БАВ. Природные биологически активные вещества
 Скачать 1.93 Mb.
|
|
Методы обнаружения сапонинов в ЛРС Для обнаружения сапонинов в ЛРС используются реакции, основанные на: 1. физических; 2. химических; 3. биологических свойствах этих веществ. Для качественных реакций на сапонины готовят водное извлечение из ЛРС (1:10) на кипящей водяной бане в течение 10 минут, после охлаждения и фильтрации проводят необходимые реакции. 1. Реакции, основанные на физических свойствах Реакция пенообразования: При встряхивании в пробирке водного извлечения образуется довольно устойчивая пена.  По пенообразованию ориентировочно определяется и групповая принадлежность сапонинов. Для проведения реакции водное извлечение из ЛРС делят на две части: первую подкисляют до рН=1, вторую подщелачивают до рН=13. Оба раствора в пробирках встряхивают. Наблюдают образование столбиков пены. Если в обеих пробирках образуется примерно равные по величине и стойкости столбики пены или в рпобирке с кислой средой, то сырье содержит тритерпеновые сапонины, если столбик пены больше при щелочном рН, то - стероидные. 2. Реакции, основанные на химических свойствах 1) Реакции осаждения: Из водных растворов сапонины осаждаются гидроксидом бария или магния, солями меди, ацетатом свинца, причем тритерпеновые сапонины осаждаются средним ацетатом свинца, а стероидные - основным. Из спиртовых извлечениий стероидные и тритерпеновые сапонины осаждаются спиртовым раствором холестерина в виде комплексов - холестеридов. 2) Цветные реакции: реакция Либермана-Бурхарда: сухой остаток растворяют в ледяной уксусной кислоте и добавляют смесь уксусного ангидрида с концентрированной серной кислотой (50:1). Наблюдают розовое окрашивание, переходящее в зеленое, а затем в синее; реакция с 10% раствором нитрита натрия и концентрированной серной кислотой, наблюдают кроваво-красное окрашивание; реакция Лафона: к водному извлечению прибавляют конц. H2SO4 и этиловый спирт (в равных объемах), затем прибавляют каплю раствора сернокислого железа. При нагревании появляется сине-зеленое окрашивание; реакция с серной кислотой: к извлечению прибавляют равный объем хлороформа и 6-8 капель концентрированной серной кислоты. Наблюдают окрашивание нижнего хлороформного слоя в желтый цвет. стероидные сапонины можно отличить по реакции Санье: с 1% раствором сурьмы трёххлористой, кислотой конц. серной, содержащей уксусный ангидрид, образуется жёлтое окрашивание. 3. Реакция, основанная на биологических свойствах Реакция гемолиза эритроцитов: Для проведения этой реакции используют эритроциты крови разных животных. Присутствие холестерина в плазме крови может задерживать гемолиз, поэтому кровь необходимо дефибринировать. Концентрация водородных ионов среды оказывает существенное влияние на гемолиз. Учитывая это, готовят: 1% извлечение из ЛРС и 2% взвесь эритроцитов на физиологическом растворе (или на буферной смеси фосфатов с pH=7,4). Смешивают равные объемы извлечения из ЛРС и взвеси эритроцитов, через некоторое время кровь становится прозрачной, ярко-красной (произошел гемолиз). 4. Хроматография Для обнаружения сапонинов в ЛРС широко используют тонкослойную хроматографию на силикагеле в системе растворителей ХЛОРОФОРМ-МЕТАНОЛ-ВОДА (65:35:10). Для обнаружения зон сорбции сапонинов на хроматограммах используют следующие реактивы: пары йода - бурые пятна на желтом фоне; насыщенный раствор треххлористой сурьмы в хлороформе с последующим нагреванием при 90-100°С - розово-фиолетовые пятна; спиртовый раствор фосфорно-молибденовой кислоты - синие пятна на желтом или желто-зеленом фоне (окраска фона снимается парами аммиака); спиртовым раствором кремне-вольфрамовой кислоты с последующим нагреванием при 100-120°С - розовые, оранжевые, красные, фиолетовые, серые и др. пятна на бесцветном фоне; реактив Санье (5% спиртовый