Микробиологический синтез. Семинарским занятиям по курсу биотехнологии микробиологический синтез
 Скачать 0.58 Mb.
|
|
Д.А. ВАСИЛЬЕВ С.Н. ЗОЛОТУХИН Н.И. МОЛОФЕЕВА Е.А. КОРНЕЕВ В.В. БАТРАКОВ УЧЕБНО- МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ БИОТЕХНОЛОГИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ УЧЕБНО - МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ БИОТЕХНОЛОГИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ Составители: Д.А.ВАСИЛЬЕВ, С.Н.ЗОЛОТУХИН, Н.И.МОЛОФЕЕВА, Е.А. КОРНЕЕВ В.В. БАТРАКОВ  УЛЬЯНОВСК 2006 УДК 619: 616 Д.А.ВАСИЛЬЕВ,С.Н.ЗОЛОТУХИН, Н.И.МОЛОФЕЕВА, Е.А. КОРНЕЕВ, В.В. БАТРАКОВ УЧЕБНО - МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ БИОТЕХНОЛОГИИ Данное учебное пособие подготовлено: Д.А. Васильевым С.Н. Золотухиным, Н.И. Молофеевой, Е.А. Корнеевым (Ульяновская государственная с-х академия), В.В. Батраковым (Ульяновский государственный педагогический университет). Цель издания - восполнить существующий пробел в учебном процессе при изучении материала по лабораторному практикуму курса биотехнология. Некоторые разделы изложены более детально, а по некоторым дан описательный материал, что обусловлено лабораторными возможностями кафедры. Рекомендовано к изданию кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии ветеринарно-санитарной экспертизы.. Рецензент - ст преподаватель, кбн, Афонин Э.А. Занятие 3. СПОСОБЫ И ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. Цель занятия: изучить суть промышленного культивирования микроорганизмов. Краткие теоретические сведения. Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы: - культура микроорганизмов; - питательная среда; - аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций; - средства контроля и управления. Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов. Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость. В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, такой способ культивирования называют поверхностным, При твердофазном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ (чаще всего основу такой среды составляют пшеничные отруби). При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания. Последний способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве большинства препаратов по следующим причинам. 1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд. см3, а с применением принудительной аэрации урожайность, в зависимости от состава питательной среды, достигает 50 - 60 млрд. см3. Это объясняется тем, что при аэрации практически отсутствует начальная стационарная фаза, и бактерии сразу начинают интенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу. 2. Процесс легко управляем. При глубинном выращивании имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азотистых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культуральной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не прекращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов. Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов усиливает интенсивность размножения, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов в момент съема их биомассы. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования, что очень важно для достижения максимальной интенсивности размножения. 3. Максимальная технологичность. Так, поверхностный метод менее технологичен и в промышленных условиях применяется в исключительных случаях, когда нельзя воспользоваться глубинным методом. Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в биореакторах (ферменторах) так же как и при использовании плотных питательных сред, складывается из следующих этапов: 1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними. 2. Приготовление посевной микробной культуры. 3. Приготовление и стерилизация питательных сред. 4. Подготовка биореактора к посеву. 5. Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над процессом культивирования. Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций: - стерилизацию оборудования и коммуникаций;
Остановимся на каждом из этапов культивирования. 1.1. ОТБОР ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ. Эталонные, или референтные, штаммы хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНКИ ветеринарных препаратов. Эти штаммы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины. При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины - из аттенуированных (ослабленных), авирулентных штаммов. Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфологическими, специфическими и биологическими свойствами. Основными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства. Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроки после введения им микроорганизмов. Иммуногенные свойства штаммов определяются по устойчивости привитых животных к заражению возбудителем болезни определенной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражают 50%-ной дозой иммуногенности или по нарастанию титра антител в сыворотке крови. При этом 80% привитых животных должны быть невосприимчивы к инфекции, против которой их вакцинировали. Безвредность (реактогенность) эталонного, производственного штамма проверяют по выраженности реакции у лабораторных и естественно-восприимчивых животных на 5-10-кратное увеличение прививочной дозы. Производственные, эталонные штаммы, должны сохранять генетическую стабильных антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пересевов как in vivo, так и in vitro. 1.