гистотехника. Реферат выполнил(а) студентк(а) группы 222 Побединская М. В
 Скачать 0.58 Mb.
|
|
Бюджетное профессиональное образовательное учреждение Воронежской области «Воронежский базовый медицинский колледж» Гистологическая техника РЕФЕРАТ
Воронеж 2021 г. Содержание Ведение…………………………………………………………………………2 1. Взятие материала для изготовления гистологических препаратов………3 1.1 Взятие и этикетирование материала………………………………………4 2. Задачи и правила фиксации…………………………………………………6 2.1 Фиксаторы…………………………………………………………………..7 2.2. Фиксация…………………………………………………………………...8 3. Обезвоживание………………………………………………………………9 4. Уплотнение………………………….……………………………………….9 4.1 Пропитывание и заливка………….……………………………………….9 4.2 Заливка в парафин…………………………………………………………9 4.3 Удаление спирта…………………………………………………………..10 5. Получение срезов…………..………………………………………………10 5.1 Микротомы………………..………………………………………………10 5.2 Микротомные ножи…………...………………………………………….12 6 Размещение срезов на стекле………………………………………………13 7 Окрашивание и заключение срезов………………………………………..14 7.1 Красители………………………………………………………………….14 Заключение…………………………………………………...……………….16 Список литературы……………………………………………...……………17 Введение Гистологическая техника — это техника приготовления гистологического препарата. Гистологическим препаратом может быть срез органа, ткани, мазок, отпечаток, пленочный препарат, культура тканей. Во всех случаях гистологический препарат должен отвечать таким требованиям: 1. Быть прозрачным, т.е. пропускать поток света. Для этого изготавливают достаточно тонкие срезы органов, тканей, клеток. 2. Быть контрастным, что достигается окрашиванием препарата. 3. Быть постоянным, т.е. сохраняться длительное время и служить в качестве своеобразного документа. Все эти требования к гистологическому препарату и выполняются в ходе гистологической техники. 1. Взятие материала для изготовления гистологических препаратов Сбор материала является первым этапом в приготовлении гистологических препаратов, и от того, насколько правильно выполнена эта процедура, зависит успех всей работы. Существует несколько путей получения материала: 1) от животных, умерщвленных специально для этих целей; 2) от животных и людей в результате прижизненного оперативного иссечения кусочков тканей из органов живого организма (биопсия); 3) взятие материала от трупа. Там, где возможно, следует предпочесть первые два способа, так как они позволяют приготовить препараты, наиболее полно отражающие прижизненное состояние микроструктур. Качество трупного материала находится в прямой зависимости от времени, прошедшего с момента смерти организма, так как в органах и тканях очень скоро начинают развиваться посмертные изменения. Об этом следует постоянно помнить и по возможности стремиться к максимальному сокращению сроков взятия материала. В нашей стране вскрытие трупов людей разрешено не ранее чем через 12 ч после констатации смерти врачом. 1.2. Взятие и этикетирование материала Главными требованиями при взятии материала являются: максимальное сокращение сроков взятия, минимальное травмирование тканей, создание оптимальных условий для фиксации. Первое и второе требования обеспечиваются хорошим освоением техники умерщвления и вскрытия, а также применением очень острых режущих инструментов (скальпель, бритва, ножницы). При иссечении материала необходимо максимально бережно обращаться с тканями: участки органа, подвергшиеся травмированию (например, при зажиме пинцетом), не следует оставлять для исследования. Инструмент для вскрытия и, особенно для взятия материала необходимо хранить отдельно, своевременно затачивать и не применять для других целей. Благоприятные условия для фиксации создаются правильным выбором размера фиксируемого материала, ибо необходимо обеспечить равномерное и сравнительно быстрое проникновение фиксирующей жидкости во всю его толщину. Поэтому нужно вырезать кусочки толщиной не более 5 — 10 мм. Поперечный же и продольный размеры не имеют столь важного значения и определяются задачами исследования. Следует помнить, что предупреждение исследуемого материала от высыхания является одним из важнейших условий. Поэтому производить умерщвление и