микра экзамен. Перечень экзаменационных вопросов
 Скачать 295.74 Kb.
|
|
Люминесцентная, «темнопольная», фазово-контрастная, электронная микроскопия. Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции. Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид - или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе . Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлоеизображение объекта на темном фоне. Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители. Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.
Микроорганизмы используют питательные вещества для построение компонентов бактериальной стенки и для получения энергии. По характеру захвата пищи бактерии относятся к ОСМОФИЛАМ, т.е. питаются веществами, растворёнными в воде. Как и др мк .они нуждаются в большом кол-ве минеральных в-в (С, О, N, S, Р, Са, Fe и др). Основным источником углерода для б! могут служить неорг соед-я (чаще СО2), из которых мксинтезирует орг в-ва – это АУТО- или ФОТОТРОФЫ (синегнойная палочка). Если же мкнуждаются в орг соед-ях, к/е служат им источником углерода и азота, то их наз. ХЕМО- или ГЕТЕРОТРОФАМИ. В результате ассимиляции и окисления орг в-в (из прир соед-й чаще всего исп-ся полисахариды – крахмал, целлюлоза), выделяется азот.Помимо этих в-в, мк необходимы доп в-ва –факторы роста, к ним относится большое кол-во АК, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины. Они входят в состав микробной , но синтезировать их самостоятельно они не могут, поэтому факторы роста обязательно должны присутствовать в пит среде у некоторых б!!. Если мк нуждаются в факторах роста –АУКСОТРОФЫ, если нет – ПРОТОТРОФЫ. Источником N и S для мк служат сульфаты, нитраты, карбонаты и др, к/е восстанавливаются до H2S и N2. Самый распространённый источник N –аммонийные соли (восстанавливаются до N2); т/же АК. Источником S явл H2S (в прир усл из него восст-ся S с участием Beggiatoa) и АК, содержащие S. Осн преградой на пути пит в-в явл мбна. Ч/знеё могут переноситься только те в-ва, для к/х есть спец транспортная система. Существует несколько типов транспорта веществ: ПРОСТ ДИФФУЗИЯ – неспецифич проникновение в-в в , зависит от размеров и липофильности молеклы. ОБЛЕГЧЁННАЯ ДИФ-Я – по градиенту конц (без затрат эн) с помощью ферментов СУБСТРАТСПЕЦИФИЧНЫХ ПЕРМЕАЗ или ТРАНСЛОКАЗ. АКТИВНЫЙ ТРАНСПОРТ – с затратой энергии и при участии спец ферментов, против градента конц. ТРАНСЛОКАЦИЯ ГРУПП – происходит перенос и трансформация молекулы: глюкоза → глюкозо-6-фосфат
Дыхание, или биологическое окисление, основано на окислительно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление — присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным). Анаэробиоз (от греч. аег — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии свободного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения. По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязательные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы
В процессе обмена в-в мк. постоянно нуждаются в притоке энергии. Она освобождается при ок-ии пит. в-в и в виде АТФ исп-ся клеткой. Сущность ок-я закл-ся в переносе электронов и протонов от донора к акцептору. У мк чаще происходит отщепление 2 атомов Н (дегидрирование) от акцептора при участии ДГ. Биол ок-е может проходить как при участии О2, так и без него. По отношению к О2 выделяют следующие группы мк: 1) ОБЛИГАТНЫЕ АЭРОБЫ. Способны плч энергию путём дыхания. Причём обязательно нуждаются в О2, который используют в качестве конечного акцептора водорода. 2) ОБЛИГАТНЫЕ АНАЭРОБЫ. Процессы биол ок-я протекают у них по типу брожения, а расти и размножаться они могут только в бескислородных условиях, в присутствии О2 гибнут. Конечным акцептором водорода являются орг соед-я – чаще всего восстанавливается ПВК. 3) ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ АНАЭРОБЫ. Могут расти и размножаться и в присутствии и в отсутствии О2, т.к. их ферментная система способна переключаться с одного типа дыхания на другой. 4) МИКРОАЭРОФИЛЫ. Лучше растут при низком содержании О2 и повышенном СО2 («капнофильные мк»). 5) АЭРОТОЛЕРАНТНЫЕ. Могут выживать в присутствии атмосферного кислорода, но не могут использовать его в качестве конечного акцептора водорода (например, молочнокислые бактерии –бродильный метаболизм).Т.о, факультативные анаэробы выращивают при пониженном содержании кислорода, облигатные –при полном его отсутствии, что достигается путем посеваматериалов внутрь жидкой или полутвердой питательной среды
Методы культивирования анаэробов. Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов. Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается: 1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества; 2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред; 3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы; 4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом. В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта — Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов. Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерилные трубки Виньяль — Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде. Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов — анаэроста-тов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса. Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона. Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S204. Биологические методы. Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratiamarcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем. Комбинированные методы. Основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.). Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав. По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными. По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические. К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий. Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде и т. д. Дифференциально-диагностическиепитательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов. Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов. В последние годы в целях экономии питательных сред и ускоренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так называемые микротест-системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях. Требования, предъявляемые к питательным средам. Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.
Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом. Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронного микроскопа, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Форма вирионов может быть различной:
Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы. Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид. Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок. Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спиральный, икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии. Икосаэдрическийтип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спиральныйтип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа). |