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОЙ МИКРОБНОЙ КУЛЬТУРЫ. Обычно производственное культивирование микроорганизмов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости, например во флаконы емкостью 100-200 см3, заполненные по 50-150 мл производственной средой. Затем из флаконов делают высевы в большие емкости - бутыли объемом 18-20 литров. При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вносят в реактор и называют посевной (матрацной, матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроорганизмов, исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 101% по объему. Посевные микробные культуры также контролируются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ). 1.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ, СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД. Одним из этапов получения биопрепаратов является культивирование микроорганизмов, которое невозможно без достаточного количества разнообразных стандартных, эффективных и недорогих питательных сред (ПС). В этой связи представляется целесообразным рассмотреть основные принципы, лежащие в основе конструирования ПС, к которым относятся: - удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов; - выбор сырьевых источников для конструирования ПС; - дифференциация ПС по целевому назначению; - оптимизация ПС; - стандартизация ПС. Удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов. Основополагающим принципом конструирования ПС является полноценность, т.е. состав среды должен удовлетворять питательным потребностям культивируемых микроорганизмов. В процессе роста микроорганизмы потребляют из окружающей их питательной среды целый ряд разнообразных химических веществ, составляющих основу энергетического и конструктивного обмена в клетках. Поступление питательных веществ в цитоплазму может осуществляться через всю поверхность клетки, и связано с их диффузией, а также с действием специальных транспортных систем. Причем необходимые для роста и жизнедеятельности клетки элементы должны находиться в определенной, легкоусваиваемой форме. К основным компонентам, формирующим клеточное вещество, относятся: углерод, азот, кислород и водород. Содержание этих элементов в различных микроорганизмах практически постоянно. Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны, следовательно, и очень индивидуальны их потребности в источниках питания. Отсюда ясно, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов и клеток не существует. Разнообразие микроорганизмов проявляется, прежде всего, в отношении к источникам углерода и азота. Эти элементы представлены в средах различными веществами, и именно они определяют специфичность сред. В зависимости от формы, в которой микроорганизмы используют необходимые им питательные вещества, их подразделяют на две большие группы: 1. Автотрофы — микроорганизмы, которые могут синтезировать вещества своей протоплазмы из простых неорганических соединений. Например, они ассимилируют углерод из углекислоты воздуха, азот из аммиака. 2. Гетеротрофы - микроорганизмы, для которых источником углерода и азота служат органические вещества. Они усваивают органические углеродсодержащие соединения: углеводы, органические кислоты, спирты и углеводороды. Наиболее доступные из источников углеродного питания - углеводы, такие как глюкоза, сахароза или мальтоза. В зависимости от типов используемых азотистых соединений микроорганизмы разделяют на две группы:
Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во многих природных аминокислотах, которые являются универсальными компонентами питания. Они целиком включаются в структуру клетки. Из всех незаменимых аминокислот ключевая роль принадлежит глутамину, а также аргинину, который имеет принципиальное значение для обезвреживания токсичных метаболитов незаменимых аминокислот и аммиака. Неорганические соли, входящие в состав ПС, удовлетворяют потребности микроорганизмов в ионах К, Mg24, Мп2Fe2 или Fe34, Р043, S042". Они же определяют необходимое осмотическое давление среды, величину рН и буферную емкость. В ПС необходимо также наличие некоторых других ионов, в частности, Zn Cu Ca и др. Обычно они присутствуют в достаточном количестве в виде примесей в питательных основах, минеральных компонентах среды или содержатся в водопроводной воде, используемой для приготовления ПС. Функция необходимых микроорганизмам и клеткам ионов металлов заключается в том, что они служат активаторами и кофакторами многих ферментов, кроме того, участвуют в регуляции синтеза белка, являются компонентами белковых комплексов. Считается также, что в ПС должны присутствовать факторы роста, различные по химической природе соединения, главным образом, органические вещества (витамины, аминокислоты, жирные кислоты, пуриновые и пиримидиновые основания), добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микроорганизмов. К факторам роста относят витамины группы В, гемин (фактор X), путресцин, олеиновую кислоту, козимазу (фактор Y) и ее ферменты, пуриновые основания (аденин, гуанин, ксантин, гипоксантин) и пиримидиновые (цитозин, тиамин, урацил), гормоны и др. Функции факторов роста разнообразны. Они участвуют в процессах обмена веществ. Отсутствие или недостаток их в среде приводит к бактериостатическому эффекту. Выбор сырьевых источников для конструирования ПС. Качество ПС во многом определяется полноценностью состава питательных субстратов и исходного сырья, используемого для их приготовления. Большое разнообразие видов сырьевых источников ставит сложную задачу выбора наиболее перспективных, пригодных для конструирования ПС требуемого качества. Определяющую роль в данном вопросе играют, прежде всего, биохимические