БАВ. Природные биологически активные вещества
 Скачать 1.93 Mb.
|
|
ТЕМА 12. ФЛАВОНОИДЫ Флавоноиды - многочисленная группа природных биологически активных соединений, в основе которых лежит дифенилпропановый скелет (С6-С3-С6), различной степени окисленности и замещения. Свое название эти вещества получили от латинского слова flavus - желтый - в 1895 г. химиком Костанецким, поскольку первые выделенные флавоноиды имели желтую окраску. Классификация В основе классификации лежит: 1) степень окисленности и гидроксилирования пропанового фрагмента; 2) положение бокового фенильного радикала; 3) величина гетероцикла. По расположению кольца B выделяют следующие основные подгруппы флавоноидов: I. Собственно флавоноиды (эуфлавоноиды) с боковым фенильным радикалом у С2. II. Изофлавоноиды с фенильным радикалом у С3. III. Неофлавоноиды с фенильным радикалом у С4. IV. Бифлавоноиды. I. Собственно флавоноиды К этой подгруппе относятся: 1) производные флавана (2 фенилхромана):  ФЛАВАН КАТЕХИН ЛЕЙКОАНТОЦИАНИДИН  АНТОЦИАНИДИН 2) производные флавона (2 фенилхромона):  ФЛАВОН ФЛАВОНОЛ  ФЛАВАНОН ФЛАВАНОНОЛ 3) флавоноиды с раскрытым пироновым кольцом:  ХАЛКОН ДИГИДРОХАЛКОН 4) ауроны:  АУРОН II. Изофлавоноиды с фенильным радикалом в положении 3:  ИЗОФЛАВАН ИЗОФЛАВОН ИЗОФЛАВАНОН и др. III. Неофлавоноиды с фенильным радикалом у С4:  4-БЕНЗОКУМАРИН 4-БЕНЗОХРОМАН (неофлаван) IV. Бифлавоноиды Кроме мономерных флавоноидов существуют димерные формы - флавоноиды могут конденсироваться между собой углерод-углеродными связями и другими фенольными соединениями: фенолкарбоновыми и оксикоричными к-тами, лигнанами, с изопреноидами и алкалоидами.  БИФЛАВОН В растениях большинство флавоноидов присутствует в виде гликозидов (кроме катехинов и лейкоантоцианов). В качестве углеводной части могут быть моносахариды: D-глюкоза, D-галактоза, D-ксилоза, L-рамноза и др. В некоторых случаях встречаются специфические дисахариды: рутиноза (рамноза и глюкоза), софороза (2 молекулы глюкозы). Сахара могут присоединяться к агликону в 3, 7, 3', 4' и др. положениях. Для флавоноидов характерно гидроксилирование. Оно возможно почти во всех положениях. У некоторых флавоноидов гидроксилы метилированы. Основную группу флавоноидов составляют О-гликозиды; в меньшей степени распространены С-гликозиды, где углеводные компоненты связаны с агликоном через углеродный атом в 6 или 8 положениях. Известны также ацилированные гликозиды, содержащие ацильные остатки в агликоновой или в углеводной части молекулы. Ацилирующими агентами могут быть бензойная, уксусная, протокатеховая, кофейная и др. кислоты. О-гликозиды в зависимости от числа остатков сахара, положения и порядка их присоединения делятся на монозиды, биозиды, триозиды и дигликозиды. В дигликозидах моносахара присоединяются в двух разных положениях флавоноидного ядра. Распространение флавоноидов в растительном мире Флавоноиды широко распространены в высших растениях, встречаются они в водорослях и грибах, значительно реже - в микроорганизмах и насекомых. Около 40% флавоноидов приходится на группу производных флавонола, несколько меньше - флавона, значительно реже встречаются флаваноны, халконы, ауроны. Наиболее богаты флавоноидами растения семейств: Бобовые (Fabaceae), Астровые (Asteraceaе), Сельдерейные (Apiaceae), Яснотковые (Lamiaceae), Розоцветные (Rosaceae), Гречишные (Polygonaceae), Березовые (Betulaceae), Рутовые (Rutaceae) и др. Локализация флавоноидов в растениях В растениях флавоноиды локализуются в различных органах и частях растений: - бутонах (софора японская), - цветках, обуславливая окраску лепестков (бессмертник песчаный, василек синий, пижма обыкновенная), - траве (горцы: птичий, почечуйный, перечный; хвощ полевой), - плодах (боярышники, софора японская), - корнях (стальник пашенный, шлемник байкальский). Содержание их в растениях колеблется от 0,5 до 30% (бутоны софоры японской). В клетках растений флавоноиды накапливаются в форме гликозидов, главным образом в вакуолях, а в свободном состоянии - в специальных образованиях, зачастую имеющих довольно сложное строение - смоляных и эфирномасличных ходах, канальцах, вместилищах, железках и т.