Разработка методик анализа и стандартизация пефармина, проявляющего гипотензивное действие 14. 04. 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия
 Скачать 1.35 Mb.
|
1 2  четвертой главе изложены результаты изучения кислотно-основных свойств Пефармина , разработки и валидации методик количественного определения исследуемого БАВ методом ацидиметрического титрования в среде протогенных растворителей (уксусного ангидрида, ртути окисной ацетата) и экстракционного титрования.Одним из важных физико-химических параметров, характеризующих кислотно-основные свойства соединения, является константа ионизации. Константа диссоциации определена для исследуемого вещества как основания (концентрация 0,001 М) потенциометрическим методом. Рассчитанные по результатам титрования значения рКа в водном и спиртовом растворах составили 5,12 и 6,08 соответственно, что позволяет сделать вывод о слабых основных свойствах исследуемого вещества. А цидиметрическое титрование в среде уксусного ангидрида. Комбинации протогенных растворителей подбирали исходя из рКа Пефармина и рекомендуемых условий для титрования известных лекарственных веществ. Нами проведено титрование потенциометрическим методом в следующих условиях: муравьиная кислота – уксусный ангидрид (1:10, 2:10), уксусная кислота ледяная – ртути окисной ацетата раствор (10:5, 15:5, 10:3, 15:3), уксусная кислота ледяная – уксусный ангидрид (10:10). Навеску БАВ титровали 0,1 М раствора кислоты хлорной в кислоте уксусной ледяной до появления скачков ЭДС. Во всех смесях видны четкие скачки потенциала. График зависимости ΔЕ/ΔV от объема титранта (рис. 3) показывает, что смесь 1 мл муравьиной кислоты и 10 мл уксусного ангидрида дает более выраженный скачок потенциала в точке эквивалентности. Таким образом, данную смесь использовали в дальнейшем для разработки методики количественного определения, используя в качестве индикатора кристаллический фиолетовый. Рис. 3. Кривые титрования исследуемого БАВ 0,1 М хлорной кислоты раствором По разрабатываемой методике осуществляли количественный анализ исследуемого БАВ. Для фактической оценки пригодности предлагаемой аналитической методики проведена валидация по показателям: линейность результатов, воспроизводимость, точность и прецизионность в аналитической области методики.
Таблица 3 Метрологические характеристики сходимости результатов (n = 7)
Таблица 4 Метрологические характеристики воспроизводимости результатов (n = 7)
Испытания внутри- и межлабораторной воспроизводимости валидируемой методики, проведенные в лабораториях кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО и РИЦ «Фарматест» ПГФА, указывают на соответствие полученных результатов параллельных экспериментов. В ФСП на Пефармин методика включена в раздел «Количественное определение».Нами также разработана методика ацидиметрического титрования БАВ в среде ртути окисной ацетата раствора. Валидацию проводили теми же методами, что и в случае титрования в среде уксусного ангидрида по показателям: линейность результатов, воспроизводимость и точность в аналитической области методики. И так же осуществляли количественный анализ исследуемого БАВ.
Таблица 5 Метрологические характеристики сходимости результатов (n = 7)
Таблица 6 Метрологические характеристики воспроизводимости результатов (n = 7)
Экстракционное титрование. Одним из вариантов титриметрического метода является экстракционное титрование с применением в качестве стандартного раствора натрия додецилсульфата (натрия лаурилсульфата). Способ позволяет проводить количественное определение органических азотсодержащих оснований или их солей в присутствии продуктов разложения, вспомогательных веществ лекарственных форм. Важнейшими условиями, определяющими количественную экстракцию образующегося в результате взаимодействия вещества с натрия лаурилсульфатом (ЛСН) ионного ассоциата, являются рН водной фазы, соотношение водной и органической фаз, выбор индикатора. При изучении влияния этих факторов опыты ставили таким образом, чтобы изменялся только один из них при постоянном значении всех остальных. Найденное в опыте процентное содержание вещества служило критерием оценки экстракции. Для установления оптимальной кислотности водной фазы готовили хлористоводородную кислоту семи концентраций: 0,01 М, 0,02 М, 0,025 М, 0,05 М, 0,1 М, 0,25 М, 0,5 М. На основании проведённых исследований сделан вывод о том, что взаимодействие вещества с ЛСН и количественная экстракция образующихся при этом продуктов идёт при рН 1,87-2,30, что соответствует 0,025 М раствору хлористоводородной кислоты, которую использовали в дальнейшем для создания кислотности среды. Установление оптимального соотношения водной и органической (хлороформ) фаз титрования проводили используя соотношения: 2:1, 1:1, 1:1,5, 1:2. Оптимальными из них, как установил эксперимент, являются 1:1,5 и 1:2. С целью экономии экстрагента возможно применение методики титрования при соотношении фаз 1:1,5, как и поступали в дальнейших исследованиях. С целью выбора индикатора были приготовлены растворы из 0,1 % спиртовых растворов диметилового желтого и метиленового синего в объемных соотношениях 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 и 5:1, соответственно, а также использован основной индикатор раствор диметилового жёлтого. Состав исследуемых индикаторов практически не влияет на результаты количественного определения вещества и при определенном навыке возможно титрование с любым из перечисленных составов индикатора. Однако использование при титровании смешанного индикатора 3:1 позволяет наиболее четко фиксировать точку эквивалентности, оба цвета являются дополняющими друг друга. Валидацию проводили теми же методами, что и в случае ацидиметрического титрования по показателям: линейность, воспроизводимость и точность результатов.