раствор ванилина) с нагреванием при 110°С и последующей обработкой 50% водным раствором серной кислоты - спиростаноловые сапонины проявляются в виде желтых пятен, фуростаноловые - зеленых; реактив Эрлиха (спиртовый раствор п-диметиламинобензальдегида с добавлением концентрированной HCl) - фуростаноловые сапонины проявляются в виде пятен розового или красного цвета; для обнаружения тритерпеновых сапонинов хроматограмму обрабатывают 20% раствором серной кислоты, нагревают в сушильном шкафу при температуре 115-120°С в течение 15 мин - появляются фиолетовые пятна. Количественное определение сапонинов в ЛРС Долгое время основными методами определения тритерпеновых сапонинов в ЛРС являлось определение гемолитического индекса, пенного числа и токсичности для холоднокровных животных. Результаты этих методов нельзя сравнить, т.к. пенообразование и гемолитические свойства не коррелируют друг с другом. Они не дают представления о процентном содержании сапонинов в сырье и в настоящее время не используются. Использовавшиеся гравиметрические методы, основанные на образовании их комплексов с гидроксидом бария, солями меди, свинца, холестерином, а также осаждении малополярными растворителями, дают завышенные результаты и малоспецифичны. В настоящее время используют физико-химические методы. Они основаны на сочетании хроматографического разделения сапонинов с последующим количественным определением их. 1. Спектрофотометрические методы. Солодка голая - метод основан на осаждении глицирризиновой кислоты из ацетонового извлечения 25% раствором аммиака с последующим спектрометрическим определением (ГФ Х). Диоскорея ниппонская - сапонины экстрагируют этанолом, к порции экстракта прибавляют реактив Эрлиха (1% раствор п-диметиламинобензальдегида в 4 н спиртовом растворе HCI), выдерживают 2 часа при 58°С, охлаждают, измеряют оптическую плотность окрашенного раствора на спектрофотометре. 2. Титриметрические (потенциометрическое титрование - аралия маньчжурская, ГФ ХI). 3. Флуориметрические. Стероидные сапонины при проявлении парами ортофосфорной кислоты ТСХ дают розовые пятна и интенсивную флуоресценцию в УФ-свете, что используется для количественного определения. 4. Диосгенин в корневищах с корнями диоскореи дельтовидной определяют методом газовой хроматографии. Применение сапонинов в медицине Сапонины обладают широким спектром фармакологического действия, высокой токсичностью для холоднокровных животных. При попадании в кровь они вызывают гемолиз и паралич ЦНС, прежде всего дыхательного центра. Все лекарственные средства, препараты, содержащие сапонины, применяются перорально, т.к. после гидролиза в ЖКТ до агликонов сапонины теряют гемолитическую активность. При приеме внутрь в больших дозах сапонины могут вызвать тошноту, рвоту, расстройство ЖКТ, головокружение. Стероидные сапонины обладают антисклеротическим действием. Например, препарат Полиспонин (из диоскореи ниппонской). Стероидные сапонины (диосгенин) используются для синтеза гормональных препаратов - прогестерона, кортизона. Тритерпеновые сапонины применяют как стимулирующие, тонизирующие и адаптогенные средства (настойка женьшеня, настойка аралии, настойка заманихи, Сапарал (из аралии). Они усиливают секрецию бронхиальных желез, разжижают мокроту, применяются как отхаркивающие средства (синюха, солодка - Глицирам). Сапонины оказывают седативное действие (синюха). Противовоспалительное, регулирующее водно-солевой обмен, антиаллергическое действие проявляют сапонины солодки. Сапонины астрагала шерстистоцветкового обладают гипотензивным действием. Препараты конского каштана (Эскузан, Эсфлазид, Анавенол, Веноплант) обладают капилляроукрепляющим, венотонизирующим действием. Их применяют при варикозном расширении вен, при поверхностных флебитах. Сапонины способствуют лучшему всасыванию других веществ. Эмульгирующие свойства сапонинов широко используются для приготовления эмульсий, суспензий. Благодаря пенообразующим свойствам сапонины используют в пищевой промышленности при приготовлении халвы, кондитерских изделий и шипучих напитков. Сапонины применяются в огнетушителях. Таблица 9 Химический состав, фармакологическая активность и использование ЛРС, содержащего сапонины