показатели состава сырья, от которых зависит выбор способа и режимов его переработки с целью наиболее полного и эффективного использования содержащихся в нем питательных веществ. Для получения ПС с особо ценными свойствами применяют, прежде всего, традиционные источники белка животного происхождения, а именно мясо крупного рогатого скота (КРС), казеин, рыбу и продукты ее переработки. Наиболее полно разработаны и широко применяются ПС на основе мяса КРС. Учитывая дефицит кильки каспийской, широко применяемой в недалеком прошлом, для получения рыбных питательных основ стала использоваться более дешевая и доступная непищевая продукция рыбной промышленности - сухой криль, отходы переработки мяса криля, филетированный минтай и его перезрелую икру. Наибольшее же распространение получила рыбная кормовая мука (РКМ), удовлетворяющая требованиям биологической ценности, доступности и относительной стандартности. Довольно широкое распространение получили ПС на основе казеина, который содержит все компоненты, имеющиеся в молоке: жир, лактозу, витамины, ферменты и соли. Однако необходимо отметить, что в связи с удорожанием продуктов переработки молока, а также повышением спроса на казеин на мировом рынке, применение его носит несколько ограниченный характер. Из непищевых источников белка животного происхождения в качестве сырья для конструирования полноценных ПС необходимо выделить кровь убойных животных, которая богата биологически активными веществами и микроэлементами и, кроме того, содержит продукты клеточного и тканевого обмена. Гидролизаты крови сельскохозяйственных животных используются в качестве заменителей пептона в дифференциально-диагностических питательных средах. К другим видам белоксодержащего сырья животного происхождения, которые могут быть использованы для конструирования ПС, относятся: плацента и селезенка КРС, сухой белковый концентрат - продукт переработки мясных отходов, спилковая обрезь, получаемая при обработке кожи, эмбрионы домашних птиц - отход вакцинного производства, кровезаменители с истекшим сроком годности, творожная сыворотка, мягкие ткани моллюсков и ластоногих. Перспективно использование тушек пушных зверей из зверохозяйств, крови КРС, получаемой на мясокомбинате, обезжиренного молока и молочной сыворотки (отходы маслозаводов). В целом же ПС, приготовленные из сырья животного происхождения, имеют высокое содержание основных питательных компонентов, являются полноценными и сбалансированными по аминокислотному составу и достаточно хорошо изучены. Из продуктов растительного происхождения в качестве белкового субстрата для ПС возможно использование кукурузы, сои, гороха, картофеля, люпина и др. Однако, растительное сельскохозяйственное сырье содержит белок, несбалансированный состав которого зависит от условий выращивания культур, а также липиды в больших количествах, чем продукты животного происхождения. Обширную группу составляют ПС, изготавливаемые из белкового сырья микробного происхождения (дрожжи, бактерии и т.д.). Аминокислотный состав микроорганизмов, служащих субстратом для приготовления ПС, хорошо изучен, а биомасса используемых микроорганизмов является полноценной по составу питательных веществ и характеризуется повышенным содержанием лизина и треонина. Разработан целый ряд ПС комбинированного состава из белковых субстратов различного происхождения. К ним относятся дрожжевая казеиновая питательная среда, дрожжевая мясная и т.д. Основой большинства известных ПС являются гидролизаты казеина, мяса КРС и рыбы (до 80%). Удельный же вес непищевого сырья в технологии конструирования ПС составляет всего 15% и в дальнейшем требует увеличения. Используемое для получения питательной основы (ПС) непищевое сырье должно удовлетворять определенным требованиям, а именно быть: - полноценным (количественный и качественный состав сырья должен, в основном, удовлетворять питательным потребностям микроорганизмов и клеток, для которых разрабатываются ПС); - доступным (иметь достаточно обширную сырьевую базу); - технологичным (затраты на внедрение в производство должны осуществляться с использованием имеющегося оборудования или существующей технологии); - экономичным (затраты на внедрение технологии при переходе на новое сырье и его переработку не должны превосходить нормы затрат для получения целевого продукта); - стандартным (иметь длительные сроки хранения без изменения физико-химических свойств и питательной ценности). Дифференциация питательных сред по целевому назначению. Прежде чем приступить к разработке ПС, необходимо решить вопрос о предназначении будущей среды. Следовательно, дифференциация ПС по целевому назначению также является одним из основных принципов их конструирования. В соответствии с этим принципом среды подразделяют: • на микробиологические (предназначенные для культивирования бактерий, дрожжей, грибов); • среды для культур клеток, часть из которых относят также к вирусологическим средам. По масштабам использования ПС подразделяются на: - производственные (технологические); - среды для научных исследований с ограниченным по объему применением. Производственные ПС должны быть доступными, экономичными, удобными в приготовлении и использовании для крупномасштабного культивирования. Среды для научных исследований, как правило, бывают синтетическими и богатыми по набору питательных веществ. Оптимизация многокомпонентного состава питательной среды. Процессы культивирования микроорганизмов можно оптимизировать методами, которые разделяются на две группы. К первой группе относятся методы оптимизации по экспериментальным