Общая Биология. Репродуктивное клонирование исторические, методические и этические аспекты. Первые опыты на амфибиях. Принцип получения клона млекопитающих, использованный в опытах Я. Вильмута. Работы Л. М. Чайлахяна
 Скачать 229.75 Kb.
|
Вопрос 34Репродуктивное клонирование: исторические, методические и этические аспекты. Первые опыты на амфибиях. Принцип получения клона млекопитающих, использованный в опытах Я. Вильмута. Работы Л.М. Чайлахяна КЛОНИРОВАНИЕ – а) получение генетически идентичных (копий) живых организмов путем бесполого размножения; б) способность ядер соматических клеток взрослого организма обеспечивать развитие другого взрослого организма. Репродуктивное клонирование - создание "нового" организма-клона -генетической копии живущего существа. Клонирование высших животных состоит в переносе ядра соматической (неполовой) клетки в лишенную ядра яйцеклетку и культивировании эмбриона. Исторические аспекты: 1883 год - открытие яйцеклетки немецким цитологом Оскаром Гертвигом (Хертвигом, 1849-1922) В 1938 г. Ганс Шпеман предложил произвести опыт по переносу ядра какой-либо дифференцированной клетки в яйцеклетку, собственное ядро которой было предварительно удалено. У животных половые клетки обособляются рано в ходе эмбриогенеза и только в процессе полового размножения, (слияние ♂♀ гамет), Энуклеация - удаление ядер из клетки образуется зигота, несущая свойства тотипотентности и плюрипотентности, - дать начало целому организму и дифференцироваться в клетки любого вида ткани взрослого организма. КЛЕТКИ ЖИВОТНЫХ, дифференцируясь, ЛИШАЮТСЯ ТОТИПОТЕНТНОСТИ, и в этом - одно из существенных их отличий от клеток растений, ГЛАВНОЕ ПРЕПЯТСТВИЕ для клонирования взрослых позвоночных животных. В 1958 г. Стюард и др. in vitro из отдельных соматических клеток дифференцированной ткани корня моркови получили целое новое растение любая растительная клетка, не потерявшая в процессе дифференцировки ядра или цитоплазмы, может в культуре превратиться в каллусную (мало дифференцированную) тотипотентную клетку и дать начало новому организму. При вегетативном размножении и клонировании гены не распределяются по потомкам, как в случае полового размножения, а сохраняются в полном составе в течение многих поколений. Все организмы, входящие в состав определенного клона, имеют одинаковый набор генов и фенотипически не различаются между собой. Этические аспекты: Серьёзной проблемой является отсутствие доказательств эффективности и безопасности применения эмбриональных стволовых клеток. а) Проблемы связаны с получением СК: можно ли специально создавать эмбрионы с целью получения СК, которые будут использоваться для лечения и выживания взрослых людей? б) Использовании абортивного материала: не будет ли излишней коммерческой заинтересованности у всех участников данной работы? в) Недобросовестная псевдонаучная реклама использования СК проблема сохранения человека, как вида: где тот предел генетических изменений, за которым человека уже нет, а есть кто-то? Для дальнейшего развития требуется: 1.совершенствование законодательной базы; 2.создание банков СК, оборудованных по правилам GTP (Good Tissue Practic обучение специалистов и совершенствование материальной базы клиник, т.к. сохранение и применение СК - сложный технологический процесс; 3.разработка чётких показаний и противопоказаний для применения СК. Кант говорил: каждая личность - самоцель и ни в коем случае не должна рассматриваться как средство для осуществления каких бы то ни было задач, хотя бы это были задачи всеобщего блага. Всякие разговоры o клонировании Человека в настоящее время лишены оснований. Конституция РФ гл. 2, ст. 21. “Никто не может быть без добровольного согласия подвергнут медицинским, научным или иным испытаниям”. В Великобритании с марта 2002 года разрешено клонирование человеческих эмбрионов с научной целью, а репродуктивное клонирование человека карается тюремным заключением сроком на 10 лет. Однако Ян Вилмут в своё время получил лицензию на научные исследования по клонированию человеческих эмбрионов Управлением по оплодотворению и эмбриологии человека. Первые опыты на амфибиях: российский эмбриолог Георгий Викторович Лопашов разработал метод пересадки (трансплантации) ядер в яйцеклетку лягушки. Суть метода: Собственное ядро яйцеклетки механически или облучением удаляется, Чужеродное ядро-донор впрыскивается в яйцеклетку с помощью микропипетки. в 1953 г в США Бриггс и Кинг разработали микрохирургический метод "нуклеотрансфера" пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки. Вывод: 1. в пределах одного клона (от одной бластулы) ядра обладают одинаковыми потенциями – все клонированные ядра обеспечивают развитие до какой-либо определенной стадии. Впервые: 1. в качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а специализировавшиеся клетки эпителия кишечника головастика. 