ТЕМА 9. ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ Это вещества ароматической природы, которые содержат одну или несколько гидроксильных групп, связанных с атомами углерода ароматического ядра. Классификация В основе химической классификации природных фенольных соединений (ФС) лежит биогенетический принцип. В соответствии с современными представлениями о биосинтезе фенольных соединений их можно разбить на несколько основных групп, расположив их в порядке усложнения молекулярной структуры: 1) соединения с одним бензольным кольцом и структурами С6, С6-С1 и С6-С2 - простые фенолы, бензойные кислоты, фенолоспирты, фенилуксусные кислоты и их производные, включая гликозидные формы; 2) производные фенилпропанового ряда со структурой С6-С3 - гидроксикоричные кислоты и спирты, кумарины; 3) соединения с двумя бензольными кольцами, имеющие структуру С6-С2-С6, - гидроксистильбены; 4) соединения с двумя бензольными кольцами и структурой С6-С3-С6 - флавоноиды; 5) димерные соединения, содержащие углерод-углеродную связь между мономерами, - гексагидроксидифеновая и эллаговая кислоты; 6) димерные соединения, состоящие из двух фенилпропановых единиц со структурой С6-С3-С3-С6, - лигнаны; 7) соединения, состоящие из двух или трех конденсированных колец и содержащие гидроксильные и хиноидные группы, - нафтохиноны и антрахиноны; 8) полимерные соединения - дубильные вещества, лигнины и меланины; 9) соединения иной структуры - ограниченно распространенные хромоны, ксантоны или представляющие смешанные фенолы - флаволигнаны. Фенологликозиды Фенологликозиды - гликозиды, агликоном которых являются простые фенолы, содержащие одну или несколько гидроксильных групп при одном бензольном кольце. Кроме гидроксильных групп в качестве заместителей могут быть оксиметильная (-СН3ОН), оксиэтильная (-С2Н5ОН) или карбоксильная (-СООН) группы. Классификация В зависимости от характера заместителей в бензольном кольце фенологликозиды подразделяются на 3 группы. 1. К первой группе относятся гликозиды простых фенолов, содержащие только ОН-группы. По числу ОН-групп различают одноатомные (фенол), двухатомные (пирокатехин, резорцин, гидрохинон) и трехатомные (пирогаллол, флороглюцин и др.) простые фенолы.  ФЕНОЛ ПИРОКАТЕХИН ПИРОГАЛЛОЛ Простые фенольные соединения в растениях встречаются редко. Чаще всего они находятся в связанном виде (в форме гликозидов или сложных эфиров). Наиболее широко в растениях представлены соединения, в которых гидроксильная группа связана с сахаром. Довольно распространен -глюкозид гидрохинона - арбутин.  АРБУТИН ГИДРОХИНОН Арбутин встречается в представителях следующих семейств: Вересковые - Ericaceae, Брусничные - Vacciniaceae, Розоцветные - Rosaceae, Камнеломковые - Saxifragaceae, Астровые - Asteraceae и др. В значительных количествах арбутин накапливается в листьях и побегах толокнянки и брусники, в листьях груши, бадана толстолистного и др. Наряду с арбутином в этих растениях присутствует метиларбутин. Агликоном этих гликозидов являются соответственно гидрохинон и метилгидрохинон.  МЕТИЛАРБУТИН Известен также глюкозид флороглюцина - флорин, который содержится в кожуре плодов цитрусовых. Более сложные соединения - флороглюциды, представляющие собой производные флороглюцина и масляной кислоты, являются действующими веществами мужского папоротника.  