Тема 5 (теория) (1). Питательные среды. Техника посевов. Действие физических, химических и биологических факторов на микроорганизмы
 Скачать 408.54 Kb.
|
|
ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. ТЕХНИКА ПОСЕВОВ. ДЕЙСТВИЕ ФИЗИЧЕСКИХ, ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ. АСЕПТИКА, АНТИСЕПТИКА, ДЕЗИНФЕКЦИЯ, СТЕРИЛИЗАЦИЯ. Теория занятия Питание бактерий Под питанием понимают процессы поступления в клетку и выведения питательных веществ из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки. Особенности питания бактерий: 1. питательные вещества поступают по всей поверхности клетки. 2. быстрота обменных процессов. 3. высокая адаптация к условиям внешней среды. Среди необходимых питательных веществ выделяют органогены– это восемь химических элементов, концентрация которых в бактериальной клетке превосходит 10 4 моль. К ним относят углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций. Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор. Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ. В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на: 1) аутотрофы (используют неорганические вещества – СО 2 ); 2) гетеротрофы; 3) метатрофы (используют органические вещества неживой природы); 4) паратрофы (используют органические вещества живой природы). Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки. По источникам энергии микроорганизмы делят на: 1) фототрофы (способны использовать солнечную энергию); 2) хемотрофы (получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций); 3) хемолитотрофы (используют неорганические соединения); 4) хемоорганотрофы (используют органические вещества). Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост. Среди бактерий выделяют: 1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества из низкоорганизованных); 2) ауксотрофы (являются мутантами прототрофов, потерявшими гены; ответственны за синтез некоторых веществ – витаминов, аминокислот, поэтому нуждаются в этих веществах в готовом виде). Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений. Метаболиты и ионы поступают в микробную клетку различными путями. Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку. 1. Пассивный транспорт(без энергетических затрат): 1) простая диффузия; 2)облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков). 2. Активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны). Встречаются модифицированные варианты активного транспорта – перенос химических групп. В роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией. Метаболизм бактериальной клетки Особенности метаболизма у бактерий: 1) многообразие используемых субстратов; 2) интенсивность процессов метаболизма; 3) направленность всех процессов метаболизма на обеспечение процессов размножения; 4) преобладание процессов распада над процессами синтеза; 5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма. В процессе метаболизма выделяют два вида обмена: 1) пластический (конструктивный): а) Анаболизм (с затратами энергии); б) Катаболизм (с выделением энергии); 2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах): а) дыхание (с участием кислорода); б) брожение (без участия кислорода). ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах, поэтому питательная среда должна содержать все вещества, необходимые для их роста. Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. Питательная среда — вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов. Питательные среды служат основой бактериологических работ, нередко определяя своим качеством результаты исследования. Они необходимы для выделения из исследуемого материала чистых культур возбудителя и изучения их свойств ( культуральных, биохимических, подвижности и др.). КЛАССИФИКАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД 1.По консистенции (степени плотности): – жидкие – полужидкие – плотные Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым прибавляют уплотнители или клеевые вещества. Чаще используют агар-агар или желатин. Агар-агар (по-малайски – желе) - полисахарид, продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80-86°С, застудневает при 36-40°С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать патогенные микробы при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин – вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32 - 34°С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество - при их росте среда разжижается. Кроме того, в качестве плотных сред применяют свёрнутую сыворотку крови, свёрнутые яйца, картофель, среды с селикагелем. 2. По назначению: – основные (общие)- служат для культивирования большинства патогенных микробов и являются основой для приготовления специальных сред. МПБ, МПА, пептонная вода. – специальные- служат для выделения и выращивания того или иного вида микроорганизмов, не растущих на простых средах. Среди специальных выделяют: – элективные (избирательные) - служат для выделения определённого вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов, это достигается путём добавления факторов элективности – различных веществ : определённых антибиотиков, солей, изменения pH. – жидкие элективные среды называют средами накопления (обогащения),используются для облегчения выделения чистой культуры возбудителя в том случае, когда возбудителя заведомо мало в материале. – элективно-диффреренциальные – содержат элективный фактор и компоненты, позволяющие определить какой-либо дифференциальный (отличительный) признак выделенной культуры. Например: ЖСА, где повышенная концентрация соли - это элективный фактов, а желток куриного яйца позволяет определить наличие фермента лецитиназы – дифференциальный признак патогенного стафилококка. – дифференциально-диагностические- позволяют отличить один вид микробов от другого по ферментативной активности. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом: · Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д. · Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами. · Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов. · Среды для определения редуцирующей способности микробов. – консервирующие – предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка. 3. По происхождению. – натуральные (естественные) среды- готовят из продуктов животного и растительного происхождения (мясо, костная и рыбная мука, кормовые дрожжи, сгустки крови и др.) – синтетические среды- готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде. Требования к питательным средам 1. Содержать необходимые для питания микроорганизма вещества - быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. В состав сред, применяемых для выращивания бактерий должны входить: А. необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород – органогены. Б. минеральные соли - неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу натрий, магний, железо. В. микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Г. факторы роста, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др. 2. иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - pH, т.к. только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (pH 7,2-7,4). 3. Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили pH, среды должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена. 4. быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальная среда, соответствующая физиологической концентрации NaCl. 5. плотные среды должны быть влажнымии иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса. Потребность в Н2 и О2 бактерии удовлетворяют за счет поступающей в клетку воды. 6. обладать определённым окислительно-восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом rH2. Например, анаэробы размножаются при rH2 не выше 5, а аэробы - при rH2 не ниже 10. 7. быть по возможности унифицированными, т.е. содержать постоянное количество отдельных ингредиентов. 8. желательно, чтобы среды были прозрачными - удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами. 9. быть стерильными, т.к. посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды. Условия культивирования микроорганизмов Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто не одинаковы. Активная кислотность среды (рН) имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растет при рН, близком к 7,0, напротив, микроскопические грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда следует определить значение рН. Значение рН сред может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до нужного, если это требуется, стерильными растворами кислоты или щелочи. В процессе культивирования микроорганизмов кислотность питательной среды часто меняется. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Поддержание определенного значения рН во время роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые образуют в процессе жизнедеятельности кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их числу относятся молочно-кислые бактерии, а также многие псевдомонады. Аэрация. Неодинаковые потребности микроорганизмов в свободном кислороде определяют различия и в способах их культивирования. Температура. Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируются. У мезофилов, к которым относится большинство известных бактерий, температурный оптимум лежит в интервале 25-37°С. У термофилов он значительно выше - от 45 до 80-90°С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5-10°С. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганизмов. Поэтому мезофильные микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая оптимальная температура. Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры. ДЕЙСТВИЕ ФИЗИЧЕСКИХ, ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ. Асептика – система мероприятий, предупреждающих попадание микроорганизмов из окружающей среды в ткани и полости человеческого организма при лечебных и диагностических манипуляциях, а также в материал для исследования, в питательные среды и культуры микроорганизмов при лабораторных исследованиях. Асептика использует прямые (стерилизацию, дезинфекцию, антисептику) и косвенные (разделительные меры) методы воздействия на микроорганизмы. Дезинфекция - это уничтожение, подавление или удаление микроорганизмов, которые могут вызвать заболевание. Различают физические, механические и химические методы дезинфекции. К физическим методам относится: высокая температура (действие горячей воды и насыщенного пара), УФ облучение, УЗ волны. Высокая температура Кипячение. Кипячение при 100ºC не менее 30 минут убивает все вегетативные формы и вирусы. Добавление 2% бикарбоната натрия может способствовать стерилизации, что не только убивает споры, но и способствует предупреждению коррозии и оседанию кальция на металлических поверхностях. Используется для дезинфекции предметных и покровных стекол, инструментов, игл и т.