№7 белки и аминокислоты. Производство аминокислот и белка
 Скачать 141.5 Kb.
|
Производство аминокислот и белкаВ соответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей 60-120 г полноценного белка, в рационе сельскохозяйственных животных на каждую кормовую единицу нужно не менее 110 г белка. По прогнозам к 2050 году население Земли возрастет до 10 млд человек, и для обеспечения его потребности в продукции сельского хозяйства нужно будет увеличить объемы производства на 75%. Традиционными методами этого достичь нельзя. Потребности в белковых продуктах можно удовлетворить, используя микроорганизмы, которые на 50% состоят из белка. Например, в ферментере объемом 300 м3 за сутки можно выработать 1 т микробного белка (365 т в год). Чтобы такое же количество белка выработать с помощью крупного рогатого скота, нужно иметь 30000 голов. Если же использовать для получения такой скорости производства белка бобовые растения, например, горох, то потребуется иметь поле площадью 5400 га. Для производства белка можно выращивать бактерии, дрожжи и микроводоросли. Известны попытки использования биомассы мицелиальных грибов рода Fusarium, на основе которых производят пищевой продукт микопротеин. Для вкуса и цвета в него вводят специальные пищевые добавки. В качестве пищевых добавок используются препараты из пивных и пищевых дрожжей. Белок микробного происхождения добавляется в пищу человека только в очищенном от примесей виде. Требования к белкам микробного происхождения, добавляемым в корм животным, не такие высокие. Белки хорошего состава можно получить из культивируемых дрожжей. Высушенная дрожжевая масса гранулируется и используется как белково-витаминный концентрат, содержащий до 60% белковых веществ. Вместе с тем в кормовых дрожжах встречаются вредные примеси, поэтому дрожжевой белок добавляется в корма животных ограниченно – не более 5-10% от сухой массы корма. Известно более 30 видов бактерий, которые также могут быть использованы в качестве источника полноценного кормового белка. За счет высокого содержания белка добавление 1 т БВК в корма обеспечивает экономию 7 т фуражного зерна и дополнительное производство 800 кг свинины или 5 т мяса птицы. Микробы-производители белка могут расти на различных достаточно дешевых средах (метанол, этанол, природный газ, нефтепродукты). Наиболее продуктивным сырьем для получения микробного белка следует считать клетчатку, причем преимущественно используются отходы сельского хозяйства: подсолнечная лузга, кукурузные кочерыжки, солома и др. В рационе человека и животных имеет большое значение не только количество белка, но и его состав. Белки состоят из отдельных звеньев – аминокислот. Если растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать все составляющие белок аминокислоты из углекислоты, воды, аммиака и минеральных солей, то человек и животные не могут производить некоторые аминокислоты, которые называются незаменимыми. Это валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и фенилаланин. Эти аминокислоты должны поступать в организм в готовом виде с пищей, их отсутствие вызывает тяжелые заболевания у человека и снижение продуктивности сельскохозяйственных животных. Например, в зерне пшеницы недостаточно лизина, а в зерне кукурузы – лизина, триптофана и треонина. Внесение в корма лизина высвобождает фураж и увеличивает объем мясной продукции: на 1 т лизина высвобождается 40-50 т фуражного зерна и получается дополнительно более 10 т мяса. Найдены микроорганизмы, в которых синтез отдельных аминокислот происходит достаточно активно. На их основе разработаны технологии производства незаменимых аминокислот. Среди соединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства (более 500 тыс.т в год). Больше всего производится глутаминовой кислоты (глутамат натрия) и лизина. Помимо применения в качестве пищевых добавок аминокислоты используются в медицине для лечения ряда заболеваний, а также в пищевой промышленности. В таблице 1 указаны области применения некоторых производимых микроорганизмами аминокислот. Таблица 1. Практическое использование некоторых аминокислот.
Производство аминокислот.Область применения: кормовые, пищевые добавки, приправы, и фармацевтическая и парфюмерная промышленность. Из 20 аминокислот – 8 (изолейцин, треонин, лейцин, лизин, метионин, триптофан, валин, фенилаланин) незаменимы для человека. Для сельскохозяйственных животных еще гистидин и аргинин. Цистеин предотвращают пригорание пищи, улучшает качество хлеба, усиливает запах пищи. Глицин используется при производстве напитков (обладает сладковатым вкусом). Глутаминовая кислота – для усиления вкуса и консервирования пищи. Ряд аминокислот используют в медицине. Получение аминокислот возможно химическим синтезом, гидролизом природного белкового сырья и в биотехнологических процессах. Химический синтез дает рацемат – продукт, содержащий как L-, так и D-изомеры, обладающими токсичностью. Получение аминокислот из гидролизатов растительного и животного происхождения связано с многоступенчатой и дорогостоящей очисткой. Биотехнологическое получение аминокислот включает в себя прямую микробную ферментацию, а также микробиологический или ферментативный синтез из предшественников. Микробиологический метод – наиболее распространенный метод, основан на