ФЛОРОГЛЮЦИН 2. Вторая группа представлена гликозидами фенолоспиртов, содержащими гидроксильные (-ОН) и спиртовые группы (-СН2ОН), - салицином и салидрозидом. Салицин представляет собой -глюкозид салицилового спирта, салидрозид (родиолозид) является -глюкопиранозидом п-тирозола.  САЛИЦИН САЛИДРОЗИД ТИРОЗОЛ Салицин (1828) и салидрозид (1926) были выделены из коры ивы. Позднее салидрозид был обнаружен в корневищах и корнях родиолы розовой. 3. Представителями третьей группы являются гликозиды фенолокислот, содержащие гидроксильные (-ОН) и карбоксильные (-СООН) группы, - производные гидроксибензойной кислоты:  R1- H, R2 - H - гидроксибензойная кислота R1 - H, R2 - OH - протокатеховая кислота R1 - OH, R2 - OH - галловая кислота R1 - H, R2 - OCH3 - ванилиновая кислота R1 - OCH3, R2 - OCH3 - сиреневая кислота. Фенолокислоты широко распространены в растительном мире. Такие соединения, как п-гидроксибензойная, протокатеховая, ванилиновая кислоты, обнаружены практически у всех покрытосеменных растений. Довольно часто встречаются также галловая и сиреневая кислоты, значительно реже салициловая. Они могут быть в свободном состоянии, или связаны друг с другом по типу депсидов, или же существовать в виде гликозидов.  ГЛЮКОЗИД САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ Метиловые эфиры салициловой кислоты входят в состав эфирного масла фиалки трехцветной и полевой. Физико-химические свойства 1. Свободные фенольные соединения и их гликозиды представляют собой белые или желтоватые кристаллические вещества. 2. Растворимы в воде, спирто-водных смесях (40%, 70%, 80%), в этиловом и метиловом спиртах, ацетоне, этилацетате, а также в водных растворах гидрокарбоната и ацетата натрия. 3. Нерастворимы в хлороформе, диэтиловом эфире, четыреххлористом углероде, дихлорэтане. 4. Гликозиды и агликоны растворимы в щелочах с образованием фенолятов. 5. Гликозиды - оптически активные соединения. 6. Гликозиды подвергаются гидролизу под действием кислот и ферментов. Методы выделения 1. Фенольные гликозиды извлекают из ЛРС водой или спирто-водными смесями 40%, 70% или 95%. Спирт упаривают. 2. Водное извлечение очищают четыреххлористым углеводородом, дихлорэтаном или др. неполярными органическими растворителями. 3. Выделение индивидуальных соединений проводят методом адсорбционной хроматографии на полиамиде, силикагеле, целлюлозе. Для идентификации выделенных соединений определяют: температуру плавления, удельное вращение, УФ-, ИК-, масс-спектры. Качественное определение Фенольные соединения за счет свободных гидроксильных групп дают все реакции, характерные для фенолов: 1) с железоаммонийными квасцами; 2) с солями тяжелых металлов; 3) реакцию диазотирования; 4) для определения арбутина в ЛРС используют цветные качественные реакции: к водному извлечению из ЛРС прибавляют кристаллик сульфата закисного железа. Появляется сиреневое окрашивание, переходящее в темно-фиолетовое, и затем появляется темно-фиолетовый осадок; к водному извлечению из ЛРС прибавляют раствор аммиака и раствор натрия фосфорно-молибденовокислого в хлористоводородной кислоте, появляется синее окрашивание; 5) фенольные соединения могут быть обнаружены и идентифицированы с помощью бумажной или тонкослойной хроматографии. Для хроматографирования в тонком слое сорбента используют системы растворителей: Н-БУТАНОЛ-УКСУСНАЯ КИСЛОТА-ВОДА (4:1:5); ХЛОРОФОРМ-МЕТАНОЛ (8:2). При хроматографировании на бумаге используют 5, 10, 15%- ную уксусную кислоту. Эти же качественные реакции используют для обнаружения фенольных гликозидов на хроматограммах. При этом фенольные гликозиды в зависимости от строения обнаруживаются в виде желтых, красных, оранжевых или голубых пятен. При обработке хроматограмм раствором нитрата серебра и щелочью фенольные гликозиды обнаруживаются в виде коричневых пятен с различным оттенком. Количественное определение I. Содержание арбутина в листьях толокнянки и брусники по ГФ ХI (вып. 2, ст. 