Таблица 7 Метрологические характеристики сходимости результатов (n = 7)
Таблица 8 Метрологические характеристики воспроизводимости результатов (n = 7)
П  ятая глава посвящена исследованию Пефармина хроматографическими методами. В ней представлены экспериментальные исследования по установлению оптимальных условий определения посторонних примесей в субстанции исследуемого БАВ методами ТСХ и ВЭЖХ, разработке методики определения содержания остаточного органического растворителя (толуола) на основе ГЖХ.Хроматография в тонком слое сорбента. Для проведения эксперимента нами использованы хроматографические пластинки двух типов: Силуфол УФ-254 и Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ размером 5 х 12 см. С целью поиска подвижной фазы, обеспечивающей эффективное разделение основного вещества и возможных примесей, нами исследовано 28 систем растворителей, описанных в литературе при анализе азотсодержащих органических оснований и их солей. Хроматографирование проводили с помощью общепринятых для ТСХ операций, нанося на линию старта 0,01 мл (100 мкг) и 0,02 мл (200 мкг) 1 % спиртового раствора анализируемого вещества. Обнаружение вещества и его возможной примеси, в качестве которой предположительно может быть полупродукт синтеза – безазотистое соединение, проводили следующими способами: - облучением пластинки в УФ свете (наблюдается фиолетовое свечение анализируемого вещества и белая флуоресценция примеси), что является наиболее приоритетным способом детектирования, т.к. не требуется затрат на реактивы; - обработкой парами йода (коричневые пятна примеси и анализируемого вещества);
В 5 системах растворителей на хроматограммах наблюдали два четких пятна: основного вещества и примеси, но наиболее оптимальной подвижной фазой является система, содержащая следующие растворители: этилацетат:метанол:аммиака раствор 25 % (17:6:5). В этом случае Rf анализируемого вещества (0,73) и примеси (0,15) значительно отличаются друг от друга, пятна четко видны и хорошо проявляются цветореагентами. В выбранных оптимальных условиях проанализировано 11 серий вещества. В качестве стандартного образца вещества свидетеля (СОВС) использовали основное вещество, ориентируясь на площадь пятна с содержанием 0,5 мкг. Проведенный анализ показал, что площадь пятна примеси во всех исследованных сериях не превышает площади пятна СОВС. Поэтому нормировано содержание примеси не более 0,5 %, что и введено в проект ФСП. В ысокоэффективная жидкостная хроматография. Исследование Пефармина проводили на жидкостном хроматографе «Shimadzu LC Prominence», оборудованном колонкой из нержавеющей стали размером 25 см × 4,6 мм и диодноматричным детектором. Экспериментально установлены следующие условия хроматографирования: сорбент обращеннофазный (Discovery® С 18) с размером зерен 5 мкм, подвижная фаза: ацетонитрил – фосфатный буферный раствор (рН 3) с добавлением 0,0005 М ионпарного реагента октилсульфоната натрия, скорость потока элюента – 1,5 мл/мин, температура колонки – 35 °С, спектрофотометрический детектор с аналитической длинной волны 210 нм. В указанных условиях время удерживания основного компонента составило 3,70 мин, примеси – 9,07 мин (рис. 4). Нормировано содержание примеси – не более 0,5 %, суммы всех неидентифицированных примесей не более 1,0 % (табл. 9). Р ис. 4. ВЭЖХ хроматограмма раствора Пефармина (С = 1 мг/мл, n = 3)Таблица 9 Р езультаты определения примесей в лабораторных образцах Пефармина методом ВЭЖХ