данным. Они не требуют привлечения сложных математических расчетов, но связаны со значительными затратами времени, возникающими из-за необходимости проведения большого количества экспериментальных исследований. Ко второй группе относятся методы с применением математических моделей. В свою очередь последние подразделяются на две отличающиеся по сложности исполнения и точности описания реального процесса подгруппы. К первой следует отнести методы, основанные на построении математической зависимости (уравнения регрессии) протекания ограниченных процессов с использованием традиционного метода планирования эксперимента Бокса-Уилсона. Он позволяет строить поисковые модели, когда исследователь, не располагая сведениями о механизме соблюдаемого явления, имеет лишь информацию о реакции системы на возмущение. Ко второй подгруппе относятся методы, основанные на построении моделей, базисом которых являются законы, описывающие протекание фундаментальных процессов микробиологии (например, процесс размножения и отмирания микроорганизмов). В этом случае принимается за основу положение, что комплекс всех изменений, происходящих в культуральной жидкости (изменение содержания компонентов ПС, образование и расходование промежуточных продуктов биосинтеза, выделение метаболитов и катаболитов, трансформация органических соединений) - это следствие процессов самовоспроизведения, а также результат реакций, связанных с адаптацией и саморегуляцией микробной популяции. Задача оптимизации управляемого периодического процесса культивирования по максимизации бактериальной массы или целевого продукта в общем, виде выглядит следующим образом: определяется наиболее рациональный состав исходной ПС, а затем профили изменения основных технологических параметров, обеспечивающих значение выбранного критерия эффективности при заданных ограничениях. Обычно оптимизация процесса культивирования начинается с выбора ПС, обеспечивающей питательные потребности популяции микробов или синтез максимального количества продуктов метаболизма. Количество компонентов, входящих в ПС для выращивания микроорганизмов, может превышать десяток элементов. Биологической роли каждого элемента, влияющего в целом ряде случаев в микродозах на активность метаболических превращений в клетке, посвящено большое число исследований. Сложность выбора определяется еще и тем, что на рост микроорганизмов влияет также взаимное соотношение компонентов. Большое количество и взаимосвязь составляющих ПС ингредиентов обуславливает выбор методов экспериментального исследования. Обычно используемые методы однофакторного планирования в этих условиях малоэффективны. Использование же математических методов многофакторного планирования экспериментов позволяет установить необходимые концентрации компонентов питания с учетом их совместного влияния на скорость роста, качество биомассы и количество целевого продукта. Высоко объективным является и метод балансировки состава ПС, в основу которого заложено использование уравнения ассимиляции микробной популяции, где учитываются такие показатели: - концентрация потребляемого субстрата; - время потребления; - концентрация биомассы; - коэффициент метаболизма; - константы скорости образования и отмирания микроорганизмов; - концентрация субстрата в начальный момент культивирования. Обычно при периодическом процессе культивирования большинство важных параметров, в том числе и концентрация питательных веществ в культуральной жидкости, изменяется в течение времени. Вместе с тем, профили их изменения не всегда близки к оптимальным. Поэтому при подборе ПС для периодического культивирования возникает противоречие между необходимостью внесения в нее достаточно большого количества субстратов и ингибирующим влиянием высоких концентраций одного или нескольких элементов питания на рост микробной клетки и(или) биосинтез целевого продукта. Снижение концентрации таких субстратов в исходной ПС с последующим их добавлением в ферментор, по определенной программе, позволяет исключить ингибирование процесса в начальной фазе роста и в то же время не допустить его лимитирования в последующий период размножения микробов. Стандартизация питательных сред. Кроме оптимизированного состава, питательные среды, используемые в микробиологической практике для выполнения различных экспериментальных работ, а также для выпуска стабильных по своим свойствам биопрепаратов, должны быть стандартны. Под стандартностью ПС принято понимать постоянство их состава по биохимическим показателям: аминокислотному, минеральному, жирнокислотному, углеводному составам, а также содержанию витаминов, углеводородов, антибиотиков и др. компонентов. Большое значение для получения более стандартных ПС имеют разработки на использование в их производстве сухих питательных основ, готовых сухих ПС промышленного изготовления и сухих витаминсодержащих добавок. Примером может служить технология изготовления сухого ферментативного гидролизата казеина неглубокой степени расщепления, который широко используется при конструировании многих ПС, а также сухой экстракт кормовых дрожжей. Работы, направленные на повышение стандартности ПС, могут приводить к их удорожанию, но это считается оправданным, т.к. применение разнокачественных сред может приводить к срыву еще более дорогостоящего эксперимента, к появлению брака и к получению несопоставимых результатов. 