маленькой концентрации калибровочного раствора. На основе полученной выборки вычис- ляется стандартное отклонение сигнала (S y ). Предел количественного определения (limit of quantification) Наименьшее количество вещества в образце, которое можно количественно определить с соответствующей прецизионностью и правильностью. Предел количественного определения является необходимой валидационной характеристикой методик, используемых для определения низких содержаний веществ в образце, в частно- сти для определения примесей и/или продуктов деградации. При оценке ПКО используются те же подходы, что и для ПОМ. При визуальной оценке проводят испытания образцов с раз- личными известными количествами (концентрациями) анализи- руемого вещества и устанавливают минимальное значение, при котором результат анализа может быть оценен визуально с требуемой правильностью и прецизионностью. Для оценки ПКО по соотношению «сигнал/шум» приемле- мой считается величина отношения 10:1. 17 При оценке ПКО (LOQ) по наклону калибровочной кривой применяется следующая формула (3): 10* y S LOQ b (3) Линейность методики (linearity) При валидации методики ее линейность в аналитической об- ласти проверяют экспериментально измерением аналитических сигналов для не менее чем 5 проб с различными количествами или концентрациями определяемого вещества (если проб меньше, то такой подход должен быть обоснован). В большинстве случаев используют линейные зависимости, отвечающие условию R XY ≥ 0.99 (R XY — коэффициент корреляции Пирсона), и только при анализе следовых количеств допускается рассматривать линейные зависимости, для которых R XY ≥ 0.90. По полученным данным строят график зависимости сигнала от концентрации или от количества определяемого компонента и визуально оценивают его линейность (прикидочное суждение). Если линейная зависимость наблюдается, то результаты обраба- тывают подходящим статистическим методом, например мето- дом наименьших квадратов. Аналитическая область методики (range) Интервал между верхним и нижним значением аналитиче- ских характеристик определяемого компонента в объекте анализа (его количества, концентрации, активности и т. п.). В этом интер- вале результаты, получаемые с использованием валидируемой методики, должны иметь приемлемый уровень правильности и прецизионности. Диапазон применения методики зависит от ее назначения и определяется при изучении линейности. Минимально допустимые диапазоны применения методик: 1. Для количественного определения активной субстанции или готового лекарственного препарата: как правило, от 80 % до 120 % от номинального содержания. 2. Для однородности дозирования: от 70 % до 130 % от но- минального содержания, если для испытания не требуется более широкий интервал, обусловленный свойствами лекарственной формы (например, дозированные ингаляторы). 18 3. Для испытаний на растворение: ± 20 % (абсолютных) от нормируемой величины высвобождения. Например, если при контроле высвобождения пролонгированных лекарственных препаратов нормируемая величина высвобождения составляет от 20 % за первый час и до 90 % за 24 ч, то диапазон применения должен быть от 0 % до 110 % от номинального содержания. 4. Для определения примесей: от концентрации, в которой примесь обычно обнаруживается (или от ПКО), до 120 % от нор- мируемого содержания. Правильность (trueness) Правильность методики характеризуется отклонением сред- него результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное. Валидируемая методика признается правильной, если значения, принимаемые за истин- ные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике. Правильность должна быть установлена для всего диапазона применения аналитической методики. Для оценки правильности методик количественного опреде- ления применимы следующие подходы: 1. Анализ с использованием валидируемой методики стан- дартных образцов или модельных смесей с известным содер- жанием (концентрацией) определяемого вещества. 2. Сравнение результатов, полученных с использованием валидируемой методики и образцовой методики, правильность которой ранее установлена. 3. Использование метода стандартной добавки (внесение в образец известного количества или концентрации вещества). 