26) определяют йодометрическим методом, основанным на окислении йодом гидрохинона, полученного после извлечения и гидролиза арбутина (схема 7). Схема 7 Схема количественного определения арбутина в листьях толокнянки Подготовка ЛРС (измельчение, просеивание, взятие навески) Экстракция водой на кипящей водяной бане, фильтрация Добавление ацетата свинца (для очистки) Кислотный гидролиз (кипятят 1,5 часа с обратным холодильником), фильтрация Добавление цинковой пыли для перевода хинонов в гидрохиноны Нейтрализация извлечения гидрокарбонатом натрия, фильтрация Йодометрическое титрование гидрохинона, полученного после гидролиза арбутина Расчет результатов II. Салидрозид в экстракте из корневищ и корней родиолы розовой определяют спектрофотометрическим методом. III. Колориметрический метод можно использовать с реактивом Фолина - Дениса*. IV. Хромато-спектрофотометрический метод можно использовать для всех представителей этой группы. _________________________________ *Примечание. Реактив Фолина-Дениса готовят следующим образом: смешивают 100 г вольфрамата натрия, 20 г фосфорно-молибденовой кислоты, 50 мл 85% фосфорной кислоты и 750 мл воды. Смесь кипятят 2 часа в колбе с обратным холодильником, после охлаждения доводят водой до 1000 мл. Применение в медицине Листья и побеги толокнянки (5 см) и брусники (13 см) применяют в форме отваров при воспалительных заболеваниях мочевыводящих путей. Антисептическое действие обуславливается гидрохиноном, который образуется в организме при гидролизе арбутина и метиларбутина под действием ферментов и кислот. Раздражая почечный эпителий, арбутин оказывает также мочегонное действие. Фенологликозиды (салидрозид, розавин) родиолы розовой обладают стимулирующим, повышающим работоспособность, адаптогенным действием, жидкий экстракт родиолы розовой действует подобно препаратам женьшеня и элеутерококка. Флороглюциды папоротника мужского действуют как антигельминтные средства и применяются в виде густого экстракта. Салициловая кислота и ее производные известны как противовоспалительные, жаропонижающие и болеутоляющие средства. Таблица 10 Химический состав, фармакологическая активность и использование ЛРС, содержащего фенольные гликозиды
ТЕМА 10. ЛИГНАНЫ Лигнаны - это природные фенольные вещества, состоящие из двух фенилпропановых фрагментов (С6 - С3), соединенных между собой -углеродами боковых цепей. Термин "лигнаны" впервые был введен Хеуорсом в 1936 году. Впервые эти соединения были получены из древесины (лат. lignum - древесина, дерево), на основании чего они и получили свлё название. Общую структуру димера можно представить следующей схемой:  В настоящее время известно более 200 представителей этой группы. Разнообразие лигнанов обусловлено: 1) расположением фенильных ядер; 2) степенью их насыщенности; 3) наличием различных заместителей в бензольных кольцах; 4) характером связи между ними; 5) степенью насыщенности боковых цепей; 6) степенью окисления -углеродных атомов. Наиболее часто в составе ароматических колец имеются гидроксильные, метоксильные и метилендигидроксильные группы. При окислении углеродных атомов боковых цепей часто образуются оксидные или лактонные циклы. Классификация лигнанов Лигнаны в зависимости от расположения ароматических ядер делятся на 3 группы: собственно лиигнаны, неолигнагы и лигноиды. Собственно лигнаны. Известно пять типов структур этой группы:: 1. Диарилбутановый тип - лигнаны гваяковой смолы, получаемой из древесины гваякового дерева (Guajacum officinale), например, гваяретовая кислота:  ГВАЯРЕТОВАЯ КИСЛОТА 2. Тетрагидронафталиновый тип - лигнаны смолы и подземных органов подофилла щитовидного (подофиллотоксин и пельтатины):  ПОДОФИЛЛОТОКСИН 3. Сезаминовый(диоксабициклооктановый) тип - лигнан сезамин из семян кунжута (Sesamum indicum) и сирингарезинол из корневищ и корней элеутерококка колючего:  СИРИНГАРЕЗИНОЛ 4. Диарилоктановый тип - схизандрин и схизандрол из плодов и семян лимонника китайского:  СХИЗАНДРИН 5. Диарилтетрогидрофурановый тип  Неолигнаны состоят из двух арилпропановых фрагментов (С6 – С3), соединенных между собой α – углеродными атомами боковых цепей. В положении Сβ – С ץчасто бывает двойная связь.  