д. В надземных частях растений более 85% суммы флавоноидов локализуется в клетках эпидермы и только 15% - в остальных тканях. Биологическая роль флавоноидов в жизни растений Биологическая роль флавоноидов в жизни растений изучена еще недостаточно. Некоторые авторы считают, что флавоноиды принимают участие: в окислительно-восстановительных процессах растений; в выработке иммунитета; в защите растений от неблагоприятных воздействий ультрафиолетовых лучей и низких температур; в процессе оплодотворения высших растений; обуславливают огромное разнообразие окрасок цветков и плодов, что привлекает насекомых и тем самым способствуют опылению; некоторые флавоноиды защищают аскорбиновую кислоту от окисления (т.е. являются антиоксидантами). Влияние внешних факторов на накопление флавоноидов 1. На накопление флавоноидов оказывают влияние возраст и фаза развития растения. В молодых растениях их больше; в старых растениях их количество уменьшается. Максимальное содержание флавоноидов наблюдается в цветках, листьях и травах в период бутонизации и цветения, а к фазе плодоношения содержание снижается; в плодах и семенах - в период молочной зрелости - полного созревания; в корнях - в период увядания надземной массы осенью. 2. На накопление флавоноидов влияет освещенность. Содержание флавоноидов в растениях увеличивается с ростом освещенности, а степень их гидроксилирования (число -ОН групп) - с увеличением высоты над уровнем моря. 3. На накопление флавоноидов влияет температура. Содержание антоцианов увеличивается при понижении температуры (покраснение листьев у щавеля), у других групп флавоноидов, наоборот, содержание увеличивается при повышении температуры. Физико-химические свойства 1. Большинство флавоноидов - твердые кристаллические вещества с определенной температурой плавления, не имеющие запаха. 2. Окрашены в желтый цвет (флавоны, флавонолы, халконы, ауроны) или бесцветные (катехины, лейкоантоцианидины, флаваноны, изофлавоны). Наиболее яркие оттенки свойственны антоцианам, которые придают растительным тканям красную или синюю окраску в зависимости от рН среды. В кислой среде они имеют красный цвет (соли катионов), в щелочной - синий (соли анионов). 3. Гликозиды (содержащие более трех остатков сахара) растворимы в воде, водно-спиртовых смесях, в спиртах при нагревании, этилацетате и нерастворимы в органических растворителях (петролейном и диэтиловом эфирах, дихлорэтане, ССl4). Агликоны хорошо растворимы в низших спиртах (метиловом и этиловом), органических растворителях (диэтиловом эфире, ацетоне, бензоле) и в растворах щелочей. Нерастворимы в воде. 4. Гликозиды обладают оптической активностью. 5. О-гликозиды при действии разбавленных минеральных кислот и ферментов легко гидролизуются до агликона и углеводного остатка. С-гликозиды с трудом расщепляются под действием концентрированных кислот (HCl или СН3СООН) или их смесей при длительном нагревании. 6. Катехины и лейкоантоцианидины, как правило, гликозидных форм не образуют. Они легко окисляются в присутствии кислорода, под действием света и щелочей. Остальные флавоноиды более устойчивы к окислению. 7. Флавоноиды флуоресцируют в УФ-свете: при этом флавоны, флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы обнаруживаются на хроматограммах в виде коричневых пятен, флавонолы и их 7-гликозиды - в виде желтых или желто-зеленых пятен. 8. Свободная ОН-группа 7 положения способна диазотироваться. 