4. Рассмотрение результатов изучения линейности валидиру- емой методики: если свободный член (интерсепт) в линейной модели аппроксимации статистически достоверно не отлича- ется от нуля, то использование такой методики дает резуль- таты, свободные от систематической ошибки. Правильность оценивают не менее чем для девяти определений для трех различных концентраций, охватывающих весь диапазон применения, т.е. три концентрации и три повтора для каждой концентрации, при этом должны проводиться все стадии методики. 19 Прецизионность (precision) Степень близости друг к другу независимых результатов изме- рений, полученных в конкретных регламентированных условиях (степень рассеивания результатов относительно среднего значения). Выделяют: повторяемость, промежуточную прецизионность и воспроизводимость. Повторяемость (сходимость) — характеристика прецизион- ности в условиях минимального варьирования влияющих факто- ров внутри лаборатории (тот же образец, тот же оператор, то же оборудование и реактивы, короткий промежуток времени). Воспроизводимость — характеристика прецизионности, ис- пользуемая для характеристики рассеяния результатов в условиях межлабораторного эксперимента (тот же образец, разные опера- торы, разное оборудование и реактивы). Повторяемость и вос- производимость являются крайними случаями прецизионности и отвечают минимальной и максимальной вариативности условий эксперимента. Также выделяют внутрилабораторную воспроизводимость (промежуточную прецизионность, внутрилабораторную прецизи- онность). Промежуточная прецизионность подразумевает выполнение серии анализов одного и того же образца, в одной лаборатории при вариации различных факторов: разное время анализа, разные операторы, разные партии реактивов одного и того же вещества, разные приборы и т. п. Результаты оценки методики анализа по каждому из вариан- тов прецизионности обычно характеризуются соответствующим значением величины стандартного отклонения результата от- дельного определения. Обычно при разработке оригинальной методики определяет- ся повторяемость (сходимость) результатов, получаемых с ее ис- пользованием. При необходимости включения разработанной ме- тодики в нормативную документацию дополнительно определя- ется ее внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность. Межлабораторная прецизионность (воспроизводимость) методи- ки оценивается при предполагаемом ее включении в проект об- щей фармакопейной статьи или в нормативную документацию на фармакопейные стандартные образцы. 20 Устойчивость (robustness) Способность сохранять найденные для нее в оптимальных (номинальных) условиях характеристики, приведенные в табли- це, при вероятных небольших отклонениях от этих условий про- ведения анализа. Устойчивость должна изучаться только в тех случаях, когда валидируемая методика основана на использовании особо чув- ствительных к внешним условиям методов анализа, таких как различные виды хроматографии (ВЭЖХ, ВЭКЭ, ГХ) и функцио- нального анализа. При необходимости оценка устойчивости ме- тодики проводится на стадии ее разработки. Если вероятна невы- сокая устойчивость методики, проверка ее пригодности осу- ществляется в обязательном порядке непосредственно в процессе практического использования. Примеры типичных изменений: 1. Стабильность растворов, используемых в аналитических методиках. 2. Время экстрагирования. Для ВЭЖХ: 1. Изменение рН подвижной фазы. 2. Изменение состава и силы подвижной фазы. 3. Разные колонки (разные серии и поставщики). 4. Температура. 5. Скорость потока и т. д. Для газовой хроматографии: 1. Различные колонки (разные серии и поставщики). 2. Температура термостата. 3. Скорость газа-носителя и т. п. В ряде случаев для методик, системы или процесса требуется проводить повторную валидацию (ревалидацию). Ревалидация может быть необходима в следующих случаях (при этом ими не ограничивается): • изменение схемы синтеза фармацевтической субстанции; • изменение состава лекарственного препарата; • изменение аналитической методики. Повторная валидация не проводится, если производителем представлено соответствующее обоснование. Объем повторной валидации зависит от характера внесенных изменений. 