вскрытие животных следует лишь после того, как подготовлено все необходимое для быстрой фиксации. Если подсыхание все же возможно, то исследуемый материал необходимо смачивать изотоническим раствором хлорида натрия, смачивание водой категорически воспрещается, так как в силу разности осмотического давления вода проникает в ткани и вызывает разрушение микроструктур. Так, если орган состоит из участков, различных по своему строению, необходимо производить разрез таким образом, чтобы все они попали в кусочек, а при невозможности — брать кусочки отдельно из каждого участка. Например, при взятии кусочков мозга человека или крупных лабораторных животных приходится вырезать участки из определенных отделов. Из почки можно вырезать один кусочек, охватывающий всю толщину органа от капсулы до лоханки, что обеспечивает попадание в него всех слоев. Если же орган имеет однородное строение (большинство желез, мышцы), то выбор места для вырезания кусочка не имеет большого значения. Особые приемы требуются для взятия материала, имеющего строение пленок, и из полых мышечных органов, выстланных слизистой оболочкой, так как пленки в фиксирующей жидкости сморщиваются, а стенка полого органа после разрезания вследствие сокращения мышечной оболочки изгибается дугообразно слизистой оболочкой наружу (кишечник, пищевод, желудок, мочевой пузырь и т.д.). Поэтому, прежде чем брать такой материал, необходимо ванночку или стеклянную чашку с плоским дном залить расплавленным воском так, чтобы толщина покрытия равнялась 1,5 — 2 см, и дать ему остыть. Следует также приготовить иглы для накалывания (металлические из нержавеющего материала, стеклянные или растительные), фиксирующие жидкости и лишь после этого приступить к взятию материала. Если необходимо приготовить гистологический препарат из стенки кишечника, иссекают нужный отрезок органа, ополаскивают его в изотоническом растворе хлорида натрия (чтобы не высохла серозная оболочка), разрезают вдоль (напротив брыжейки) и накалывают с помощью игл на восковую или пробковую подушку в расправленном состоянии слизистой оболочкой кверху. При расправлении нужно следить, чтобы не перерастянуть взятый кусочек, так как это приведет к искажению истинного взаимоотношения слоев и деформации тканей. Подобным образом берут материал из стенки желудка и пищевода, а также объекты, имеющие пленочное строение (брыжейка, сальник, мозговые оболочки). После 1/2-2 ч пребывания в фиксирующей жидкости обрабатываемый материал освобождают от игл, вырезают кусочек, выбрав нужный участок, и помещают в сосуд с фиксатором для продолжения фиксации. Применяют и другой способ фиксации небольших полых органов — без разрезания их стенок. Для этого нужный отрезок органа перевязывают с одного конца, заполняют фиксирующей жидкостью и, перевязав противоположный конец, помещают в сосуд с фиксатором. Этим достигается более быстрое проникновение фиксирующей смеси в ткани органа (одновременно с двух сторон) и сохранение естественной формы органа. Взятие материала из легкого также имеет некоторые особенности, ибо легкое всегда содержит воздух и ткань его плавает, не погружаясь полностью в фиксирующую жидкость. Для полного погружения необходимо кусочек органа завернуть в марлю вместе с каким-либо грузом (стекло, фарфор, нержавеющий металл), а если нужно фиксировать долю или все легкое, то груз привязать к трахее или бронху (рис.1) Фиксация тканей легкого и кишечника.   Рис. 1. При взятии материала из кости необходимо выпиливать кусочки мелкозубчатой пилой (костной или лобзиком). Это позволяет сохранить архитектуру исследуемой костной ткани. Помимо гистологических препаратов в виде срезов, полученных с кусочков органов, следует упомянуть о мазках и отпечатках. Первые находят широкое применение при исследованиях костного мозга и периферической крови, вторые — паренхиматозных органов и эпителиальных покровов слизистых оболочек. Общим и обязательным условием для приготовления таких препаратов является наличие тщательно вымытых и обезжиренных предметных стекол, а для мазков еще и стекол с отшлифованными поперечными ребрами. 