способности микроорганизмов синтезировать аминокислоты. Биосинтез аминокислот в микробных клетках протекает в виде свободных аминокислот, из которого в процессах метаболизма синтезируются клеточные макромолекулы. Для синтеза белка необходимо 20 аминокислот. Пути синтеза большинства аминокислот взаимосвязаны. При этом одни аминокислоты являются предшественниками для биосинтеза других. Синтез каждой аминокислоты в микробных клетках реализуется в строго определенных количествах, обеспечивающих образование последующих аминокислот и находящихся под строгим генетическим контролем. Контроль осуществляется на уровне генов, ответственных за синтез соответствующих ферментов и на уровне самих ферментов, которые в результатов избытка образующихся аминокислот могут изменять свою активностью. Такой механизм контроля исключает перепроизводство аминокислот и препятствует их выделению из клеток в окружающую среду. Чтобы добиться сверхсинтеза отдельных аминокислот, необходимо изменить данный контрольный механизм их синтеза. Изменение контрольного механизма синтеза аминокислот осуществляется генетическими методами. В результате чего получают мутантные ауксотрофные и регуляторные мутанты. Ауксотрофные – это организмы, утратившие способность к синтезу одной или нескольких аминокислот. Продуценты аминокислот: различные микроорганизмы родов Bacillus, Mikrobacterium, Brevibacterium и др. Классификация микроорганизмов: дикие штаммы, ауксотрофные штаммы, регуляторные мутанты и ауксотрофные регуляторные мутанты. Промышленные штаммы несут несколько мутаций, затрагивающих механизмы регуляции целевой аминокислоты и ее предшественников. Для получения аминокислот валина, аланина, глутамина, пролина можно применить природные штаммы и усилить у них продукцию аминокислот условиями ферментации. Ауксотрофные мутанты используют для синтеза аминокислот, которые являются конечными продуктами разветвленных цепей метаболических реакций аминокислот. Иногда получают мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза для увеличения выхода. Такие организмы называются регуляторными мутантами. Регуляторные мутанты отбирают по устойчивости к аналогам аминокислот. Аналоги аминокислот выступают в роли искусственных ингибиторов ферментов, одновременно обеспечивая биосинтез аминокислот, и подавляют процесс их включения в белки. Производственные биотехнологические процессы получения аминокислот осуществляются в условиях глубинной аэробной периодической ферментации. Скорость синтеза аминокислот не совпадает во времени со скоростью роста производственной культуры. Максимальный выход аминокислоты наступает тогда, когда прирост биомассы практически прекращается. Поэтому питательная среда на начальном периоде ферментации должна способствовать сбалансированному росту клеток, а на втором – условия для синтеза целевой аминокислоты. В качестве источника углерода и энергии используют сахаросодержащие субстраты. В качестве источника азота – соли аммония, нитраты, азот. В состав среды входят: углерод, азот, фосфаты, стимуляторы роста (витамины, дрожжевой экстракт), антибиотики, ПАВ. Весь процесс проходит в стерильных условиях. После ферментации клетки отделяют от раствора, который далее очищают от примесей и взвешенных частиц с помощью сорбционных методов, а затем идет процесс разделения и очистки в зависимости от области применения конечного продукта. Для пищевой, фармакологической промышленности аминокислоты получают в виде кристаллических препаратов; для кормовых и технических целей – используют сконцентрированную культуральную жидкость. Субстраты 1-го поколения – углеводы. Для получения белка в промышленных масштабах используют углеродосодержащее сырье – различные отходы пищевой, целлюлозной промышленности, переработки растительного сырья (древесина, солома, торф и др.), которые содержат моно- и дисахара, органические кислоты, спирты, минеральные элементы, то есть представляют сложные многокомпонентные субстраты. В качестве продуцентов ввиду сложности состава субстрата используют штаммы, способные усваивать пентозы и гексозы, и устойчивые к присутствию спиртов, фурфурола и других продуктов гидролиза растительного субстрата. Для этих целей используют дрожжи рода Candida (utilis, scottii, tropicalis). Дрожжи утилизируют углеродосодержащие компоненты гидролизатов в следующей последовательности: глюкоза, уксусная кислота, манноза, ксилоза, галактоза, арабиноза. При совместном выращивании scottii и tropicalis используют две схемы соединения ферментационных аппаратов: двухступенчатая последовательная и параллельно- последовательная. В первом случае используют неразбавленный гидролизат (сусло) с концентрацией редуцирующих веществ 30-35 г/л. В первом ферментере утилизируется около 70 % редуцирующих веществ, за счет легкоусвояемых гексоз до остаточной концентрации 10-15 г/л. Дрожжи выделяют из суспензии и подвергают дальнейшей обработке до получения готового продукта; а отделенная культуральная жидкость поступает во второй аппарат. В нем оставшиеся пентозы утилизируются другими штаммами дрожжей, селективными по отношению к пентозам. Во втором случае применяют два последовательно соединенных ферментера. В первый поступает разбавленное сусло с концентрацией редуцирующих веществ около 15-18 г/л, в нем утилизируются гексозы. Затем