д. Водяная баня. Может быть использована при приготовление вакцин, из микроорганизмов, инактивированных на водяной бане при 60ºC в течение одного часа. Стирка или полоскание белья или столовые приборы на водяной бане при температуре от 70 до 80ºC в течение нескольких минут убивают большинство присутствующих в организме микроорганизмов. Пастеризация. Чаще всего применяют относительно продуктов питания и напитков (молоко, пиво, вино, соки). В настоящее время существуют: длительная низкотемпературная пастеризация LTLT (нагрев до 63ºC в течение 30 минут), кратковременная высокотемпературная пастеризация HTST (нагрев до 72ºC в течение 15-20 секунд с последующим быстрым охлаждением до 13ºC или ниже), ультрапастеризация (нагрев до 125-138°С в течение 2-4 секунд с последующим его охлаждением ниже 7°С ). Ультрафиолетовое облучение (УФО).Оказывает выраженное бактерицидное действие (длина волны 260-300 мкм) только на поверхностях или в прозрачных растворах. Используется для дезинфекции воздуха и поверхностей предметов, помещений, в т.ч. в лабораториях. Ультразвуковые волны. Обладает бактерицидным действием. Применяется для контаминации инструментов, жидких препаратов, а также для исследования микроорганизмов или в биотехнологического производства. Механические методы дезинфекции крайне неэффективны: проветривание, вентиляция, использование пылесоса. Химические методы включают в себя дезинфицирующие средства (дезинфектанты), вызывающие растворение липидов клеточных оболочек – детергенты, вызывающие разрушение белка или нуклеиновых кислот – денатураты, оксиданты. Эффективность использование дезинфектантов зависит от многих факторов: вида микроорганизма, температуры, pH, времени экспозиции, наличия органических веществ и др. Используют хлорсодержащие препараты(0,1- 10% раствор хлорной извести, 0,5-5% раствор хлорамина), окислители (перекись водорода 6%), фенолы (3-5% раствор фенола или карболовой кислоты), йод и йодофоры, соли тяжелых металлов, поверхностно-активные вещества, спирты, красители, кислоты (салициловая, борная), альдегиды и прочие для дезинфекции поверхностей предметов (стекло, пластмасса, резина, металл), помещений, рук медицинского персонала и всего, что не подходит для тепловой обработки. Стерилизация определяется как процесс, посредством которого изделие, поверхность или среда освобождаются от всех живых микроорганизмов как от вегетативных форм, так и от спор. Различают физические, механические и химические методы стерилизации. К механическим методам относится фильтрование, которое может быть применено для стерилизации жидкостей, биологических препаратов (сыворотки, лекарственные вещества). Фильтрование производят через специальные материалы, задерживающие микроорганизмы (бактерии, простейшие, грибы, многие вирусы). Фильтры могут быть керамическими, стеклянными, асбестовыми (фильтр Зейтца), мембранные (коллодийные) с разным диаметром пор в мембране. Физические методы стерилизации включают в себя: прокаливание, сухой жар, пар под давлением, воздействие излучения. Прокаливание. Производят в пламени спиртовке, газовой горелке. Прокаливают до красного каления бактериологические петли, мелкие металлические инструменты (иглы, петли). Стерилизация сухим жаром. Осуществление стерилизации производят в воздушных стерилизаторах (сухожаровой шкаф, печь Пастера) при разных режимах: 160°С - 120 мин, 200°С - 30 мин, 180°С - 40 мин.Стерилизации подвергается лабораторная посуда, изделия из стекла, инструменты, силиконовая резина и другие предметы, которые не теряют своих качеств при нагревании. Стерилизация паром под давлением (автоклавирование). На микроорганизмы и споры воздействуют высокая температура и пар под давлением и, как правило, время стерилизации уменьшается с повышением температуры кипения и атмосферного давления. Режимы: 120°С, 45 мин – 1 атм., 132°С, 20 мин – 2 атм. Стерилизации подвергаются питательные среды (МПБ, МПА), перевязочный материал, белье, коррозионно-устойчивые металлические инструменты, растворы, инфекционный материал и т. д. Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) является одной из разновидностей тепловой стерилизации. Процедура заключается в нагревании материала до 100°С в течение 30 мин (погибают вегетативные формы) и выдерживании в термостате (способствует прорастанию спор), повторяют в течение 3 дней. Используется для стерилизации питательных сред с углеводами, витаминами. Тиндализация (дробная стерилизация) также является видом дробной стерилизации. Осуществляют для стерилизации питательных сред, в том числе содержащих белки, при режимах: 70-80°С в течение 1 часа - 3 дня или 56-58°С в течение 1 часа – 5-6 дней подряд. Еще один из видов тепловой стерилизации являетсясверхвысокотемпературная обработка UHT (нагрев до 140-150ºC в течение 1-3 секунд с последующим охлаждением до 4-5°С). Гласперленовая стерилизация. Данный вид стерилизации заключается в нагревании стеклянных шариков до температуры 190-240°С, помещении материала, требующего обработки (мелкие инструменты), время экспозиции составляет 3-5 мин. Лучевая стерилизация проводится с использованием гамма-излучения либо ускоренных электронов. Применяется в случае стерилизации материалов, не выдерживающих тепловой обработки (как альтернатива газовой стерилизации). Химические методы стерилизации включают в себя стерилизацию химическими средствами или газами. Растворы химических средств обладают бактериоцидным действием (альдегид-, кислород- и хлорсодержащие), и способны при соблюдении определенных режимов воздействия и времени экспозиции (45-60 мин) обеспечить полное уничтожение микроорганизмов. Таким способом стерилизуются изделия из термолабильных материалов. Стерилизация газами (оксид этилена, смесь оксида этилена и бромистого метила 1:2,5, формальдегид, озон) проводится в присутствии пара при температуре 18-80°Св газовых стерилизаторах или паровых анаэростатах. |