2. Задачи и правила фиксации Значение и общие правила фиксации Фиксация, как указывает сам термин, представляет собой закрепление, сохранение в обрабатываемом кусочке органа того строения, которое он имел при жизни. В основе действия фиксаторов лежат физико-химические процессы ц в первую очередь процесс коагуляции белков. Фиксирующая жидкость должна отвечать двум основным требованиям: 1) достаточно быстро проникать в ткани и 2) действовать «мягко», не вызывая грубых нарушений тканевых структур (сморщивание, чрезмерное уплотнение и т. п.). Необходимо также учитывать то обстоятельство, что ткани и органы химически и морфологически неоднородны, а их структурные элементы в свою очередь существенно отличаются друг от друга, в силу чего фиксирующая жидкость оказывает неодинаковое воздействие на различные компоненты, входящие в состав фиксируемого материала. Размер исследуемых кусочков должен быть таким, чтобы произошло полное его пропитывание в оптимальные для данного фиксатора сроки. В среднем же для большинства фиксаторов берут кусочки толщиной 5 - 10 мм. 2.1. Фиксаторы Фиксация полученного гистологического материала — это воздействие на него химическими веществами, а также физическими факторами, что препятствует дальнейшему разрушению тканей объекта, сохраняет его структуру. Физические фиксирующие факторы— замораживание (твердой углекислотой, в жидком азоте, кислороде и т.д.), воздействие высокой температуры, рентгеновское облучение. Все эти факторы вызывают гибель бактерий и инактивируют собственные ферменты тканей, способствуя сохранению гистологического материала. Химические фиксаторы также вызывают гибель микробов и собственных ферментов тканей, стабилизируют структуру объекта. Различают простые и сложные химические фиксаторы. Простые фиксаторы состоят из одного химического вещества (например, формалин, спирт, уксусная кислота, ацетон, метил и др.). Эти фиксаторы, однако, приводят к определенным нарушениям структуры гистологического материала. Так, формалин вызывает сморщивание его, уменьшение в размерах. Уксусная кислота, наоборот, вызывает набухание. Поэтому чаще применяют сложные фиксаторы, в которых отрицательное действие простых фиксаторов нивелируется. Сложные фиксирующие жидкости: Спирт-формалин жидкость Буэна (для фиксации всех тканей кроме ткани почки) жидкость Карнуа (применяется при быстрой фиксации и ускоренной проводки – хорошо сохраняет структуру ядра клетки) этанол – уксусная кислота и метанол – уксусная кислота (для объектов, в которых планируется выявлять аргентофильные белки ядрышкового организатора) Фиксаторы, содержащие сулему: В5, жидкость Ценкера, Максимова, Гелли и «Суза» Гейденгайна. Формалин (простой фиксатор) Формалин (формол) наиболее распространенная и универсальная жидкость с характерным резким запахом. Обычный продажный формалин представляет собой 40% водный раствор формальдегида. Широкое применение формалин получил благодаря ряду свойств: - высокой степени диффузии; - способности хорошо сохранять форму, окраску и структуру исследуемого объекта; - оказывать длительное фиксирующее действие (до нескольких лет), существенно не ухудшая при этом качество материала; - хорошо сохранять жиры и липоиды. Побочные действия формалина. Длительное хранение препаратов в концентрированном растворе формалина придает тканям чрезмерную плотность, затрудняющую дальнейшую обработку и ухудшающую качество препарата. Устранить этот недостаток можно путем помещения материала на 2 недели в 1 %-й раствор нитрата серебра или 10 %-й раствор лимонной кислоты. Длительное хранение в 10 %-м растворе формалина приводит также к набуханию объекта, что необходимо помнить при его измерении после фиксации. При фиксации формалином в препаратах нередко появляется темнокоричневый кристаллический осадок — результат взаимодействия формалина с находящимся в тканях гемоглобином. Его удаляют путем помещения неокрашенных срезов в 1-5 %-й раствор аммиака или 70 %-й этиловый спирт на различные сроки (от 5 мин до 4 ч). Затем препарат тщательно промывают и ведут дальнейшую обработку. 