дрожжевая суспензия идет во второй аппарат для доутилизоции оставшихся сахаров. Общий выход дрожжей достигает при этом 70-80 % по отношению к редуцирующим веществам. Культивирование проводят в аппаратах эрлифного типа объемом 300-600 м3 с вводом воздуха в нижнюю зону аппарата. В результате насыщения питательной среды воздухом образуется газожидкостная эмульсия, циркулирующая по всему объему, обеспечивающая эффективное перемешивание среды. Рабочий объем составляет около 70 % от общего объема. Процесс выращивания дрожжей осуществляется в непрерывном режиме при скорости потока среды, равной 0,2-0,25 ч-1, pH 4,2-4,6;температура среды 30-35ºС. Отклонение pH в кислую сторону, в ходе ферментации дрожжей автоматически корректируется аммиачной водой. Для отвода тепла используют теплообменники в виде змеевиков. Концентрация суспензии дрожжей 20-40 г/л влажностью 75 % поступает на дальнейшую переработку (ферментация, сепарация, сушка). С целью обогащения дрожжевой биомассы витамином D2 дрожжи облучают ультрафиолетом, в результате чего эргостерин превращается в витамин. Сгущенную суспензию прокачивают по кварцевым трубкам. В составе биомассы дрожжей (%): белок – 43-58, липиды – 2-3, углеводы – 11-23, зола - 11, остаточная влажность – не более 10. Выход составляет 46-48 %. Это соответствует выходу 240 кг АСБ дрожжей с 1 т отходов. Перспективным является использование новых продуцентов не только дрожжей, но и грибов, бактерий, обладающих высокой скоростью роста и более разнообразным набором аминокислот. Субстраты 2-го поколения – жидкие углеводороды. Микроорганизмы утилизируют практически все классы углеводородов (дизельные фракции, жидкие парафины, и другие нефтепродукты). С более высокой скоростью утилизируются углеводороды нормального строения с длиной углеродной цепи С11-С18. В качестве продуцентов используются дрожжи рода Candida (scottii, maltosa). Углеводороды проникают в микробные клетки через клеточную стенку по градиенту концентрации, образуя: спирты → альдегиды → кислоты. При использовании углеводородов в качестве субстрата допустимое содержание ароматических углеводородов не более 0,01. Парафины не растворяются в воде, поэтому культивирование осуществляется в эмульсии, с размером капель не более 5 мкм. Получается четырехфазная система («газ – жидкость – жидкие углеводороды – микробные клетки»). В среду культивирования вносят макро-, микроэлементы, ПАВ для снятия поверхностного натяжения. Содержание парафинов 3-5 %. Расход воздуха составляет 20-50 м3 на 1 кг АСВ дрожжей. Процесс получения белка на жидких углеводородах осуществляется в ферментах типа Б-50, представляющих собой 12-секционный аппарат. Каждая секция имеет перемешивающее устройство. В 1-9 секциях идет активный рост при непрерывной подачи субстрата. В остальных подача субстрата прекращается и происходит окисление и доутилизация дрожжами остальных углеводородов. Субстрат при таких условиях полностью утилизируется, отвод тепла идет с помощью теплообменника. Время пребывания культуры в аппарате около 8 ч, pH - 4-4,5, температура – 32-34ºС, производительность процесса – 27 т/сут. Состав готового продукта: протеин – 60 %, жиры – 5 %, углеводы – 10-20 %, зола, влага – 10 %, витамин D – до 4000 м.е. и витамины группы B. Ограничения: стоимость равна стоимости соевой и рыбной муки, то есть дорого. Субстраты 3-го поколения – газообразные углеводороды, углекислота, водород. Перспективными видами сырья для микробного белка принято считать спирты, природный газ, водород. Наиболее перспективные субстраты: C2H5OH, CH3OH. В качестве продуцентов используются дрожжи (Candida), и бактерии (Pseudomonas, Methylomonas). Усвоение метанола включает три стадии: CH3OH → HCOH → HCOOH → СO2 Преимущества метанола: хорошо растворяется в воде, отсутствие канцерогенных примесей, что позволяет легко удалять его остатки из продукта на стадии высушивания, низкое тепловыделение; недостатки: горючесть, образование с воздухом взрывоопасных смесей, токсичность. Питательная среда содержит: спирт 8-10 г/л, макро- и микроэлементы, витамины, источник азотного питания, дрожжевой экстракт (50 мг/л). Температура культивирования составляет 34-37ºС, pH – 4,2-4,6. Расход метанола на синтез биомассы составляет около 2,5 т/т. Получаемые на метаноле дрожжи имеют следующий состав (%): протеин – 56-62, липиды – 5-6, нуклеиновые кислоты – 5-6, зола – 7-11, влажность – не выше 10. Аппараты: струйные, аппараты с жидкой фазой с эжекционными устройствами. Использование метана. Достоинства: низкая стоимость, доступность, отсутствие примесей ингибирующих рост микроорганизмов, большие выходы биомассы. В качестве продуцентов используют Pseudomonas, Methanomonas, Micobacterium. CH4 → CH3OH → HCOH → HCOOH → CO2 Недостатки: метан поступает из газовой фазы и имеет низкую растворимость, поэтому скорость растворения его в культуре является лимитирующим фактором, определяющим скорость роста продуцента. Используют метанотрофы и 5-6 видов гетеротрофов, которые утилизируют продукты неполного окисления метана. Для микробного окисления метана требуется большое количество кислорода (в 5 раз больше, чем на углеводах), поэтому проведение процесса ферментации требует сложного аппаратурного оформления(температура – 34-38ºС, pH - 7). Ввиду взрывоопасности процесс проводят при