Лигноиды – соединения, в которых фрагмент фенилпропана (С6 – С3) связан с другими группами фенольных соединений: флаволигнаны (силибин, силикристин и др.), ксантолигнаны (килькорин) и кумаринолигнаны (дафнетицин).  СИЛИБИН Распространение в растительном мире. Лигнаны широко распространены в растительном мире. В растениях встречаются как в виде агликонов, так и в виде гликозидов. Особенно часто встречаются в семействах: Сосновые (Pinaceae), Барбарисовые (Berberidaceae), Астровые (Asteraceae), Аралиевые (Araliaceae), Рутовые (Rutaceae), Кунжутные (Pedaliaceae) и др. В растениях лигнаны находятся в растворенном виде в жирном и эфирном маслах, смолах; накапливаются во всех органах, но больше - в семенах, корнях и одревесневших стеблях. Физико-химические свойства Лигнаны – это твердые криссталические вещества, бесцветные или слегка окрашенные. Большинство лигнанов – оптически активные вещества. Многие вращают плоскость поляризации влево. Растворимы в бензоле, хлороформе, диэтиловом эфире, низших спиртах, в жирных и эфирных маслах, смолах; нерастворимы в воде. Не перегоняются с водяным паром. Лигнаны гликозиды растворимы в водных растворах низших спиртов. Из ЛРС экстрагируют диэтиловым эфиром, хлороформом или другими растворителями. Разделение проводят с помощью колоночной хроматографии на оксиде алюминия, силикогеле. Подобно финолоспиртам избирательно поглощают свет при длине волны 275-280, 220-230 нм. В УФ-свете флуоресцируют голубым или жёлтым цветом в зависимости от строения. Лигноиды проявляют свойства тех соединений, которые входят в их состав. Методы анализа Качественный анализ. Проводят реакции, основанные на способности лигнанов вступать в химические реакции, характерные для фенолов. Также используют способность флуоресцировать в УФ-свете. Применяют методы бумажной и тонкослойной хроматографии. Хроматограммы обрабатывают последовательно парами хлора и раствором сульфита натрия. Пятна лигнанов окрашиваютcz в красный цвет. Количественное определение лигнанов проводят разными методами: 1. Гравиметрический (весовой ) метод. Основан на различной растворимости лигнанов в воде и неполярных растворителях. Осаждают лигнаны из растворов с последующим высушиванием и взвешиванием осадка. 2. Фотоэлектроколориметрический метод. Основан на способности лигнанов поглощать немонохроматический свет. Измеряют оптическую плотность окрашенных растворов, полученных по реакции образования азокрасителя с помощью фотоэлектроколориметра. 3. Хроматоспектрофотометрический метод. Основан на способности лигнанов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны. Измеряют оптическую плотность растворов лигнанов после предварительного хроматографического разделения с помощью спектрофотометра. Применение лигнанов Лигнаны - фармакологически активные вещества. Они обладают: противоопухолевой активностью (подофиллотоксин из подофилла щитовидного). Подофиллин применяется при папилломатозе мочевого пузыря и папилломах гортани; противомикробным (арктиин из лопуха обыкновенного); стимулирующим и адаптогенным (схизандрин из лимонника китайского и сирингарезинол из элеутерококка колючего) действием и применяются в виде настойки лимонника и жидкого экстракта элеутерококка; антигеморрагическими (сезамин) свойствами; флаволигнаны расторопши пятнистой оказывают гепатозащитное действие. С этой целью применяются препараты: Силибор, Легалон, Карсил. Таблица 11 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||