2.2. Фиксация. Следующий и очень ответственный этап в гистологической технике, призванный сохранить ткани и органы в состоянии, близком к тому, в котором они находились до момента смерти. В тканях при фиксации происходят сложные физико-химические изменения, в частности коагуляция (осаждение) белков. Фиксаторов, которые бы полностью сохраняли структуру, нет. Они существенно уплотняют ткани, уменьшают их объём, приводят к необратимым изменениям. Фиксатор в разной степени сохраняет разные структуры. Если при фиксации вещество разрушается, то нефиксированный материал замораживают и высушивают на холоде (лиофилизация). При этом не происходит денатурации белков, снижение активности ферментов, но изменяется форма клеток. Чтобы не произошло образования кристаллов, производят быструю заморозку при температуре от 30 до 60° С. Высушивание ускоряется в условиях вакуума (в специальных аппаратах). Заливку материала в среды проводят быстро, во избежание увлажнения Цель фиксации - убить клетку, прекратить происходящие в ней процессы (прежде всего ферментативные) и, по возможности, сохранить ее прижизненное строение. Существует ряд общих правил фиксации: 1) объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемого кусочка ткани; 2) фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон, по этому на дно сосуда кладут вату или кусочек фильтровальной бумаги или подвешивают кусочек на нитке; 3) продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего от скорости проникновения фиксатора в ткань; 4) различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические компоненты клетки. 3. Обезвоживание Начиная с этого этапа и до самого конечного момента приготовления гистологического препарата следует строго придерживаться правила постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани. После промывания кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации. Для проведения процедуры приготавливают необходимое количество бюксов или стаканчиков с притертыми крышками,(можно использовать не большие банки с завинчивающейся крышкой ) этикетируют их и заливают спиртами: 50, 60, 70, 80 и 96% (по два стаканчика), 100% (два стаканчика). Такой последовательный ряд сосудов получил название гистологической батареи. 4. Уплотнение  4.1. Пропитывание и заливка При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол). Заливка в парафин. При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37º до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54º -56º в трех порциях парафина. Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду. Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки. Уплотнения также можно добиться замораживанием кусочка органа (срочная биопсия). 4.2. Заливка в парафин Этот метод широко распространен в исследовательских гистологических лабораториях благодаря относительной быстроте заливки (в течение 1—2 дней после обезвоживания), возможности приготовления серийных срезов, а также тонких срезов для цитологических исследований (толщина 1-3 мкм), удобству хранения блоков и неокрашенных срезов (практически неограниченное время). К недостаткам метода следует отнести значительное сжатие исследуемого материала (до 20%), вызываемое воздействием высокой температуры в процессе пропитывания парафином. Богатые водой, рыхлые ткани малопригодны к заливке в парафин. Существует несколько сортов парафина: мягкие (точка плавления 45—54°С) и твердые (точка плавления 58—60°С). В большинстве случаев для заливки применяют парафин с точкой плавления 54—56°С.  4.3. Удаление спирта Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал обрабатывают одним из растворителей парафина, обладающим способностью вытеснять спирт. К таким веществам относятся хлороформ, бензол, толуол, ксилол, сероуглерод и др. Чаще используют хлороформ и бензол. Толуол и ксилол делают кусочки более твердыми. 5. Получение срезов Толщина парафиновых срезов колеблется от 3-5 до 15 мкм и зависит как от качества заливки материала, так и от ножа. Если заливка произведена правильно и качественно, парафиновые блоки готовят для приготовления тонких срезов, необходимых для исследования под микроскопом, достигается это резкой кусочков на особых приборах, называемых микротомами (Рис.2 .). Подобные приборы обеспечивают получение срезов нужной толщины. 