избытке метана и недостатке кислорода. Аппараты со струйным диспергированием газовой среды. Степень утилизации субстрата – 95 %. Биомасса (%): протеин - 75, нуклеиновые кислоты - 10, липиды - 5, зола - 10, влажность – не выше 10. К перспективным продуцентам белка можно отнести фотоавтотрофные организмы, использующие в качестве углеродного источника углекислоту, а энергии – свет. Процесс прироста биомассы водорослей идет за счет фотосинтеза. Продуценты: Chorella, цианобактерии рода Spirulina. Они способны фиксировать атмосферный азот. Биомасса Spirulina содержит (%): до 70 белка, полноценного аминокислотного состава, 19 углеводов, 4 нуклеиновых кислот, 4 липидов, 6 пигментов и 5 золы. Клеточная стенка легко переваривается. Биомасса является полноценным пищевым продуктом, содержащий высокий уровень переваримого белка и низкий уровень нуклеиновых кислот. Использование в качестве продуцента хемолитоавтотрофных микроорганизмов (водорослей), которые используются в качестве источника углерода, утилизируют углекислоту, отличается быстрым ростом, высоким содержанием белка полноценного по аминокислотному составу. Вместе с тем данная технология по ряду показателей имеет ограничения аналогично способу получения белка на метане. Производство органических кислот Органические кислоты и их соли широко используются в пищевой, фармацевтической, кожевенной, текстильной, химической, металлургической и других отраслях промышленности. Большинство кислот, используемых для технических нужд, производится химическим путем на основе нефтехимического сырья и продуктов сухой перегонки древесины. В тех случаях, когда химический синтез кислот является сложным и экономически невыгодным, или если они имеют пищевое или медицинское назначение, кислоты производят микробиологическим путем. С помощью микроорганизмов может быть получено более 50 различных органических кислот, методы получения их разработаны достаточно подробно. В настоящее время только 6 органических кислот производится биотехнологическим путем в промышленном масштабе. Причем лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты производят только микробиологическим путем, а молочную и уксусную - как химическим, так и микробиологическим методами. Глюконовая, кетоглюконовая, итаконовая и молочная кислоты используются в пищевой промышленности в качестве подкислителей. Глюконат натрия, в виде которого обычно выделяют глюконовую кислоту, используют для извлечения металлов из руд, борьбы с коррозией, как моющее средство, в качестве медицинского препарата. Итаконовая кислота применяется при производстве пластмасс и красителей. Молочную кислоту используют при выделке кож и как сырье для производства биоразлагаемого полимера полилактата. Технология получения глутаминовой кислоты. Глутаминовая кислота – первая аминокислота, полученная на основе промышленного микробиологического синтеза: HOOC – CH2 – CH2 – NH2CH – COOH Глутаминовая кислота является важнейшей аминокислотой растительных и животных белков. Продуцировать глутаминовую кислоту способны дрожжи, микроскопические грибы, бактерии. Промышленное значение имеют бактериальные культуры (Micrococcus, Microbacterium, Brevibacterium). Глюкоза ↓ Пировиноградная кислота ↓ Ацетил-КоА ↓ ↓ ← Щавелевоуксусная кислота Лимонная кислота ↑ ↓ ↑ Яблочная кислота ↑ ↓ ↓ Фумаровая кислота Изолимонная кислота ↑ Сукцинил-КоА ↓ ↑ ↑ α – кетоглутаровая кислота α – кетоглутарат- дегидрогеназа ↓ отсуствует глутаминовая кислота Рисунок 3. Схема синтеза глутаминовой кислоты. Глутаминовая кислота в основном используется в фармакологии и пищевой промышленности, поэтому ее получение необходимо в высокоочищенной форме. Для этого в культуральную жидкость добавляют известковое молоко. Избыток ионов осаждают кислотой, осадок удаляют центрефугированием. Фильтрат после осветления активированным углем и сорбции на ионообменных смолах концентрируют вакуумвыпариванием при 40 - 60ºС. Осаждение кристаллов проводят при pH 3,2 и температуре 4-15ºС. Чистота продукта составляет 99,6 %. Кристаллы кислоты отделяют от маточника центрифугированием, промывают и высушивают. Для получения глутамата натрия кристаллы кислоты обрабатывают гидроокисью натрия. Влажные кристаллы растворяют в воде, нейтрализуют 50 % раствором гидроокиси натрия. Раствор фильтруют, упаривают под вакуумом до содержания сухих веществ 60 % и направляют на перекристаллизацию. Кристаллы глутамата натрия выделяют из маточного раствора центрифугированием и высушивают током горячего воздуха. Глутамат натрия усиливает вкус пищевых продуктов, способствует сохранению вкусовых качеств консервированных продуктов. Технология получения триптофана. ά-амино-β-индолилпропиновая кислота относится к незаменимым аминокислотам: CH2-NH2CH-COOH Дефицит триптофана приводит к диабету, туберкулезу. В общем виде последовательность биосинтетических реакций образования триптофана следующая: Эритрозо-4-фосфат + фосфоеноилпировиноградная кислота → → 7-фосфо-3 дезокси-D-арабиногептулозовая кислота → → 5-дегидрошикимовая кислота → шикимовая кислота → → хоризмовая кислота → антраниловая кислота → триптофан. Микробиологический синтез осуществляют из мутантных штаммов дрожжей (Candida) и бактерий (Bacillus). Используемая среда (в %): сахароза - 10, мочевина - 0,5, кукурузный экстракт - 2, хлорид