О пределение остаточного органического растворителя методом газожидкостной хроматографии. Для очистки Пефармина на последней стадии синтеза используется толуол, который, согласно ОФС 42-0057-07, относится ко 2 классу (негенотоксичный растворитель), его предельно допустимое содержание в лекарственном средстве составляет 890 ppm. Исследование проводили на хроматографе «Кристалл 2000 М», оснащенным капиллярной колонкой производства фирмы НР-FFAP (Free Fatty Acide Phase) 50 м × 0,32 мм; ввод пробы осуществляли с помощью дозатора равновесного пара (производство СКБ «Хроматек»). Время удерживания толуола в подобранных условиях (дозатор равновесного пара, нагретый до температуры 80 °С; температура испарителя 160 °С; детектора 200 °С; газ-носитель – азот; время испарения 16,0 мин) составило 5,9 мин. Полученные результаты (табл. 10) позволяют сделать заключение, что во всех исследуемых образцах Пефармина содержание толуола не превышало значения регламентированного ОФС – 890 ppm.Таблица 10 С одержание остаточного растворителя (толуола) в лабораторных образцах Пефармина
В главе шестой изложен эксперимент и приведены результаты изучения стабильности исследуемого вещества, установлению срока его годности методом «ускоренного старения» и хранения в естественных условиях. С учетом разработанных методик и в соответствии с рекомендациями ГФ XII изучена стабильность субстанции Пефармина изотермическим методом «ускоренного старения». Эксперимент проводили в соответствии с требованиями действующей инструкции И 42-2-82 при температуре 60 °С. Термостатированию подвергали пять образцов субстанции БАВ, помещенных в банки из светозащитного стекла с навинчивающейся крышкой, снабженной прокладкой из пищевой резины (аналог предполагаемой заводской упаковки). Контроль качества испытуемых образцов проводили через промежутки времени, эквивалентные 6 мес. хранения при обычных условиях (11,5 сут.), по показателям: описание, подлинность (ИК спектроскопия, химические пробы), температура плавления, посторонние примеси (методом ТСХ), количественное содержание. При этом идентификацию, определение органических примесей и установление количественного содержания вещества в субстанции осуществляли по разработанным нами методикам (табл. 11).Результаты эксперимента показали, что субстанция анализируемого вещества остается стабильной в течение 115 сут. Экспериментального хранения (соответствует 5,5 лет). Температура хранения, позволяющая обеспечить установленный срок годности, 19 – 29 °С. И зучена стабильность образцов 3 опытных серий Пефармина при хранении в сухом защищенном от света месте при комнатной температуре в банках оранжевого стекла по ОСТ 64-2-71-80 с навинчивающимися пластмассовыми крышками по ОСТ 64-2-87-81. Проведенные исследования позволили сделать вывод о стабильности нового БАВ в течение периода времени не менее 3 лет, что согласуется с данными экспериментального хранения при повышенных температурах.Таблица 11 Н ормы качества субстанции Пефармина , контролируемые при исследовании стабильности методом «ускоренного старения» и при хранении в естественных условиях
В главе седьмой приведены расчеты себестоимости и цены таблеток и раствора для инъекций, содержащих Пефармин , выполненные исходя из стоимости сырья и затрат на производство.В результате расчета показано, что стоимость производства 100 г Пефармина при выходе 44,7 % составляет 1549,60 руб. При расчете себестоимости таблеток за основу взята средняя дозировка распространенных на фармацевтическом рынке гипотензивных лекарственных средств - 10 мг, средний вес одной таблетки 0,3 г, при этом себестоимость 1 упаковки составила 10,20 руб. С ебестоимость инъекционной формы рассчитывали, исходя из имеющихся в настоящее время на фармацевтическом рынке подобных лекарственных препаратов. За основу нами взят Энап Р в дозировке 1,25 мг/мл (ампулы по 5 мл, в коробке 5 штук). При этом себестоимость упаковки аналогичной лекарственной формы Пефармина составила 23,80 руб.Р езультаты исследований показывают, что цена Пефармина конкурентноспособна в пределах цен других производителей. Так, упаковка его раствора для инъекций в дозе 1,25 мг/мл (ампулы по 5 мл в коробке № 5) ориентировочно будет стоить 84,90 руб. в сравнении с Энапом Р 280,00 руб., а таблетки 10 мг № 20 – 30,60 руб., по сравнению с эналаприлом от 28,00 до 83,00 руб.Более того, есть запас финансовой прочности в случае, если возрастут затраты на производство таблеток и растворов для инъекций, так как исследуемое БАВ для предприятия новое. ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