5.1. Микротомы Микротом – это специальное механическое устройство, предназначенное для приготовления гистологических срезов определенной толщины. В работе часто используется санный микротом (МС-2). Прибор получил название благодаря тому, что нож и механизм подачи с зажимом для блока (объектодержателем) движутся на специальных салазках.   Рис. 2. Правила резания на микротоме Предпосылкой для получения хороших гистологических срезов служит правильный выбор угла наклона ножа и угла резания. Под углом наклона понимают угол, образуемой нижней поверхностью ножа с плоскостью резания. Наилучший считается такой угол наклона, при котором плоскость заточки ножа расположена параллельно верхней поверхности блока. Обычно он равен . Если нож установлен так, что угол наклона больше оптимального, то срез будет крошиться, если меньше – резка невозможна, так как лезвие ножа будет лишь скользить по поверхности блока. Под углом резания подразумевают угол между длинной осью ножа и воображаемой линией, идущей через центр блока параллельно движению салазок, несущих нож. Величина угла резания зависит от свойств обрабатываемого материала: чем он мягче, тем угол меньше, и, наоборот, чем тверже, тем угол больше. При косом расположении ножа уменьшается сопротивление его режущего края поверхности блока, что облегчает резку мягких блоков. Микротом замораживающий  Рис . 3. Микротом для резки замороженной ткани Микротом-криостат (МК-25)  Рис.4.Широкое развитие гистохимических методов исследования ферментов и других быстро разрушающихся веществ потребовало создания специального аппарата для приготовления свежезамороженных срезов — криостата. 5.2. Микротомные ножи Резку исследуемого объекта на микротоме производят с помощью специальных микротомных ножей. Существует несколько разновидностей микротомных ножей. В основу их классификации положена форма лезвия. Ножи типа А имеют одну поверхность вогнутую, а другую ровную. У ножей типа В вогнутость менее выражена. Ножи типа С имеют ровную поверхность с обеих сторон. Сужение ножа от спинки к режущему краю довольно значительное, благодаря чему торцовая часть имеет характерный вид, по которому легко определить тип ножа ( Рис..). Ножи типа А делают из относительно мягкой стали, применяют при резке мелких объектов, залитых в целлоидин и состоящих из тканей малой и средней плотности (железы, стенка внутренних органов и т. д.). Ножи типа В (имеющие меньшую вогнутость лезвия, чем тип А) изготовляют из более твердой стали и употребляют как для приготовления целлоидиновых срезов, так и при резке материала, залитого в целлоидин-парафин. Ножи т и п а С (из твердой стали) служат для резки наиболее плотного материала (кость, хрящ, кожа), залитого в различные среды, парафиновых блоков, а также для получения срезов при работе на замораживающем микротоме. Длина ножей может быть различной — от 10 до 50 см.   Рис .5 . 6. Размещение срезов на стекле Обучающимся лаборантам лучше начинать с приготовления гистологических срезов толщиной 14—16 мкм и лишь постепенно, по мере освоения техники резки, уменьшать толщину срезов. Правильно залитые небольшие кусочки органов и тканей при оптимальном температурном режиме в помещении режутся хорошо, и срез, как правило, ложится на нож в расправленном состоянии (угол резания прямой). Готовый срез осторожно снимают с ножа влажной кисточкой (в направлении от спинки к лезвию) и переносят либо на подготовленное предметное стекло. Помещают срезы на воду (предметное стекло) обязательно поверхностью, прилежащей к ножу, определить которую можно по характерному блеску (верхняя сторона всегда матовая). Очень важно не перепутать очередность серийных срезов при наклеивании на предметное стекло. Для этого ленту срезов разрезают скальпелем на отдельные фрагменты длиной около 3/4 предметного стекла и укладывают всегда в определенном порядке вдоль или поперек стекла (Рис.6)  Рис .6. Порядок расположения серийных срезов на стекле 7. Окрашивание и заключение срезов В основе окрашивания тканевых микроструктур лежат физико-химические процессы. Из физических факторов в первую очередь следует отметить явления диффузии (проникновение), адсорбции (поверхностное впитывание) и абсорбции (глубокое пропитывание) красителя, а также его растворимость, из химических — электролитические свойства красящих растворов и самих тканей. Немаловажное значение имеют плотность тканей и дисперсность красителя. 