кальция, калий фосфорнокислый и сульфат магния. Продолжительность периодической ферментации при 37ºС не превышает 48 ч. Двухступенчатое получение аминокислот из биосинтетических предшественников используют тогда, когда предшественник недорог, а прямая ферментация неэкономична или не разработана. Триптофан можно получить из предшественника – антраниловой кислоты с использованием дрожжей Candida utilis в течение 20 – 24 ч., среда содержит мелассу (10,4 %), мочевину, сульфат магния, фосфаты калия. Для пеногашения используют кашалотовый жир и синтетические кремнеорганические соединения. Выход составляет 60 г/л. . Производство органических кислот. Лимонную, глюконовую, яблочную кислоту получают микробиологическим способом, салициловую, молочную, уксусную – химическим и микробиологическим способом. Время максимальной скорости образования в клетке органических кислот не совпадает по времени со скоростью размножения клеток и накопления биомассы. Сверхсинтез органических кислот происходит при торможении скорости роста продуцента и блокировании процессов биосинтеза. Большинство органических кислот получают, лимитируя рост клеток-продуцентов дефицитом азота или фосфора при избытке углеродосодержащего субстрата. Поэтому микробные процессы получения органических кислот – двухфазные процессы. На первом этапе происходит рост при максимальном накоплении биомассы. На втором этапе – уменьшается скорость роста клеток. Прирост биомассы прекращается и начинается интенсивное кислотообразование. В качестве продуцентов используют бактерии, дрожжевые и грибные культуры. В качестве субстрата используют глюкозу, сахарозу, мелассу, гидролизный крахмал. Методы культивирования: твердофазное, глубинное культивирование. Лимонную кислоту широко используют в пищевой (приготовление соков, кондитерских изделий), фармацевтической и косметической промышленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, так как она полностью метаболизируется живыми организмами и не загрязняет окружающую среду. Лимонная кислота образует хелаты с металлами, поэтому ее применяют для их очистки. Производят лимонную кислоту из сахара или из отходов его производства – мелассы, из содержащих глюкозу гидролизатов древесины и зерна. Мировое производство лимонной кислоты составляет более 300 тыс.т в год. Для промышленного производства лимонной кислоты используют, главным образом, культуру гриба Aspergillus niger и A. wentii. Лимонная кислота (СН2-СООН-СОНСООН СН2СООН) – трех основная кислота, содержащаяся в ягодах и плодах. Область применения: пищевая, фармакологическая, химическая, текстильная промышленность. В качестве продуцента используют: Аspergillus niger. Рост продуцента и синтез кислоты регулируют составом среды (сахара, макро- и микроэлементы). Лимонная кислота является продуктом первичного метаболизма грибов (pH = 1,7-2). Получают лимонную кислоту поверхностным способом на твердой сыпучей среде и жидкой фазе. Принципиальная схема получения лимонной кислоты. С6Н12О6 (глюкоза) ↓ СН3СО (пируват) ↓ ↓ СН2-СО-S-КоА НООС-СН2-СО-СООН (Ацетил - КоА) (Оксалацетат) ↓ ↓ СН2-СООН-СОНСООН-СН-СН2СООН (Лимонная кислота) Уксусная кислота имеет наибольшее значение среди органических кислот. Ее используют при выработке многих химических веществ, включая каучук, пластмассы, волокна, инсектициды. Микробиологический способ производства уксусной кислоты состоит в превращении этанола в уксусную кислоту при участии бактерий Acetobacter и Gluconobacter. Процесс идет в анаэробных условиях в режиме непрерывного культивирования продуцента. Получение уксусной кислоты. Область применения: пищевая, медицинская, микробиологическая промышленность. Микробиологическим способе состоит в конверсии этанола при участии бактерий штаммов Acetobacter, Gluconobacter. Процесс в анаэробных условиях, в непрерывном режиме, при температуре 28 градусов. Питательная среда: 6-12% С2Н5ОН, 1 % бактериального гидролизата, 0,05 % К2НРО4, 0,1 % гидрофосфата аммония, 0,05 % MgSO4. Выход кислоты составляет до 90 кг из 100 кг безводного спирта. После отделения бактериальной биомассы раствор уксуса фильтруют, освобождая от окрашенных, взвешенных частиц. Затем подвергают пастеризации. Для увеличения концентрации исходные растворы вымораживают до 20-30 %. Для получения ледяной уксусной кислоты (98-99,8 %) проводят концентрирование путем перегонки. СН3СН2ОН+О2 → СН3СООН+Н2О В производстве витаминов и органических кислот микробный синтез имеет огромное значение. Особое значение ему уделяется при получение витаминов для кормовых добавок, а также некоторых специфичных для микроорганизмов витаминов. Биотехнологические процессы получения оргкислот постоянно совершенствуются. Производство витаминов. Витамины – незаменимые органические соединения различной химической природы, необходимые любому организму в малых концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Витамины не образуются гетеротрофы, и лишь автотрофы способны синтезировать витамины, в частности растения. Многие микроорганизмы образуют редкие витамины, поэтому синтез витаминов с помощью микроорганизмов стал основной для разработки технологий промышленного производства. