Занятие 4_СР_Сальмонеллезы. Сальмонеллы возбудители сальмонеллезов. Лабораторная диагностика сальмонеллёзов
 Скачать 57.11 Kb.
|
|
ФГБОУ ВО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ Кафедра микробиологии и вирусологии Утверждаю: Зав. кафедрой микробиологии и вирусологии Проф.______ Э. С. Горовиц Методическая разработка для дистанционного обучения студентов Раздел: Частная микробиология. Занятие №4 ТЕМА: Сальмонеллы – возбудители сальмонеллезов. Лабораторная диагностика сальмонеллёзов. Курс –III, V семестр Факультеты: лечебный, педиатрический, медико-профилактический Продолжительность занятия: 3 часа Пермь, 2020 Сальмонеллы – возбудители сальмонеллезов. Лабораторная диагностика сальмонеллёзов Сальмонеллез (зоонозная инфекция) - острая кишечная инфекция, вызываемая сальмонеллами, попадающими в организм человека, чаще всего, с продуктами животного происхождения. Сальмонеллез характеризуется поражением тонкого кишечника и протекает в форме энтерита или (существенно реже) в генерализованной форме. Контрольные вопросы: Какой путь и механизм передачи сальмонеллеза реализуются чаще всего? Чаще всего реализуется фекально-оральный механизм передачи, а путь передачи – алиментарный. Сальмонеллез ‒ это моно- или полиэтиологичная инфекция? Сальмонеллез ‒ это полиэтиологичная инфекция, так как возбудителями сальмонеллеза является большая группа сальмонелл. Наиболее часто возбудителями сальмонеллезов у человека являются серовары S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Dublin и другие, входящие в серогруппы В, С, D и Е. Таксономия возбудителей сальмонеллеза. Сальмонеллы относятся к отделу Gracilicutes, порядку Enterobacteriales, семейству Enterobacteriaceae, роду Salmonella. Согласно современной классификации, основанной на строении ДНК, род Salmonella состоит из двух видов - вида S. enterica и вида S. bongori. В состав вида S. enterica включены все сальмонеллы, являющиеся возбудителями заболеваний человека и теплокровных животных. Этот вид объединяет 6 подвидов: - подвид I - S. enterica (S. enterica subsp. enterica); - подвид II - S. salamae (S. enterica subsp. salamae); - подвид IIIа - S. arizonae (S. enterica subsp. arizonae); - подвид IIIb - S. diarizonae (S. enterica subsp. diarizonae); - подвид IV - S. houtenae (S. enterica subsp. houtenae); - подвид VI - S. indica (S. enterica subsp. indica). Каждый из этих подвидов включает множество серотипов, а каждый серотип объединяет десятки, а то и тысячи штаммов. Морфологические, тинкториальные и культуральные особенности возбудителей. М. и т.: Сальмонеллы представляют собой короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами размером 0,7-1,5x2-5 мкм. Сальмонеллы подвижны за счет перитрихиально расположенных жгутиков. На поверхности сальмонелл располагаются пили (ворсинки, фимбрии). Сальмонеллы имеют несколько различных классов фимбрий, в том числе длинные полярные или полюсные фимбрии Lpf, тонкие фимбрии Pef и фимбрии Fim. Сальмонеллы не образуют спор. Некоторые виды сальмонелл (в частности, S. typhi и S. paratyphi C) имеют микрокапсулу. К.: Сальмонеллы являются факультативными анаэробами. Он хорошо растут в аэробных условиях на простых питательных средах при температуре от 4 гр. С до 45 гр. С и рН 4,1-9,0. Оптимальная температура для роста сальмонелл равна 37 гр. С. На МПА сальмонеллы образуют серо-белые слегка выпуклые колонии R- и S-формы с голубоватым оттенком диаметром 2-4 мм. Вокруг колоний S. schottmülleri на МПА образуется слизистый приподнятый вал, проявляющийся на 2-5 сутки хранения культуры при комнатной температуре На среде Эндо сальмонеллы формируют серо-белые (бесцветные) или розоватые лактозоотрицательные колонии. На среде Плоскирева сальмонеллы также образуют серо-белые (бесцветные) мутноватые лактозонегативные колонии. На среде Левина вырастают слегка голубоватые или серо-белые колонии. На ВСА сальмонеллы образуют черные колонии с ртутным блеском, окруженные черным ободком прокрашенной среды (возбудитель брюшного тифа) или колонии темно-зеленого цвета (паратифозные бактерии). В жидких средах сальмонеллы вызывают диффузное помутнение. Какие методы используют при диагностике сальмонеллеза, какому отдают предпочтение? Почему? Диагностика сальмонеллезов проводится бактериологическим и серологическим методами. Предпочтение отдают бактериологическому методу, так как с помощью него можно выделить чистую культуру