7.1. Красители Первое свойство определяет последовательность окрашивания отдельных структур, второе — скорость процесса окрашивания. Именно на электролитических свойствах основано разделение применяемых в гистологической практике красителей на три группы: основные, кислотные и нейтральные. Основной краситель представляет собой красящее основание или его соль и окрашивает клеточные и тканевые структуры кислой природы, например хроматин ядра, содержащий ДНК, и ядрышко, содержащее РНК. Отсюда и термин базофилия (любящий основание) для обозначения тканевых компонентов, окрашивающихся основными красителями (тионин, гематоксилин, метиловый зеленый и др.). Кислотный краситель — это красящая кислота или ее соль, в силу чего он окрашивает вещества и частицы основной природы, например гранулы эозинофильных лейкоцитов, цитоплазму некоторых клеток передней доли гипофиза и др. Отсюда и термин оксифилия (ацидофильный — любящий кислоту) для тканевых элементов, красящихся кислотными красителями. В эту группу веществ входят эозин, эритрозин, кислотный фуксин, конго красный и др. Нейтральный краситель образуется при соединении водных растворов кислотного и основного красителей (соединение красящей кислоты с красящим основанием). К этой группе относятся судан, эозиновокислый метиленовый синий и др. Не следует путать нейтральный краситель с нейтральной красящей смесью, для которой характерно одновременно присутствие в растворе основного и кислотного красителей. Термин же нейтрофилия применим к результатам окрашивания обеими группами красителей, так как отражает не свойство красителя, а равновесие между кислотными и основными свойствами окрашиваемых элементов. Следует помнить, что на качество окраски и ее стойкость значительное влияние могут оказывать способ фиксации, предварительная и последующая обработка препаратов. Заключение Благодаря контролю качества мы можем узнать, насколько качественно были выполнены гистологические срезы. Так как в дальнейшем при выдачи результатов врачом патологоанатомом будет зависеть дальнейшее лечение больного. Из всего этого следует, что особое место занимает контроль качества среза, так как он важен для гистологического исследования и позволяет уточнить диагноз. Список литературы 1. Приказ МЗ РФ №220 от 26.05.2003 г. об утверждении отраслевого стандарта «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований» 2. Бойчук А.В. Гистология. Атлас для практических занятий. - Изд.: ГОЭТАР-Медиа, 2008 3. Гистология: Учебник / Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, Е.Ф. Котовский и др.; Под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной. - 5-е изд., перераб. доп. - М., Медицина, 2006. - 744 с.; ил. 4. Гунин А.Г. Гистология в таблицах и схемах. - Изд.: МИА, 2005. 5. Данилов Р.К. Гистология человека. - Изд.: ЭЛБИ-СПб, 2004 6. Крстич Радивой В. Иллюстрированная энциклопедия по гистологии человека. / Р.В. Крстич - СПб.: СОТИС, 2007. - 536 с.; 1576 ил. 7. Кузнецов С.Л. Гистология, цитология и эмбриология. Учебник для студентов медицинских ВУЗов / С.Л. Кузнецов, Н.Н. Мушкамбаров. - Москва: МИА, 2007. - 600 с.; ил., табл. 8. Кузнецов С.Л. Лекции по гистологии, цитологии и эмбриологии / С.Л. Кузнецов, М.К. Пугачев. - Москва: МИА, 2004. 9. Самусев Р.П. Атлас по цитологии, гистологии и эмбриологии: Учебное пособие для студентов высший мед. заведений / Р.П. Самусев, А.В. Смирнов. / Под ред. Р.П. Самусева. - 2-е изд., испр. - Москва: ООО «Издательство Оникс»; ООО «Издательство «Мир и Образование», 2006. - 400 с.; ил. 10. Семченко В.В., Барашкова С.А., Артемьев В.Н. Гистологическая техника: учебное пособие. - Омск: Омская медицинская академия, 2004. - 115 с. 11. Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.Н., Артемьев В.Н. Гистологическая техника: учебное пособие. - 3-е изд., доп. и перераб. - Омск-Орел: Омская областная типография, 2006. - 290 с. | ||||||||||