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В2, B12, β-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Витамины (от латинского vita – жизнь) это группа низкомолекулярных органических веществ, различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний. Организм человека и животных не синтезирует витамины или синтезирует в недостаточном количестве и поэтому должен получать их в готовом виде с пищей. Витамины обладают исключительно высокой биологической активностью и требуются организму в очень небольших количествах: от нескольких микрограммов до нескольких миллиграммов в день. Большинство витаминов являются коферментами или их предшественниками и участвуют в многочисленных ферментативных реакциях. В природе источником витаминов являются растения и микроорганизмы. Менахиноны и кобаламины синтезируются исключительно микроорганизмами. И хотя химический синтез в производстве большей части витаминов занимает ведущее положение, микробиологические методы также имеют большое практическое значение. К водорастворимым витаминам относят: витамин С, витамины группы В (тиамин или витамин В1, рибофлавин или витамин В2 , витамины В6, В12), пантотеновую кислоту и биотин. К жирорастворимым витаминам относятся витамины А, D, E. Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов — продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Витамины используются в качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процессов. Витамины группы В Получение витамина В2 (рибофлавин). Одна тонна моркови содержит один грамм В2, одна тонна печени содержит шесть грамм, гриб Eremothecium ashbyii продуцирует 25 кг. В качестве посевного материала используют споры гриба, выращенного на пептоне (7-8 дней при t = 29-30ºС). После стерилизации жидкий посевной материал идет в ферментер (время – 3 суток при температуре 28-30ºС концентрация В2 = 1,4 мг/мл). После ферментера культуральную жидкость концентрируют в вакууме, сушат на распылительной сушилке и смешивают с наполнителем. При использовании рекомбинантного штамма можно синтезировать втрое больше продукта за 40 часов ферментации Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2 флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2 — розеофлавину. . При подготовке инокулята гриб пересевают последовательно по схеме: посев на скошенную агаризованную среду в пробирке на жидкую среду, в колбы с нарастающим объемом, в инокулятор. В состав среды для роста продуцентов витамина В2 входят достаточно сложные органические вещества — соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы весьма чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфицированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики. Подготавливают жидкую питательную среду и посевной материал культуры дрожжей в разных емкостях — ферментере и посевном аппарате. Культивирование в ферментере ведут до начала лизиса клеток и появления спор (определяют микроскопически). Температура культивирования 28—30 °С, давление воздуха в ферментере (1—2) • 104 Па, расход воздуха 1,5—2,0 л в минуту на 1 л культуральной жидкости. Выход рибофлавина около 1200 мкг/мл. Для получения кормового препарата рибофлавина культуральную жидкость упаривают под вакуумом до содержания 30—40% сухих веществ. Сироп высушивают в распылительной сушилке, сухую пленку дробят в дробилке до состояния порошка, который расфасовывают. Очень важна хорошая обеспеченность флавинами кормов животных и птиц. Комбикорма должны содержать 5—6 г. рибофлавина на тонну. Добавки витамина В2 в корма обеспечивают нормальный рост животных, высокую яйценоскость кур и выживаемость цыплят. Витамин В12 Витамин В12 открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез корриноидного предшественника витамина B12. Химический синтез корнестерона — структурного элемента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса. Витамин B12 регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, стимулирует образование предшественников гемоглобина в костном мозге; применяется в медицине для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени, полиневрита и т. п. Первоначально витамин B12 получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время — микробиологический синтез. В природе витамин В12 и родственные корринойдные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В12в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи мицелиальные грибы, корринойды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корринойдов широка распространена. Активно продуцируют витамин B12 представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0-8,5 мг/л корринойдов, но получен мутант P. shermaniiM-82, с помощью которого получают до 85мг/л витамина. Истинный витамин B12 в значительных количествах синтезирует Nokardiarugosa. Путем мутации и отбора получен штамм Nokardiarugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В!2. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. eshinospora, M. halophitica, M.fuscaM. chalceae. Высокой кабаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например Methanosarcinabarkeri, M. vacuolataи отдельные штаммы галофильного вида Methanococcushalophilus. В нашей стране в качестве продуцента витамина В12 используют Рropionobacteriumfreudenreichiivar. shermaniil Для получения витамина В12 бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфата аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду вносят предшественник - 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В12 (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Бактерии плохо переносят перемешивание. Применение уплотняющих агентов (агар, крахмал), предотвращающих оседание бактерий, а также использование высокоанаэробных условий и автоматического поддержания рН позволяет получить наиболее высокий выход витамина — 58 мг/л. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 - 5,0 при 85 - 90° С в течении 60 мин с добавлением в качестве стабилизатора 0,25%-ной NaNO2. При получении Ко-В12 стабилизатор не добавляют. Водный раствор витамина охлаждают, доводят рН до 6,8 - 7,0 50%-ным раствором NaOH. К нему добавляют A12(SO4)3*18H2O и безводный FeCl3 для коагуляции белков и фильтруют через фильтр-пресс. Очистку раствора проводят ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с А12О3. С окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. При этом К0-В12 может быть отделен от CN- оксикобаламина. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают при 3 - 4° С 24 - 48 ч. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум - эксикаторе. Для предотвращения разложения Ко-В12 все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Для химической очистки витамина B12 используется его способность образовывать аддукты с фенолом и резорцином. При этом способе отделения витамина от сопутствующих ему факторов упрощается. Промышленный концентрат цианкобаламина обрабатывают водным раствором резорцина (или фенола), выделяют комплекс витамина В]2 с резорцином (или фенолом), далее разлагают его и получают кристаллический препарат. В процессе получения витамина B12 с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. Усовершенствование технологического процесса идет в направлении удешевления компонентов питательных сред (замена глюкозы сульфитными щелоками) и перехода с периодического культивирования на непрерывный процесс. Витамин А и ß- каротин. Важное место в обмене веществ у животных занимает ß -каротин, который в печени превращается в витамин А (ретинол). В организме человека и животных каротины не образуются. Установлено, что многие микроорганизмы - фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи — синтезируют каротин. Характерно, что содержание ß -каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг ß -каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blanesleatrispora— 38 тыс. мкг. Разработаны опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза р-каротина, основной недостаток которых — высокая стоимость сырья и большая длительность процесса. Витамин А (ретинол). Основными источниками витамина А служат яйца, сливки, сметана, коровье молоко, сливочное масло, почки и печень крупного рогатого скота, печень некоторых рыб и морских животных: трески, палтуса, акулы, кита, тюленя и др. Суточная потребность человека в витамине А составляет 2,5 мг. Витамин А в высших растениях и микроорганизмах не синтезируется, но у них образуется его предшественники - каротиноиды. Структурные изомеры каротина способны превращаться в организме человека и животных в витамин А в результате расщепления в печени и слизистой оболочке кишечника. Каротиноиды— наиболее многочисленная и широко распространенная группа природных ферментов. Их образуют высшие растения, водоросли (хлорелла), бактерии. Кроме того, каротиноиды синтезируют некоторые мицелиальные грибы и дрожжи. Изомерные формы каротиноидов обладают различной А-витаминной активностью. Каротиноиды получают с помощью химического синтеза и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов. Химическим путем получают -каротин, витамин А и ряд других каротиноидов, синтез которых осуществляется в заводских масштабах. Из растительных материалов каротиноиды могут быть выделены экстракцией органическими растворителями, не содержащими пероксидов, на рассеянном свету в инертной атмосфере с последующим омылением и хроматографическим разделением. Перед экстрагированием биомасса гомогенизируется при охлаждении. Процесс проводят в темноте в присутствии антиоксидантов. Для извлечения пигментов используют полярные растворители, например ацетон или метанол. Далее каротиноиды переводят в неполярные растворители, такие как гексан или петролейный эфир. Индивидуальные пигменты получают путем хроматографирования в тонком слое силикагеля или алюминия.Впервые каротиноиды были выделены из стручков перца, позже – из желтой репы и моркови Daucus carota, откуда и получили свое название. Каротиноиды получают с помощью химического синтеза и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов. Традиционными источниками получения каротиноидов служат морковь, тыква, шиповник, облепиха и др. Наряду с этим все шире в тех же целях используют мицелиальные грибы и дрожжи. Как продуценты каротиноидов представляют интерес бактерии и водоросли. Перспективными в данном направлении являются некоторые фототрофные бактерии, у которых можно регулировать выход каротиноидов. Биомассу пурпурных бактерий, богатую каротиноидами в Японии используют в качестве добавок в рацион кур, что способствует более интенсивному окрашиванию желтка. Продуцентами -каротина, широко применяемыми для промышленного получения этого пигмента, являются мукоровые грибы Blakesleatrispora и Choanephoraconjuncta. При