2. Ядра яйцеклеток реципиентов разрушал ультрафиолетовыми лучами. 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика и только 1% развился в половозрелых особей. Гердон и Ласки (1970) стали культивировать in vitro клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестве доноров ядер. 25% первично РЯ развивались до стадии бластулы при серийных пересадках - до стадии плавающего головастика. Перенос ядер в яйцеклетки млекопитающих Предпосылки: 1.Изучены ранние этапов эмбриогенеза мышей и кроликов; 2. Разработаны технологии микроманипуляций. Стандартные методы трансформации клеток: 1. Бомбардировка или баллистическая трансформация 2. Трансформация с использованием вирусов. 3. Электропорация Первое заявление о получении живой мыши после пересадки ядра - Карл Ильменси в 1977 Результаты признали недостоверными Подитоги: Открытие Гердона и его сотрудников – клонирование лягушки (50-ые – 60-ые годы). Трудности и неудачи в попытках пересадки ядер у млекопитающих(70-ые-80-ые годы). Главная причина в том, что у млекопитающих объем ядра в 1000 и более раз меньше, чем у рыб и амфибий. Обнадеживающие результаты Ильменси и Хоппе(1977, 1981) и их опровержение в работе Мак-Грасса и Солтера (1983). Главные находки на пути совершенствования метода пересадки ядер: Предложение Ильменси и Хоппе добавлять в среду культивирования цитохалазин Б или Д (1979). Предложение Мак-Грасса и Солтера метода энуклеации зиготы без прокола поверхностной мембраны (1983). Предложение использовать метод электостимулируемого слияния клеток для переноса чужеродного генома в энуклеированную16 зиготу Опыты Вильмута: 1997 год – 27 февраля статья Ян Вилмута, в которой описывался опыт с овечкой Долли. I. 1.Донорские клетки выделяли из эпителия молочной железы сукотной шестилетней овцы породы Finn Dorset (финский дорсет). 2.Клетки эпителия молочной железы выращивали в "бедной" питательной среде (содержащей в 5 раз меньше концентрации всех компонентов). 3. ядра дифференцированных клеток полностью переходили в неактивное состояние -способ репрограммирования ДНК соматических клеток - в дефицитной питательной среде. II. 4. С помощью суперовуляции получали десятки неоплодотворенных яйцеклеток овцы породы Scottish Blackface (шотл. черномордая). 5.Из яйцеклеток с помощью микроманипулятора удаляли пронуклеус. 6. Яйцеклетку без ядра II и эпителиальную "голодную" клетку I присасывали к концу микропипетки 7.Когда две клетки образовывали плотный контакт, пропускали электрический разряд. 1-й электроразряд применялся для слияния двух клеток. 2-й электрозаряд был необходим для запуска дробления клетки. Работы Л.М. Чайлахяна Разработан метод пересадки ядер у млекопитающих сочетанием микрохирургии и локального электрослияния. Наши ученые брали клетки для клонирования из ранних эмбрионов, а не от взрослого животного, как шотландцы. Эмбриональные клетки были уже репрограммированы самой природой. Как бы там ни было, но эксперименты советских исследователей в итоге впервые привели к появлению на свет клонированного млекопитающего - мышки. Ученые столкнулись с такими проблемами, как: Проблема пересадки ядер Проблема ремоделирования ядра и репрограммирования генома Проблема эффективности репродуктивного клонирования Большинство клонов гибнет на ранних стадиях развития и только немногие выживают до рождения и далее. Клонированные животные имеют различные дефекты независимо от типа донорской соматической клетки. Эти дефекты и отклонения, вероятнее всего, результат неудач в репрограммировании генома. Эффективность клонирования зависит от степени дифференцировки донорской соматической клетки. |