впв. Решение этих ограничений
 Скачать 0.56 Mb.
|
|
Формула Аббе для микроскопа и наложенные ею ограничения Cогласно формуле Аббе I = 0,61·? n 1 sin u 1 , предел разрешения микроскопа составляет около 140 нм для фиолетовых лучей и приблизительно 200 нм для желтых и 250 нм для красных.Этого явно недостаточно чтобы разглядеть средние вирусы,размером 60-80 нм или оперировать да- же с самыми крупными биологическими молекулами ДНК характерные размеры которых 10-40 нм. Конечно, ЭМ-волны не ограничиваются видимым диапазоном света и существу- ют методы исследования в более коротковолновых диапазонах, скажем в ультрафиолете, рентгеновских лучах. За последнее время широко развиты методы электронной и даже ион- ной микроскопии, где длина волны на несколько порядков меньше чем у видимого света, а, следовательно, на порядки лучше разрешение. Но все эти методы не сочетаются с живыми системами. Исследования вынужденно должны проводиться при очень низких давлениях, практически в вакууме, под мощными потоками излучения, убивающего всј живое. Мик- роскопия ближнего поля и атомно-силовая микроскопия тоже дают разрешения, перекры- вающие нанодиапазон, но скорость формирования их изображения настолько низкая, что динамика и кинетика молекулярных процессов, происходящих в живых клетках оставалась за гранью видимого. Решение этих ограничений Для начала, решим проблемы с контрастностью изображения. Флуоресцентный микроскоп оснащается источником света со определенным спектром, ди- хроическими зеркалами, которые отражают свет меньшей или равной длины волны нежели необходима для возбуждения флуорохрома и пропускают свет с большей длиной волны, и двух узкополосных фильтров, один из которых формирует возбуждающий поток волн нуж- ной энергии, а другой отсекает все длины волн, кроме испускаемых флуорохромом в том числе, что важно и сам возбужающий свет, который частично отражается объектом и сильно уменьшил бы контраст. Следующим шагом, преведшим уже к появлению сверхразрешения явилось биоконстру- ирование переключемых белков. Облучение одной длиной волны заставляет этот белок све- титься как флуоресцентный, а облучение другой длиной волны выключает флуоресценцию или переключает его на испускание волн уже другого цвета. Именно за открытие таких белков был отмечен Нобелевским комитетом американский физик Эрик Бетциг. А его соотечественник физик Уильям Мјрнер придумал, как использовать такие экзоти- ческие метки для создания стохастического сверхразрешающего микроскопа. Математиче- ски обработав пятно Эйри отдельной точки(точнее функцию рассеяния точки: форма диска Эйри универсальна для любого оптического прибора имеющего объектив и диафрагму круг- лой формы (диафрагмой часто служит оправка фронтальной линзы объектива), значит PSF уникальна для каждого индивидуального оптического прибора) можно с большой точностью определить еј место положения, другое дело что если две или несколько молекул находятся на расстоянии меньше предела разрешения микроскопа, то определить их местоположения 1 по слившейся в одно световое пятно изображению уже нереально. Но если заставить светить- ся молекулы по очереди, то определить местоположения каждой можно опять же с большой точностью, а сложив информацию о положении каждой точки получить сверхразрешјнную картинку. Однако любой препарат имеет ещј и толщину.Толщина гистологического среза и диаметр большинства бактерий и клеток порядка 10 мкм, а глубина резкости высокоразрешающего объектива около 1 мкм. И свет исходящий от объектов, находящихся вне фокусной плоскости объектива так же попадјт в объектив, но на изображении окажется в виде размытых пятен, которые помешают наблюдать за объектами в фокусной плоскости. Чтобы этого избежать изобретатель конфокального микроскопа американский учјный Марвин Минский поместил в схему флуоресцентного микроскопа в точку противоположную фокусу объектива диафраг- му с отверстием очень маленького диаметра. Свет вышедший из точек, лежащих выше или ниже фокусной плоскости проецируются на такой диафрагме в виде большого светового пятна и практически задерживается диафрагмой не внося существенной погрешности в из- мерение яркости света из фокальной плоскости. Таким образом, мы получаем информацию только из одной фокальной плоскости,но только из одной точки этой плоскости. Если cоздать такой световой тор из гасящего излучения вокруг возбуждјнной основным лазером области, то можно погасить флуоресценцию по краям области, оставив еј только в центре тора. А на размер "дырки от бублика"действует не формула Аббе, а усовершенство- ванная формула, выведенная профессором Штефаном Хелем: D = ? 2? sin ? 1+ I u Istim 2 PhaseMod - круглая фазовая пластинка с плавным изменением фазовой задержки 2? по ходу часовой стрелки, причем разность фаз на диаметрально противоположных сторонах пластинки должна составлять ?. 3 |