совместном культивировании разнополых штаммов этих грибов на специально подобранных средах выход каротина составляет около 3 – 4 г/л среды. Среда содержит растительные масла, керосин, поверхностно-активные вещества и некоторые специальные стимуляторы. В последние годы в целях экономии для получения -каротина начали применять вторичные продукты отхода – кукурузный экстракт и гидрол. В качестве стимуляторов синтеза каротина используют цитрусовую пульпу и мелассу, а также циклогексан. Процесс получения бета-каротина при использовании В. trispora многостадиен. На первом этапе выращивают отдельно положительные и отрицательные штаммы гриба. Следующий этап – совместное выращивание разнополых штаммов в ферментаторе при 26 0С и достаточно интенсивной аэрации. На третьей стадии выращивания смешанную культуру вносят в большой ферментатор и инкубируют ее в течение 6-7 сут при той же температуре и аэрации. При использовании соответствующих стимуляторов можно как увеличивать выход продукта, так и изменять его состав. Исследования получения каротиноидов продолжаются. На сегодняшний день показано, что удешевить процесс можно за счет использования отходов, остающихся при производстве целлюлозных материалов. Установлено, что синтез каротиноидов увеличивается почти в 7 раз, ели источником углерода в среде будет целлобиоза. Каротиноиды широко применяются в сельском хозяйстве, медицине и пищевой промышленности. -Каротин используют главным образом в пищевой промышленности, а также при изготовлении лекарств и косметических средств. Витамины группы D Микробиологическим путем получают и эргостерин - исходный продукт жирорастворимого витамина D2. В группу витаминов D объединяют родственные соединения, важнейшими из которых являются витамины D2 и D3. В организме человека и животных эти соединения регулируют усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной ткани. Недостаточное содержание витамина приводит к возникновению рахита. Суточная потребность человека в витаминах группы D составляет 0,025 мг/г. Витамины группы D встречаются только в животном организме. В растениях содержатся стеролы, из которых под влиянием ультрафиолетового облучения образуются витамины этой группы. Наиболее важным из этих стеролов является эргостерол, содержащийся в большом количестве в дрожжах и пленевых грибах, используемых в качестве исходного продукта при промышленном получении витамина D. Наиболее богатыми источниками витаминов группы D являются рыбий жир, печень млекопитающих и птиц. Витамины содержатся также в молоке (0,02-0,1 мкг/100 г), сливочном масле, в яичных желтках (от3,5 зимой до 12,3 мкг/100 г летом). Источником эргостерина являются фитопланктон, бурые и зеленые водоросли, но особенно богаты эргостерином дрожжи и плесневые грибы, которые и служат сырьем для его промышленного получения. Эргостерин – основной стерин дрожжей: содержание его составляет 0,2-0,5 %, но в некоторых случаях достигает 10 % от сухой массы дрожжей. Культурные расы дрожжей всегда богаче стеринами, чем дикие; наибольшее количество содержат пекарские и пивные дрожжи. Из дрожжей наиболее высокие количества стеринов синтезируют штаммы Saccharomycescarlsbergensis, биомасса которых может содержать более 10 % эргостерина. Эргостеролсинтезирующей способностью обладают дрожжи рода Rhodotorulaglutinis (0,7-0,9 %), Candidautilis (0,4-0,6 %), C. tropicalis (0,2-0,3 % ). В мицелии грибов Aspergillus и Penicillium содержание стеринов может достигать 1,2-1,4 % в расчете на сухой мицелий. В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи Saccharomycescarlsbergensis и Saccharomyces. Cerenisiae, а также мицелиальные грибы. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота. Синтез стеринов не связан с ростом дрожжей. Содержание стеринов повышается по мере старения культуры и стеринообразование продолжается после остановки роста дрожжей. В анаэробных условиях дрожжи содержат мало эргостерина и много сквалена. Дрожжи, а также грибы рода Aspergillus и Penicillium используют для получения кристаллического витамина D2 или концентрата. В качестве концентрата в животноводстве применяют облученные сухие дрожжи. Для получения кристаллического витамина D2 дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при 110 0С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 75-78 0С и после охлаждения до 10-15 0С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50 % сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В. Витамин D2 получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, размельчают и дважды обрабатывают при 78 0С трехкратным объемом спирта. Спиртовые экстракты сгущают до 70 % содержания сухих веществ. Таким образом, получают липидный концентрат, который затем омыляют раствором едкого натра. Стерины остаются в неомыленной фракции. Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 0 0С. Очистку кристаллов проводят путем перекристаллизации, последовательным промыванием 69 %-м спиртом, смесью спирта и бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина сушат, растворяют в эфире, облучают, после чего отгоняют, а раствор витамина концентрируют и кристаллизуют. Источником получения эргостерина может служить мицелий грибов, остающийся как отход антибиотической промышленности и производства лимонной кислоты. |