9. Благодаря карбонильным и фенольным оксигруппам флавоноиды способны образовывать комплексы с солями металлов различной степени устойчивости. 10. Флавоноиды способны восстанавливаться атомарным водородом в кислой среде в присутствии магния или цинка. 11. Флавоноиды взаимодействуют со щелочами с образованием фенолятов желтой окраски, которая при нагревании изменяется до оранжевой или коричневой. Методы выделения флавоноидов из ЛРС Для флавоноидов не существует универсального метода выделения из растительного сырья. В каждом конкретном случае учитываются свойства выделяемых веществ, сопутствующие вещества и особенности растительного сырья. Для выделения флавоноидов проводят экстрацию ЛРС одним из подходящих растворителей: этанолом, метанолом, горячей водой или спирто-водной смесью. Для очистки и разделения используют: 1) избирательную экстракцию; 2) осаждение солями тяжелых металлов; 3) хроматографические методы. Выделение флавоноидов из ЛРС с использованием избирательной экстракции (схема 9) 1. Экстракция суммы флавоноидов из ЛРС (70%,80% этанолом или метанолом). 2. Отгонка спирта под вакуумом до водного остатка. 3. Очистка полученной суммы флавоноидов СCl4 от липофильных веществ. 4. Разделение флавоноидов на фракции растворителями с возрастающей полярностью: 1) экстракция агликонов этиловым эфиром; 2) экстракция моногликозидов этилацетатом; 3) экстракция биозидов, триозидов и др. полярных флавоноидов н-бутанолом. 5. Разделяют полученные фракции с помощью колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте, силикагеле или целлюлозе. Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с этанолом или спирто-водными смесями с возрастающей концентрацией спирта. Контроль за ходом разделения флавоноидов проводят методом хроматографии: используют ТСХ, БХ или высокоэффективную газожидкостную хроматографию. Наиболее подходящими системами для БХ флавоноидов являются: 15%, 60% РАСТВОРЫ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ; БУТАНОЛ - УКСУСНАЯ КИСЛОТА - ВОДА (4:1:5). Для ТСХ: ХЛОРОФОРМ-МЕТАНОЛ (8:2). 6. Установление структуры выделенных соединений проводят с помощью физико-химических методов: определение температуры плавления; определение удельного вращения (гликозидов); сравнение УФ-, ИК-, масс-, ПМР-спектров со спектрами известных образцов. Схема 9 Качественное определение Для обнаружения флавоноидов в ЛРС используют химические реакции и хроматографию. Химические реакции подразделяются на цветные и реакции осаждения. I. Цветные реакции 1. Специфической реакцией на флавоноиды является цианидиновая проба (проба Шинода), основанная на восстановлении карбонильной группы атомарным водородом в кислой среде в присутствии металлического магния и образовании антоцианидинов. Продукты восстановления флавонов имеют окраску оранжевую, флаванолов, флаванонов - красно-фиолетовую. При использовании цинка положительную реакцию дают флаванолы и флаванол-3-гликозиды, а флаваноны не дают её. Цианидиновую реакцию не дают также изофлавоны, неофлавоноиды, халконы и ауроны. Халконы и ауроны образуют красное окрашивание при добавлении концентрированной хлористоводородной кислоты за счет образования оксониевых солей.  ЦИАНИДИН ХЛОРИД Цианидиновая реакция по Брианту позволяет определить агликоновую или гликозидную природу исследуемого вещества. К окрашенному раствору продукта цианидиновой реакции прибавляют равный объём н-октанола(или бутанола), разбавляют водой до разделения слоёв и встряхивают. Гликозиды остаются в воде, а агликоны переходят в слой органического растворителя. 2. Реакция со щелочами (аммиаком) - флавоноиды дают различную окраску от желтой до коричневой; халконы и ауроны со щелочами дают красное окрашивание или ярко-желтое; антоцианидины - синее окрашивание. 