возбудителя, идентифицировать его не только по культуральным и биохимическим, но и антигенным свойствам (определение серогруппы, серовара), что является важнейшим из критериев, определяющих ход лечения больного. Серологический метод недостаточно достоверен. Какой материал исследуют при локальной и генерализованной формах инфекции? В чем особенности изучения того и другого материала при бактериологической диагностике? (используйте общую схему диагностики ОКИ) При локальной форме исследуют рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, желчь, мочу, остатки подозрительной пищи, продукты, из которых ее готовили, воду, смывы с поверхности кухонного оборудования и рук персонала. При генерализованной форме исследуют кровь; гной – при септикопиемии. Особенности изучения: https://docs.cntd.ru/document/1200083950 8.3.2. Испражнения, доставленные в фосфатно-буферном растворе, высевают в среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1. Фекалии, доставленные в глицериновом консерванте или транспортной среде, помещают в обычную среду обогащения в соотношении 1:10. Испражнения, доставленные без консерванта, суспендируют в среде обогащения в соотношении 1:5. Из указанных суспензий делают высев на дифференциально-диагностические среды, оставшуюся часть инкубируют в термостате. 8.3.3. Кровь, взятую из вены, высевают в двойную среду. В случае крайней необходимости в 10-20%-ный желчный бульон. После 16-20 ч инкубирования делают высев на одну из дифференциально-диагностических сред. При отрицательном результате делают повторные посевы на 3-и, 5-е, 8-е сутки. 8.3.4. Рвотные массы, промывные воды желудка и мочу после центрифугирования высевают в среды обогащения. В случае исследования материала без центрифугирования посев проводят в среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1 и после 18-24 ч инкубирования делают высев на дифференциально-диагностические среды. 8.3.5. Каждую фракцию желчи (дуоденального содержимого) высевают во флаконы со слабощелочным питательным бульоном в соотношении 1:10 и на дифференциально-диагностические среды. Через 18-24 ч из флаконов осуществляют повторный высев на дифференциально-диагностические среды. В случае получения отрицательных результатов высев повторяют на 3-и, 5, 7-е сутки, используя среды слабой селективности. 8.3.6. Спинномозговую жидкость высевают на шоколадный агар. 8.3.7. Операционный и секционный материал высевают в одну из сред обогащения в отношении 1:10. Допускается одновременный высев суспензии материала в среду обогащения и на дифференциально-диагностические среды. 8.3.8. При наличии другого клинического материала его высевают на две-три дифференциально-диагностические среды (комбинируя высоко- и низко селективные среды и в емкости со средой обогащения одновременно). При посеве на плотные среды исследуемый материал наносят с помощью бактериологической петли (материал от больных), пипетки, стеклянной палочки или тампона (пробы продуктов и смывы) с последующим втиранием материала шпателем по всей поверхности среды. На высоко селективные среды посевной материал вносят в большом объеме (в 3-5 раз), чем на слабо селективные. Пластинчатые среды подсушивают, на их поверхности не должна оставаться конденсационная жидкость, что обеспечивает рост изолированных колоний. 8.3.9. После инкубирования посевов на средах обогащения делается повторный высев на дифференциально-диагностические среды с последующим отбором подозрительных колоний (приложение 2.5). Необходимо учитывать, что при исследовании различных материалов на инфицированность сальмонеллами отличаются только начальные этапы анализа (правила взятия материала, его обработка, выбор адекватных питательных сред). Начиная с отбора колоний на дифференциально-диагностических средах, последующие этапы бактериологического исследования идентичны. 9.2.1.При исследовании пищевых продуктов делают навеску. Величина навески определяется видом продукта, масса которого должна соответствовать величине норматива на отсутствие в нем бактерий рода сальмонелла. Чаще всего масса навески составляет 25 г. 9.2.2. Продукты плотной консистенции гомогенизируют или растирают в ступках. 9.2.3. Пищевые продукты, бактериологическое исследование которых проводят в соответствии с требованиями МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов" и ГОСТ 30705-2000 "Продукты молочные для детского питания. Методы микробиологического анализа", берут для исследования в количестве, предусмотренном в указанных документах. 