21 ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ Лабораторная работа 1 1.1. Идентификация ароматических карбоновых кислот при помощи качественных реакций Цель работы: установить присутствие ароматической кар- боновой кислоты в испытуемом растворе. Реактивы: растворы бензойной (c = 500 мг/л), 4-гидрокси- бензойной (c = 500 мг/л), салициловой (c = 500 мг/л) кислот, рас- твор хлорида железа(III) 6-водного (FeCl 3 *6H 2 O; c = 1 г/л), гид- роокись натрия (NaOH; ω = 15 %). Оборудование: пипетки, пипет-дозаторы, пробирки, штатив для пробирок, пузырьки объемом 10 мл, термометры, термостой- кие химические стаканы, бюксы, мерные колбы на 100 мл, водя- ная баня, электроплитка, шпатели, аналитические весы. Ход работы Приготовление растворов ароматических кислот 500 мг/л Дистиллированная вода предварительно подогревается до ки- пения. На аналитических весах взвешивают 100 мг ароматиче- ской кислоты. Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл сначала при помощи 5 мл ДМФА и 0.25 мл NaOH (ω = 15 %), а затем при помощи горячей дистиллированной воды (t = 70–90 o C). Раствор до метки не доводят. При необходи- мости раствор можно нагреть до растворения осадка на водяной бане или в токе горячей водопроводной воды. Раствор доводят до метки дистиллированной водой, перед этим раствор охлажда- ют до комнатной температуры. Приготовление раствора железа (III) 6-водного хлористого 1 г/л На аналитических весах взвешивают 100 мг FeCl 3 *6H 2 O. Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл при помощи дистиллированной воды. Объем до метки до- водят дистиллированной водой. 22 Приготовление раствора сравнения В пустую пробирку или пузырек последовательно приливают 3 мл дистиллированной воды, а затем 3 мл раствора FeCl 3 *6H 2 O (c = 1 г/л). Полученный раствор перемешивают. Определение ароматических кислот В каждую из трех пробирок (или пузырьков) вносят последо- вательно 3 мл раствора FeCl 3 *6H 2 O (c = 1 г/л) и 3 мл ароматиче- ской кислоты Полученные растворы перемешивают. В случае прозрачного раствора к нему добавляют еще 3 мл ранее вносимой ароматической кислоты или ждут 5–7 минут. Наблюдают за из- менением окраски растворов. Определяют, в какой пробирке находится бензойная, 4-гидроксибензойная и салициловая кисло- ты. При оформлении работы необходимо объяснить протекание соответствующих реакций, нарисовать схемы превращений. Контрольные вопросы 1. Для чего проводится добавление ДМФА? Почему ДМФА нужно вносить вначале? 2. В каких случаях было отмечено визуальное протекание ре- акций? Что за реакции вы наблюдали в ходе работы? 3. Что является лигандом и комплексообразователем при про- текании реакций с ароматическими карбоновыми кислотами? 4. Почему 4-гидроксибензойная кислота не образует ком- плексное соединение того же или схожего цвета, что и салицило- вая кислота? 5. Что такое монодентатные и полидентатные лиганды? При- ведите примеры лигандов и соединений. 6. Что такое хелаты? 7. Для чего нужен отрицательный контроль? 8. Покажите комплексообразователь, лиганд, внешнюю и внутреннюю сферы; назовите координационное число указан- ных преподавателем комплексных соединений. 1.2. Получение раствора Люголя Цель работы: получить раствор Люголя (водорастворимый йод). 23 Реактивы: иодид калия (KI, сух.), йод кристаллический (I 2 , сух.). Оборудование: весы, шпатели, пипетки, пробирки, штатив для пробирок, пузырьки объемом 10 мл. Ход работы В две пробирки или в пузырьки вносят по маленькому кристал- лу йода. Затем приливают 5–10 мл дистиллированной воды. В одну из пробирок внести на кончике шпателя иодид калия. Отметить по- лученные изменения. Объяснить суть проведенных операций. Контрольные вопросы 1. Почему йод плохо растворяется в воде? 2. Что происходит, когда к водному раствору йода добавляют иодид калия? 3. В каких сферах применяется водорастворимый йод? Лабораторная работа 2 2.1. Обнаружение салициловой кислоты в аспирине Цель работы: установить наличие или отсутствие салицило- вой кислоты в фармацевтическом препарате «Аспирин». Реактивы: таблетки «Аспирин», салициловая кислота (сух.), раствор хлорида железа(III) 6-водного (FeCl 3 *6H 2 O; c = 2.5 г/л), ДМФА, ацетон. |