Клонирование. Проблемный вопрос Породит ли овечка Долли монстров Цель
 Скачать 179 Kb.
|
|
Министерство образования Хогвартс Проект Клонирование – перспектива или реальность Выполнил: Руководитель: Реутов 2010 год Основополагающий вопрос: Грядут ли генетические войны? Проблемный вопрос: Породит ли овечка Долли монстров? Цель: Выяснить, имеются ли реальные значимые перспективы клонирования. Задачи: Собрать информацию по вопросу о клонировании. Подготовить виртуальный вернисаж «Результаты и достижения клонирования». Представить различные мнения по поводу клонирования. Сделать выводы. Оформить результаты. Гипотеза: Клонирование имеет перспективы развития потому, что оно позволит решить проблемы генетических заболеваний, онкологии, бездетности. кое к клон? Клонирование - процесс создания клонов. Клонами в биологии называют организмы, имеющие совершенно одинаковый набор генов, называемый генотипом. Как известно, в процессе размножения подавляющего большинства высших организмов дочерняя особь получает половину генов от отца, а половину - от матери. В результате полученная особь отличается по генотипу как от отца, так и от матери. Именно этим достигается такое разнообразие морфологических (внешних) признаков особей даже в пределах одного вида. Ведь, как известно, развитие всех внешних признаков во многом определяется именно генотипом особи. В случае же клонов - организмов, имеющих совершенно идентичные генотипы, - внешние отличия если и имеют место, то они незначительны и формируются под влиянием внешних факторов. В чём же смысл создания клонов, помимо чисто научного интереса? В практическом плане создание клонов привлекательно в области животноводства для дублирования, к примеру, коров с большим надоем молока или свиней с большой массой. В перспективе, клонирование можно использовать как метод дублирования не всего организма в целом, а лишь отдельных его частей или органов для нуждающихся пациентов, тем самым, обходя проблемы неприживаемости трансплантатов, возникающих вследствие генетической неидентичности донора и реципиента. Задачи клонирования: Клонирование органов и тканей - это задача номер один в области трансплантологии, травматологии и в других областях медицины и биологии. При пересадке клонированного органа не надо думать о подавлении реакции отторжения и возможных последствиях в виде рака, развившегося на фоне иммунодефицита. Клонированные органы станут спасением для людей, попавших в автомобильные аварии или какие-нибудь иные катастрофы, или для людей, которым нужна радикальная помощь из-за заболеваний пожилого возраста (изношенное сердце, больная печень и т.д.). Самый наглядный эффект клонирования - дать возможность бездетным людям иметь своих собственных детей. Миллионы семейных пар во всем мире сегодня страдают, будучи обреченными, оставаться без потомков. По признанию Андрея Акопяна, директора Республиканского Центра репродукции человека Минздрава РФ, у нас в стране бесплодна каждая шестая - седьмая семейная пара. Какие трагедии, какие семейные драмы возникают на этой почве! И вот, оказывается, эту ситуацию можно изменить. Можно иметь своего собственного ребенка, реальное продолжение самого себя во времени. Далее. Клонирование поможет людям, страдающим тяжелыми генетическими болезнями. Если гены, определяющие какую-либо подобную болезнь, содержатся в хромосомах отца, то в яйцеклетку матери пересаживается ядро ее собственной соматической клетки, - и тогда появится ребенок, лишенный опасных генов, точная копия матери. Если эти гены содержатся в хромосомах матери, то в ее яйцеклетку будет перемещено ядро соматической клетки отца, - появится здоровый ребенок, копия отца. И еще. Любители всяческой экзотики, наверное, никогда не переводились среди рода человеческого. Есть они и сейчас: и те, кто завещают отправить свой прах на ракете в сторону Солнца, и те, кто тратят десятки тысяч долларов на сохранение своего тела в криогенных камерах до того времени, когда медицина сумеет вернуть их в нормальное состояние и избавить от неизлечимых сегодня болезней. Думается, и в области клонирования найдутся подобные любители экзотики. Одни пожелают увидеть свою собственную копию, свое телесное "альтер эго" еще при своей жизни. Другие захотят "возродиться" в иную историческую эпоху: спустя 50 - 100 лет. Более скромная, но не менее важная задача клонирования - регулирование пола сельскохозяйственных животных и клонирование в них сугубо человеческих генов, "терапевтических белков", которые используются для лечения людей. Например, гемофиликов, которые страдают от мутаций в гене, кодирующем кровеостанавливающий белок ("фактор IX"). Сегодня эти белки добывают из крови доноров, а те бывают разные, в том числе и инфицированные вирусом СПИДа. Вот почему гемофилики считаются "группой риска" по СПИДу. В последнем номере за 1997 год журнал "Сайенс" сообщил о клонировании американскими учеными шести овец, три из которых несли человеческий ген фактора IX. Героиней стала овечка Долли, у которой ген активно работает! Со временем, когда она подрастет и обзаведется своим потомством, в ее молоке будет и человеческий белок, отличающийся от овечьего. Так овечка L Долли станет служить на благо человечеству. Учтя опыт шотландцев, американцы несколько модифицировали метод клонирования, использовав ядра эмбриональных, то есть зародышевых, фибробластов - клеток, дающих соединительную ткань, взятых из взрослого организма. Тем самым они резко увеличили эффективность метода, а также облегчили задачу введения "чужого" гена, поскольку в культуре фибробластов это делать значительно легче и дешевле. Обошли они с помощью зародышевых клеток и теломерный "запрет". Вполне возможно, что все эти разумные доводы повлияли на американских законодателей, которые приняли в конгрессе билль о клональных правах: клонирование человека запрещается всего лишь на десять лет, запрет не распространяется на животных и клонирование органов и тканей... А 14 февраля, в день святого Валентина, "Радио России" сообщило, что ученые Йоханнесбургского университета обратились в свой Национальный этический комитет с просьбой разрешить им работы по клонированию человека. Вспомним, кстати, что первая пересадка сердца человеку была сделана именно в Йоханнесбурге. История и методология клонирования. Термин "клон" происходит от греческого слова "klon", что означает - веточка, побег, черенок, и имеет отношение прежде всего к вегетативному размножению. Клонирование растений черенками, почками или клубнями в сельском хозяйстве, в частности в садоводстве, известно уже более 4-х тыс. лет. Начиная с 70-х годов нашего столетия, для клонирования растений стали широко использовать небольшие группы и даже отдельные соматические (неполовые) клетки. Дело в том, что у растений (в отличие от животных) по мере их роста в ходе клеточной специализации - дифференцировки - клетки не теряют так называемых тотипотентных свойств, т.е. не теряют своей способности реализовывать всю генетическую информацию, заложенную в ядре. Поэтому практически любая растительная клетка, сохранившая в процессе дифференцировки свое ядро, может дать начало новому организму. Эта особенность растительных клеток лежит в основе многих методов генетики и селекции. При вегетативном размножении и при клонировании гены не распределяются по потомкам, как в случае полового размножения, а сохраняются в полном составе в течение многих поколений. Все организмы, входящие в состав определенного клона, имеют одинаковый набор генов и фенотипически не различаются между собой. Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотентности, и в этом - одно из существенных их отличий от клеток растений. Как будет показано ниже, именно здесь - главное препятствие для клонирования взрослых позвоночных животных. Первые опыты на амфибиях. Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Американские исследователи Бриггс и Кинг разработали микрохирургический метод пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки. Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результаты позже были подтверждены и в других работах. Большой вклад в эту область внес английский биолог Гердон. Он первым в опытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis (1962) в качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего головастика. Ядра яйцеклеток реципиентов он не удалял хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика и только 1% развился в половозрелых особей. Однако появление нескольких взрослых особей в таких условиях могло быть связано с тем, что среди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика довольно длительное время присутствуют первичные половые клетки, ядра которых могли быть использованы для пересадки. В последующих работах как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов. Позже Гердон модифицировал эксперимент. Поскольку большинство реконструированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется "серийной пересадкой" в отличие от "первичной пересадки"). Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер. Затем Гердон вместе с Ласки (1970) стали культивировать in vitro (вне организма в питательной среде) клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестве доноров ядер. Примерно 25% первично реконструированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийных пересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таким образом было показано, что клетки трех разных тканей взрослого позвоночного (X. laevis) содержат ядра, которые могут обеспечить развитие по крайней мере до стадии головастика. В свою очередь ДиБерардино и Хофнер использовали для трансплантации ядра неделящихся и полностью дифференцированных клеток крови - эритроцитов лягушки Rana pipiens. После серийной пересадки таких ядер 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего головастика. Однако даже с помощью многократных серийных пересадок (более 100 клеточных циклов) реконструированные яйцеклетки дальше стадии головастика не развивались. Таким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития. Некоторые авторы называют подобные эксперименты клонированием амфибий, хотя правильнее называть их клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае мы размножаем бесполым путем не взрослых животных, а зародышей. Дифференцировка клеток в ходе развития позвоночных сопровождается инактивацией неработающих генов. Поэтому клетки теряют тотипотентность, дифференцировка становится необратимой. В конце концов у одних клеток происходит полное репрессирование генома, у других - в той или иной степени деградирует ДНК, а в некоторых случаях разрушается даже ядро. Однако наряду с дифференцированными кочетками культивируемые in vitro клеточные популяции содержат малодифференцированные стволовые клетки, которые и могут быть использованы как доноры ядер для клонирования млекопитающих. Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность. Успешные опыты с амфибиями заставили ученых задуматься о клонировании эмбрионов млекопитающих, в частности мышей. Мак Киннел в одной из своих работ отмечал, что все необходимые для этого методы уже существуют, и непонятно, почему мышь до сих пор не клонирована. По его мнению, первыми объектами должны были стать именно мелкие животные, такие как мышь или кролик. Однако предсказание Мак Киннелла не сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах действительно начались и протекали весьма драматично. К тому времени, весьма основательно были изучены биология и генетика ранних этапов развития млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объекта. Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий. Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургически удалять пронуклеусы из зигот (оплодотворенных яйцеклеток) мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранних эмбрионов. Однако все полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до стадии бластоцисты. Пронуклеус - одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих в период после проникновения сперматозоида, но до слияния мужского и женского пронуклеусов в ядро зиготы в процессе оплодотворения. Мужское ядро формируется из ядерного материала сперматозоида, женское - из хромосом яйцеклетки. Бластоциста (бластула) - зародыш млекопитающих на одной из ранних стадий развития, еще до его имплантации в матку. В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что они получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели только материнский, а две - отцовский геном. Это, якобы, зависело от того, какой пронуклеус был оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял развитие особи по типу гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но описанию авторов, с тем, что, удаляя один пронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатывая яйца специальным веществом, затем выращивали полученные диплоидные гомозиготные (с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития. Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной гомозиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются десятки лет работы. Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы. Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку, Мак Грат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластоцисты. Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц, активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского ядра приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинации мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона. Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих требуются два набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из известных видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоппе и Илменси не удалось повторить. Однако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В 1982 году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и якобы были получены четыре взрослых самки. В свете вышесказанного эти результаты весьма маловероятны. Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических зародышей у млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе материнского и отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, был назван геномным импринтингом и изучался в ряде работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающих требуется наличие мужского генома. Другая статья Илменси и Хоппе имела еще больший резонанс. Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и самца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто из работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение. МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы или бластоцисты. Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно, поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих. Американские исследователи Стик и Робл, используя методику Мак Грата и Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора. Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы тем не менее в том. что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов. Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании. Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный Мак Гратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом , что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготу. Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы. Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности. сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша. Автор утверждал, что большинство ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться. Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона. Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Но остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью, для клонирования взрослых животных. Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа. Скудность данных, видимо.и связана с определенными трудностями работы с этим объектом. Клонирование овец. Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной стадии развития ядра сохраняют тотипотентность. Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров. В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью. Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4. Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ. Эта работа, особенно в части культуры, эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводеВыход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента. Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат. Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров. |