Гибридизация клеточных линий. Метод гибридизации соматических клеток. Метод слияния протопластов. Основы и принципы селекции клеток, селективные среды. Получение новых культур в качестве целевых биотехнологических продуктов. Подготовила студентка 6 курса
3 группы медико-биологического факультета
Гонтарева А.В.
Гибридизация клеток — процесс искусственного слияния соматических клеток с образованием жизнеспособной гибридной клетки (гетерокариона, содержащего ядра обоих родительских типов) с последующим формированием от нее клеточной линии. - в гибридах могут проявиться оба генома;
- в долгоживущих межвидовых гибридах элиминируются хромосомы одного вида.
- Слияние клеток не обязательно должно быть чем-то стимулировано. Как in vivo, так и in vitro оно может проходить и без добавления специальных агентов (спонтанно, некоторые слияния происходят в процессе онтогенеза).
- В то же время нормальные клетки в естественных условиях крайне редко сливаются друг с другом. Исключение составляет процесс оплодотворения. В естественных условиях слияние клеток происходит и у млекопитающих. Например, клетки могут сливаться при формировании мышечных трубочек. Слияние опухолевых клеток - довольно обычное явление, при этом опухолевые клетки in vivo иногда сливаются и с нормальными. Эксперименты по спонтанному слиянию клеток проводились и in vitro. При проведении подобных экспериментов получают так называемых "химерных" или аллофеных мышей - животных, в тканях которых содержатся клетки различных генотипов.
1. Агрегационный
Из матки беременных самоки звлекают зародыши, достигшие стадии 8 бластомеров. Бластомеры, полученные от двух животных с различными генотипами (например, от мышей с белой и черной окраской шерсти) помещают в условия, способствующие их агрегации и образованию 16-ти клеточного зародыша. Такие составные зародыши развиваются in vitro до стадии бластоцисты, после чего их вводят в матку приемной матери, у которой предварительно вызывают ложную беременность путем введения соответствующих гормонов. В результате получаются аллофенные мышата. Когда у мышонка появляется шерсть, окраска у него оказывается не белой или черной, как у родителей, а смешанной, с чередующимися черными и белыми пятнами или полосами. Это доказывает, что ткани животных-химер мозаичны, т.е. состоят из "белых" и "черных" клеток. Внутренние ткани таких животных, естественно, также мозаичны, хотя это проявляется не так очевидно, как в случае окраски шерсти. Различия могут касаться белков, выполняющих ферментативную функцию: они могут катализировать одни и те же реакции у мышей-родителей, нуждаться в одних и тех же кофакторах, но при этом быть не идентичными, хотя и сходными (изоферменты). Агрегационные химеры можно получать не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Масса химерных эмбрионов не больше обычной и подвержена действию механизмов эмбриональной регуляции. Преимущество метода - не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике. 2. Инъекционный:
- Используются эмбрионы на стадии бластоцисты. Бластоцисту фиксируют и, используя микроманипуляторы, вводят путем инъекции клетки внутриклеточной массы бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона - рецепиента. Этим методом можно инъецировать не только внутриклеточную массу ранних эмбрионов, но и более дифференцированные клетки.
- Инъекционный метод нашел применение при получении межвидовых химер. Первые межвидовые химеры были получены между двумя ближайшими видами мышей, которые обычно не скрещиваются: M. muskulus и M. caroli. Причем было отмечено, что химерные эмбрионы, полученные инъекционным методом, нормально развивались только при пересадке их в матку того вида, чья бластоциста была использована в качестве рецепиента. Например, в бластоцисту M. muskulus вводили внутриклеточную массу эмбриона M. caroli. Полученные химеры имплантировались в матку M. muskulus и благополучно развивались там, а в организме M. caroli погибали спустя две недели.
Механизм слияния протопластов:
Протопласт — содержимое растительной или бактериальной клетки, за исключением внешней клеточной оболочки (клеточной стенки), однако вместе с клеточной (плазматической) мембраной.
- Первый этап слияния - сближение мембран соседних клеток и установление между ними тесного контакта. Мембраны должны быть приближены друг к другу на расстояние в несколько ангстрем так, чтобы между ними стали возможны взаимодействия, подобные гидрофобным связям.
- На втором этапе - выход гликопротеидов и обнажение липидных слоев мембраны.
- Третий этап - мицелизация обнажившихся липидов двух противолежащих мембран.
- Четвертый этап - слияние мембран.
Слияние протопластов:
Индуцированное
Химические реагенты
Физическое слияние
Биологические объекты
Спонтанное
Методы слияния протопластов:
Слияние при помощи электрического тока:
- Протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем.
- На электродах образуются агрегаты из 2 - 3 протопластов, либо цепочки из 5 - 6 протопластов между электродами.
- Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, т.к переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и протопласты в таких агрегатах сливаются.
- Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов. В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму.
- Постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт.
Методы слияния протопластов:
Методика «ПЭГ - высокие значения рН - высокая концентрация Са2+»
- дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 - 11, концентрация Са2+ 100 - 300 ммоль/л).
- В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция - их слияние.
- Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой.
Методы слияния протопластов:
Слияние вирусом Сендай:
- Преимущество вируса Сендай как сливающего агента заключается в полном отсутствии цитотоксического эффекта.
- Вирус перед употреблением инактивируют, облучая ультрафиолетовой лампой в течение 5 минут, при этом он теряет способность к размножению, но сохраняет способность сливать клетки.
- Вирус Сендей имеет два недостатка: - необходимость наращивать, титровать, концентрировать и инактивировать вирус; - клетки растений и грибов не имеют рецепторов к этому вирусу, поэтому он неприменим для их гибридизации.
Принципы селекции клеток:
Общая схема культивирования гибридных клеток:
- Получение гибридных клеток
- Культивирование в неселективных условиях
- Инкубация в селективных средах
- Отбор выживших клонов
- Проверка наличия заданных свойств
- Размножение полученных культур
Принципы селекции клеток:
Селективная среда — среда для культивирования клеток одного определенного генотипа и не пригодная для роста клеток других генотипов. Селективные среды получают добавлением в среду определенных химических веществ, которые при культивировании избирательно угнетают рост нежелательных типов животных или растительных клеток или микробов. Примером селективной среды может служить ГАТ-среда, состоящая из гипоксантина (Г), аминоптерина (А) и тимидина (Т), в которой выживают клетки с нормальными генами тимидинкиназы или гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, а клетки с мутациями в этих генах погибают. Применение:
- Сомаклональные варианты имеют практическое применение в сельскохозяйственной практике, в силу появления форм, отличающихся от родительских по различным биохимическим, качественным и количественным признакам, а также цитогенетическим характеристикам
- Получены сомаклоны картофеля сорта Зарево, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях протеина и крахмала.
- Для растений табака получен ы через каллусную культуру сомаклоны, устойчивые к вирусу табачной мозаики.
- В настоящее время метод культуры тканей начал широко использоваться в селекции не только кормовых и технических культур, но и декоративных и лекарственных растений.
|
Скачать 427.9 Kb.