9.2.4. Крем, сливочное масло, мороженое и т.п. перед посевом расплавляют в водяной бане. 9.2.5. Жидкие продукты, имеющие кислую реакцию (рН меньше 4,5), перед посевом нейтрализуют 10%-ным стерильным раствором бикарбоната натрия до слабощелочной реакции (рН 7,0-7,4). 9.2.6. При исследовании яиц скорлупу обрабатывают спиртом и обжигают, после чего яйца разбивают и отделяют желток и белок в стерильную посуду, объединяя отдельно по пять желтков и белков в одной пробе. Желтки и белки гомогенизируют и используют для посева. 9.3.1. Подготовленные пробы продуктов питания высевают в неселективную среду обогащения в соотношении 1:10. Одновременно делают посев материала из указанной среды до ее инкубирования на дифференциально-диагностические среды. Предпочтительно использовать одну чашку с низко селективной средой и одну с высоко селективной. Инкубируют посевы при 37 °С в течение 18-24 часов (чашки с висмут-сульфит агаром - 48 часов). После инкубирования посевов на неселективной среде обогащения проводится посев материала в две среды селективного обогащения. При этом должно соблюдаться следующее соотношение посевной дозы и объема среды обогащения. Для всех указанных сред обогащения оно составляет 1 мл надосадочной жидкости на 10 мл среды и инкубировании 18-20 час при 37 °С. Для среды Мюллер-Кауфмана 1 мл надосадочной жидкости на 10 мл среды инкубирование 18-20 час при 41,5-42 °С (приложения 3, 4). При использовании среды Раппапорт-Василиадис вносить 0,1 мл из неселективной среды обогащения (забуференной пептонной воды) в 10 мл указанной среды и инкубировать при 42 °С в течение 18-24 час. Материал, прошедший инкубацию на средах селективного обогащения, высевается на чашки Петри с двумя-тремя дифференциально-диагностическими средами 10.3.1. При исследовании смывов после высева на среду Кесслера смывную жидкость заливают 5 мл одной из рекомендуемых для выделения сальмонелл сред обогащения (магниевая, селенитовая или среда Раппапорт-Вассилиадис) и помещают в термостат при 37 °С на 18-20 ч. После инкубации делают высев на среду Эндо и висмут-сульфит агар с последующим отбором подозрительных колоний и их идентификацией. 10.3.2. При исследовании воды питьевой, поверхностных водных объектов и сточных вод берутся 2 пробы по 500 мл каждая и вносятся в равный объем селективной среды обогащения двойной концентрации. При использовании мембранной фильтрации для исследования полученные фильтры помещают в 50 мл в каждой из двух сред накопления, например магниевую и селенитовую, или среду Раппапорт-Василиадис и селенитовую. Посевы инкубируют при 37 °С 18-20 ч. Затем делают высев на дифференциально-диагностические среды. Дальнейший анализ ведут так же, как и при выделении сальмонелл из других объектов исследования. 10.3.3. При исследовании воздуха Чаши с агаром эндо помещают в термостат при 37 °С на 18-20 ч, а чашки с висмут-сульфит агаром инкубируют при той же температуре 48 час. Колонии подозрительные на сальмонеллы идентифицируют по той же схеме, что и изолированные из других объектов. Насколько высока биохимическая активность сальмонелл? Какие продукты образуются при ферментации углеводов и белков возбудителями? С помощью каких сред можно проследить образование Н2S? Сальмонеллы ферментируют глюкозу до кислоты и газа (S. typhi при разложении углеводов не образует газа), не разлагают лактозу и сахарозу, продуцируют сероводород при ферментации белков, не разжижают желатин, не образуют индол. Ферментацию углеводов и образование сероводорода можно выявить на среде Клиглера (двухсахарном агаре, содержащем глюкозу и лактозу) или среде Олькеницкого (трехсахарном агаре, содержащем глюкозу, лактозу и сахарозу). Готовая среда Клиглера имеет оранжево-красный цвет. Разложение глюкозы и образование сероводорода сопровождается почернением столбика агара с сохранением красного цвета “язычка” среды; готовая среда Олькеницкого также имеет красный цвет. Ферментация глюкозы проявляется изменением цвета столбика среды на желтый с сохранением красного цвета “язычка” среды. Наличие черного преципитата на границе столбика и скошенной части указывает на то, что сальмонеллы продуцируют сероводород Что служит основой деления сальмонелл на группы и внутригруппового типирования? Какие реакции используют для изучения антигенной структуры этих