1.4. ПОДГОТОВКА БИОРЕАКТОРА К ПОСЕВУ Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно придерживаться следующей генеральной линии: • Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранения требуемой микрофлоры. • Объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не было утечки или испарения содержимого. • Уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней аэрирования культуры аэробных организмов. • Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны постоянно контролироваться. • Культура при выращивании должна быть хорошо перемешиваемая. К материалам, используемым при конструировании сложных, прецизионно работающих ферменторов, предъявляются определенные требования (порой весьма строгие): а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающимися в биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения металлами даже в следовых количествах; б) материалы должны быть нетоксичным и, чтобы даже при самой малой растворимости они не могли бы ингибировать рост культуры; в) компоненты и материалы биореактора должны выдерживать повторную стерилизацию паром под давлением; г) перемешивающая система биореактора и места поступления и выхода материалов и продуктов должны быть легко доступными и достаточно прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механических воздействиях; д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой, так что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть прозрачными. 1.5. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В РЕАКТОРЕ И КОНТРОЛЬ ЗА ПРОЦЕССОМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ. Рассмотрим примеры особенностей культивирования некоторых микроорганизмов с применением: 1. Активной аэрации микробных культур. 2. В покоящемся состоянии без применения механических мешалок (без аэрации). 3. В состоянии анаэробиоза. Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации. Процесс осуществляют в реакторах объёмом от 0,01 до 100 м3, как правило, в асептических условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность, стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор подают простерилизованную в УНС и охлажденную до 25-35°С питательную среду, вносят посевной материал в количестве 5-10% объёма питательной среды (0,2-0,4 млрд. живых микробных клеток в 1 мл по оптической концентрации), включают систему аэрации и перемешивающее устройство. Так, например, для листерий и сальмонелл скорость вращения механической мешалки составляет 150-180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до 37°С очищенным, стерильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора обычно 0,5-0,8. Превышение этой величины может привести к значительному уносу пены с отходящим воздухом и нарушению асептических условий. Температуру культивирования поддерживают путём подачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппарата. Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С. Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культивирования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, кислоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов. Процесс культивирования контролируют по показателям приборов - изменение температуры, рН, расход воздуха, частота вращения мешалки, р0з, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса). В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта метаболизма, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микрофлоры. Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся состоянии без аэрации. Некоторые микроорганизмы относятся к группе микроаэрофильных (возбудители бруцеллёза, лептоспироза, кампилобактериоза и др.), которые не требуют принудительной аэрации питательной среды, в которой они выращиваются. Применяют баллонный и реакторный способы культивирования. Баллонный способ, в частности для культивирования лептоспир, заключается в том, что микробные культуры лептоспир каждого серологического варианта выращиваются в 16-литровых стеклянных баллонах с 10-12 л сывороточной или альбуминно-сывороточной (производственной) средами при температуре 27-28°С в течение 5-7 суток. При реакторном способе культивирование проводят в ферменторах, которые могут быть объединены в единую технологическую цепочку. Так, на Ставропольской биофабрике при культивировании лептоспир было смонтировано 54 реактора объёмом от 250 до 5000 л. Технология промышленного культивирования анаэробных микроорганизмов. К анаэробным микроорганизмам относятся такие, которые способны жить и размножаться при отсутствии атмосферного кислорода. В силу биологических особенностей анаэробов методы культивирования их в промышленности имеют свои особенности. 1. При культивировании анаэробных микроорганизмов нужно в реакторах создать условия полного вытеснения из питательной среды свободного кислорода. Это достигается путём заполнения анаэробостатов газовой смесью водорода и двуокиси углерода, а остаточный кислород может быть удалён путём каталитического связывания с воздухом. Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением в среду восстанавливающих агентов, таких как цистина и сульфида натрия, аскорбиновой кислоты. 2. Степень анаэробиоза определяется окислительно-восстановительным потенциалом (Eh). Для этих целей в среду вводят окислительно-восстановительные индикаторы, чаще всего используют резазурин (диазорезоурин), меняющий цвет от сине-розового до бесцветного. Бесцветное состояние достигается при Eh около 100 мВ и указывает на наличие анаэробных условий. 3. При культивировании анаэробов необходимо постоянно корректировать рН среды, поддерживая её в пределах 7,2-7,8. В процессе роста анаэробов рН среды очень быстро снижается в кислую сторону, что приводит к ингибированию их роста. Вопросы для контроля знаний и самопроверки.
|