Автор выражает благодарность зав. кафедрой органической химии ПГФА проф. В.И. Панцуркину за предоставление для исследований нового БАВ – N-2-(2′-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида, зав. кафедрой физиологии с основами анатомии проф. Б.Я. Сыропятову за проведение биологических испытаний, зав. кафедрой микробиологии проф. Т.Ф. Одеговой за проведение микробиологических исследований, зав. лабораторией доц. Ю.Н. Карпенко и руководителю РИЦ «Фарматест» доц. Т.Л. Малковой за предоставление хроматограмм ВЭЖХ, научному сотруднику РИЦ «Фарматест» Е.Ю. Тумилович за запись и обработку хроматограмм ГЖХ, зав. кафедрой физики и математики ПГФА доц. М.И. Вахрину за запись спектров ЯМР 1Н, научному сотруднику ИТХ УрО РАН Т.А. Внутских за выполнение дериватографических исследований, старшему научному сотруднику ИТХ УрО РАН А.А. Горбунову за запись ИК и хроматомасс-спектров. Непогодина Екатерина Александровна (Россия) Р  азработка методик анализа и стандартизация Пефармина , проявляющего гипотензивное действиеП роведено химико-фармацевтическое исследование нового биологически-активного вещества N-2-(2′-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида, с условным названием Пефармин , как необходимого этапа доклинического изучения его в качестве потенциального лекарственного средства. С этой целью установлены физические константы, УФ и ИК спектрофотометрические характеристики, разработаны методики анализа субстанции и нормы качества; на основе методов ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ предложены способы обнаружения возможных примесей в субстанции, разработаны и валидированы методики количественного определения, установлены стабильность и срок годности исследуемого вещества, осуществлен прогноз затрат на производство лекарственных форм (инъекционной и таблетированной) нового вещества.Nepogodina Catherine Aleksandrovna (Russia) D evelopment of methods of the analysis and standardization Pefarmine , showing hypotensive actionT he chemical-pharmaceutical researches have been carried out for new biologically active substance N-2-(2'-methylphenoxy)-ethylmorpholine hydrochloride, which named Pefarmin , necessary stage its preclinical study as a potential medical product is conducted. For this aim the physical constants, UV- and IR-spectrophotometric characteristics were set, methods of analysis of a new substance and quality standards were developed; on the basis of methods TLC, HPLC and GLC ways of detection of possible impurity in a substance are offered, methods of quantitative determination are developed and validated, stability and working life of investigated substance are established, the forecast of expenses for manufacture of medicinal forms (injection and pods) of new substance is carried out.1 2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
, %
результате химико-фармацевтических исследований субстанции Пефармина - N-2-(2′-метилфенокси)-этилморфолина гидрохлорида нормированы показатели, характеризующие подлинность и доброкачественность нового соединения: внешний вид, растворимость, содержание летучих веществ и воды, сульфатной золы и тяжелых металлов, рН, прозрачность и цветность 1% водного раствора. Исходя из основных структурных элементов исследуемого вещества, предложены реакции подлинности с реактивами Бушарда-Вагнера, Драгендорфа, Зоненштейна и Марки, пикриновой кислотой, серной и азотной кислотами концентрированными и раствором серебра нитрата, из числа которых в ФСП рекомендованы реакции с серной кислотой концентрированной и раствором серебра нитрата. 
при λ = 268 ± 1 нм от 49 до 54) и как индивидуальная характеристика вещества его ИК спектр. У всех синтезированных серий структура вещества подтверждена методами Н1 ЯМР и хроматомасс-спектроскопии. Методом дериватографии определены термические характеристики: температура плавления (плавится с разложением) и начала деструкции.