бактерий? Основой деления сальмонелл на группы и внутригруппового типирования являются антигенные свойства сальмонелл. По строению О-антигена все сальмонеллы распределяются на серологические группы, которые обозначаются прописными буквами латинского алфавита (A, B, C, D и т. д.). По строению Н-антигена сальмонеллы распределены на 2 фазы: 1 – специфическая, 2 – неспецифическая. Н-антигены первой фазы характерны для определенного вида сальмонелл, а антигены второй фазы встречаются у представителей разных видов. Это связано с тем, что синтез Н-антигена кодируется двумя независимыми генами. Функционирование одного гена исключает работу другого. Поэтому в каждой клетке может быть синтезирован только одна фаза Н-антигена. Первая фаза обоз- начается строчными латинскими буквами, вторая фаза - цифрами. Для сероидентификации используют РА на стекле, РИФ. Какие экспресс-методы лабораторной диагностики применяют при сальмонеллезах? РИФ, ПЦР, РЛА, ИФА. В каких случаях целесообразно использование серологических методов исследования и каким реакциям отдается предпочтение? При тяжёлых формах заболевания. РНГА (которая считается положительной в титрах 1:160 и выше при однократном исследовании или при нарастании титров антител в 4 раза и более в динамике заболевания), ИФА. Одним из основополагающих признаков при идентификации сальмонелл считается их антигенная структура. Для их сероидентификации используют реакцию агглютинации на стекле. Опишите последовательность действий бактериолога при расшифровке антигенной структуры и какие препараты (диагностические сыворотки) используют на каждом этапе исследования с учетом антигенных характеристик, представленных в схеме Ф. Кауфмана и П. Уайта: Ответ. На предметное стекло наносится одна капля сыворотки и одна капля изотонического раствора хлорида натрия. С питательного агара берется полная петля культуры, выращенной в течение 18-24 часов при 37°С. Культура наносится на предметное стекло вблизи капли изотонического раствора хлорида натрия и эмульгируется (контроль на отсутствие спонтанной агглютинации). При отсутствии спонтанной агглютинации манипуляцию повторяют в капле сыворотки, формируя равномерную непрозрачную суспензию. Учет результатов проводят в течение 1-2 минут, мягко покачивая стекло. Гомогенная суспензия свидетельствует об отрицательном результате. Образование хлопьев агглютината внутри капли расценивается как положительный результат. Агглютинация проявляется через несколько секунд (или 1 минуты) в виде хлопьев (зерен) агглютината формирующихся внутри капли на фоне ее просветления. Штаммы, находящиеся в R-форме, обладают самопроизвольной агглютинацией. Их дальнейшее серотипирование не представляется возможным без дополнительных манипуляций. Такие штаммы пересевают на слабощелочной агар для того, чтобы выбрать колонию с ровными краями и вернуть штамм в S (гладкую) форму и повторить агглютинацию. Если агглютинация с поливалентными антисыворотками не происходит, маловероятно, что штамм относится к роду Salmonella. Препараты: 1. С адсорбированной поливалентной сывороткой (групповая) 2. С адсорбирвоанной О-сывороткой (для серогруппы) 3. С адсорбирвоанной Н-сывороткой (для серовара)  В диагностике сальмонеллезов, особенно при тяжелых формах заболевания, используют серологический метод. Для определения титра антител в сыворотке крови больных проводят РНГА и ИФА. Что из себя представляют поливалентные эритроцитарные диагностикумы для РНГА в этих случаях, антигены представителей каких серогрупп они содержат? Попытайтесь схематично изобразить такие диагностикумы, отметив на рисунке их составные части.    Рисунок 1. Схематичное изображение эритроцитарного диагностикума Ответ. Поливалентные эритроцитарные диагностикумы для РНГА представляют собой эритроциты с адморбированными на них антигенами серогрупп A, b, c, d, e. Ситуационные задачи Задача №1. В инфекционное отделение больницы поступил пациент с признаками острой кишечной инфекции (ОКИ) - температура 37,90 С, боли в эпигастральной области, была рвота 2 раза, тошнота, диарея, испражнения имеют зеленоватый оттенок. Больной припомнил, что несколько дней назад употреблял в пищу плохо прожаренную куриную печень. Предположительным диагнозом был обозначен «сальмонеллез». Вопросы: а) Какой материал необходимо забрать для исследования? б) Какой основной метод исследования можно применить для подтверждения предположительного