3. Флавоноиды, благодаря карбонильным и фенольным оксигруппам, способны образовывать комплексы с солями металлов: с хлоридом окисного железа (III) флавоноиды образуют комплексы, окрашенные в различные цвета в зависимости от структуры (от зеленого до коричневого цвета); борно-лимонная реакция - 5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы взаимодействуют с борной кислотой в присутствии лимонной (или щавелевой), образуя комплекс ярко-желтого окрашивания с желто-зеленой флуоресценцией в УФ-свете. Если флавонол или флавон не содержит гидроксил в 5 положении, то реакция протекает за счет гидроксила 3 положения;  реакция с треххлористой сурьмой - 5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет;  многие флавоноиды дают окрашенные комплексы желтого цвета с 5% спиртовым раствором алюминия хлорида, с 2% спиртовым раствором циркония хлорида. Флавоноиды, имеющие две оксигруппы у С3 и С5, дают хелаты жёлтого цвета за  счёт образования водородных связей между карбонильной и гидроксильными группами: 4. Флавоноиды со свободной 7-оксигруппой вступают в реакцию с солями диазония, образуя оранжевые или красные продукты азосочетания. II. Реакции осаждения Все флавоноиды с основным ацетатом свинца образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый или красный цвет. Средним ацетатом свинца осаждаются лишь флавоноиды, содержащие свободные орто-гидроксильные группы в 3', 4' -положениях кольца В. III. Хроматография Для обнаружения флавоноидов в растительном материале широко используется бумажная и тонкослойная хроматография. Обнаружение флавоноидов на хроматограммах проводят: по окраске пятен в видимом свете (антоцианы); по характеру свечения в УФ-свете: флавоны, флавонол-3-О-гликозиды, флаваноны и халконы обнаруживаются в виде темно-коричневых пятен, флавонолы и их 7-О-гликозиды - в виде желтых или желто-зеленых; по характеру свечения в УФ-свете после проявления 5%-ным спиртовым раствором хлорида алюминия и последующего прогревания хроматограммы при 105°С в течение 2-3 мин: наблюдают пятна флавоноидов с интенсивной желтой и желто-зеленой флуоресценцией. Количественное определение Для количественного определения флавоноидов в растительном сырье наибольшее распространение получили физико- химические методы, прежде всего фотоколориметрия и спектрофотометрия. 1. Фотоколориметрический метод основан: на цветных реакциях комплексообразования с солями различных металлов (алюминия, циркония, хрома, сурьмы); на реакции с лимонно-борным реактивом; на реакции восстановления атомарным водородом в кислой среде в присутствии металлического магния или цинка. 2. Спектрофотометрический метод, основанный на способности флавоноидов поглощать свет в УФ-области спектра. 3. Хромато-спектрофотометрический метод - более совершенный метод количественного определения флавоноидов, используется в сочетании с хроматографией, что позволяет произвести очистку и разделение суммы веществ на отдельные компоненты. Реже используют: 4. Флюориметрический метод. 5. Полярографический метод. 6. Наличие фенольных гидроксилов, обуславливающих слабокислые свойства флавоноидов, позволяет использовать метод кислотно-основного титрования в неводных растворителях: диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ацетоне. Заготовка и сушка сырья, содержащего флавоноиды Заготовку надземных частей проводят в фазу бутонизации или начала цветения, подземных - в конце вегетации. Сырье необходимо сушить вскоре после сбора, т.к. флавоноидные гликозиды под влиянием ферментов в присутствии влаги легко гидролизуются на сахар и агликон, а свободные агликоны могут окисляться. Сушить сырье следует в тени или в сушилках при температуре 50-60°С (не выше 90°С). Медленная сушка, особенно на солнце, ведет к разрушению флавоноидов. Хранить сырье необходимо в упакованном виде в сухом проветриваемом помещении, без доступа прямых солнечных лучей. |