диагноза «сальмонеллез»? в) Какие методы исследования можно применить дополнительно и в какие сроки от начала заболевания? Ответ. а) испражнения, рвотные массы, остатки пищи; б) бактериологический; в) серодиагностика с 8-10 дня заболевания. Задача №2. От больного с признаками ОКИ из рвотных масс изолирована бактериальная культура, которая дала следующий рост на среде Клиглера: «- /КГ, H2S+» (лактоза не ферментируется, глюкоза до кислоты и газа, при разложении белка выделяется сероводород). Какие свойства данных бактерий следует изучить, чтобы провести окончательную идентификацию микроорганизмов? Ответ. Следует изучить, ферментируется ли сахароза, образуется ли индол, поставить реакцию Фогеса-Проскауэра, а также изучить антигенные свойства. Задача №3. В инфекционную больницу на скорой помощи был доставлен пациент Н., 29 лет с признаками выраженной интоксикации, температурой 39,30, жалобами на боли в правом подреберье. Из анамнеза следовало, что в течение 2 дней у него был понос, несколько раз была рвота, лечился он в домашних условиях народными средствами. Врач предположил у больного сальмонеллез (генерализованную форму). Вопросы: а) Чем отличаются в дебюте заболевания тифо-паратифозной группы и сальмонеллез? б) С чем, с точки зрения микробиолога, можно связать ухудшение состояния больного и появление новых симптомов заболевания? в) Какой (какие) материал следует взять у больного для бактериологического исследования? г) Имеет ли смысл дополнительно провести серологическую диагностику? Какой материал при этом следует исследовать и с помощью каких диагностических тестов? д) Какой метод экспресс-диагностики можно применить в подобных обстоятельствах? Ответ. а) Сальмонеллёз – это зоонозная острая кишечная инфекция, возникающая при попадании в организм человека продуктов животного происхождения, заражённых сальмонеллами (острое начало, связь с приёмом пищи). Тифо-паратифизные заболевания – это атропонозные кишечные инфекции, источником возбуителя является больной человек или бактерионоситель. б) Ухудшение состояния больного и появление новых симптомов заболевания можно связать с генерализацией процесса за счёт того, что развивающаяся диарея и рвота привели к обезвоживанию организма, диареегенный энтеротоксин поступил в просвет кишечника, благодаря чему нарушилась барьерная функция кишечника и развилась бактериемия, в результате которой бактерии разнеслись в различные органы и ткани. в) Кровь, а также испражнения, рвотные массы. г) Можно провести серодиагностику, так как течение заболевания тяжёлое, нужно взять сыворотку крови у больного и поставить РНГА, ИФА. Тестовые задания Выберите один или несколько правильных ответов 1. Возбудителями сальмонеллезов являются: а. S. sonnei б. S. Enteritidis в. S. flexneri г. S. Choleraesuis д. S. Typhimurium 2. Наиболее часто в настоящее время выделяются от больных сальмонеллы серовара: а. S. Enteritidis б. S. Infantis в. S. Anatum г. S. London 3. Классификация сальмонелл по Кауфману-Уайту основана на: а. чувствительности к бактериофагам б. биохимических свойствах в. морфологических признаках г. антигенной структуре д. чувствительности к антибиотикам 4. Сальмонеллы образуют колонии чёрного цвета на: а. среде Плоскирева б. среде Эндо в. висмут-сульфитном агаре г. среде Левина д. желточно-солевом агаре 5. Во время инкубационного периода сальмонеллы размножаются в: а. эпителии ротовой полости б. гепатоцитах в. просвете тонкого кишечника г. просвете толстого кишечника д. макрофагах пейеровых бляшек и солитарных фолликулов 6. Серологическую диагностику сальмонеллеза можно проводить: а. с 1-го дня заболевания б. с 3-го дня заболевания в. с конца 1-й недели заболевания г. с конца 2-й недели заболевания д. с конца 3-й недели заболевания 7.Возбудители сальмонеллезов накапливаются в: а. желудке б. толстом кишечнике в. желчном пузыре г. пищевом продукте д. инфицированной воде 8. Профилактика сальмонеллезов проводится с помощью: а. живой вакцины б. анатоксина в. поливалентного бактериофага г. иммуноглобулина д. вакцины с Vi-антигеном 9. Сальмонеллез чаще всего протекает в виде: а. септицемии б. гастроэнтерита в. менингита г. нефрита д. перитонита 10. Для идентификации серовариантов сальмонелл используют: а. реакцию преципитации б. ферментацию лактозы в. ферментацию маннита г. реакцию агглютинации с анти-сыворотками к О- и Н-антигенам д. рост на среде Клиглера |