оРбитрэп. Слайд
 Скачать 22.11 Kb.
|
|
(Слайд)А.А. Макаров свою научную деятельность начал в Московском инженерно-физическом институте (МИФИ), который окончил в 1989 г. В 1992 г. он защитил кандидатскую диссертацию на тему «Квази-изохронное движение заряженных частиц в статических электромагнитных полях». В 1994 г. А.А. Макаров становится научным сотрудником университета Варвика (Великобритания), а с 1998 г. работает в различных подразделениях компании Thermo Finnigan. В настоящее время А.А. Макаров является руководителем исследовательских работ в области наук о жизни в компании Thermo Electron в Бремене (Германия). Первая орбитальная ионная ловушка была разработана в конце 1990-х годов . Она представляла собой центральный электрод веретенообразной формы, помещенный внутрь двух точно его повторяющих симметричных внешних электродов, электрически изолированных друг от друга. Конструкция позволяла улавливать ионы электрическим полем, с максимальной точностью контролировать их движение и измерять частоты аксиальных колебаний по току, наведенному на внешних электродах ловушки и детектируемому дифференциальным усилителем. Затем широко- полосный частотный сигнал оцифровывался и конвертировался путем преобразования Фурье в частотный спектр, а затем – в спектр отношений массы к заряду. (СЛАЙД ) Хотя первые прототипы масс-анализатора Orbitrap представляли собой действительно успешное доказательство принципа его работы, однако для реализации ее аналитического потенциала потребовалось также решить задачу обеспечения достаточного числа ионов, приходящих извне в орбитальную ионную ловушку. Для их накопления была разработана специальная газонаполненная искривленная линейная ионная ловушка (С-образная ловушка), сделавшая возможным сопряжение импульсно работающего Orbitrap с непрерывными источниками ионов, такими как электрораспылители [7]. Чтобы ионы, собранные в квадрупольной С-образной ловушке, инжектировать в Orbitrap, радиочастотное удерживающее напряжение на ее электродах импульсно меняется на сильное поле, выталкивающее ортогонально искривленной оси устройства. В результате этого ионы с каждым отношением массы к заряду фокусируются на входном отверстии в орбитальную ловушку, втягиваются туда электродинамическим полем и начинают когерентные аксиальные колебания (рис.1). В начале 2000-х годов развитие протеомики и метаболомики требовало появления прибора с масс- анализатором, сочетающего в себе эффективность фурье-ИЦР спектрометров с компактностью, простотой и способностью выделять и фрагментировать ионы. И здесь использование Orbitrap в тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) смогло предоставить решение, обеспечивающее необходимо высокое разрешение (ВР), точность определения масс (ТМ) и скорость измерений при весьма скромных требованиях к лабораторному пространству и эксплуатационному обслуживанию. Вполне естественным первым шагом на этом пути стало объединение в одном приборе масс-анализаторов с орбитальной и линейной ионными ловушками. Последняя очень хорошо зарекомендовала себя в области протеомики, поскольку обеспечивала хорошую совместимость с жидкостной хроматографией (ЖХ) по скорости и высокой чувствительности и поддерживала несколько уровней фрагментации и выделения ионов-предшественников (возможности МСn) путем диссоциации, индуцированной столкновениями (CID). (СЛАЙД )Такой прибор впервые разработала и представила в 2005 году компания Thermo Electron (ныне Thermo Fisher Scientific). Модель получила название LTQ Orbitrap. Ее оригинальная конструкция (рис.2) обеспечила необходимую гибкость, позволяющую записывать как МС-, так и МСn-спектры либо с помощью масс-анализатора Orbitrap, чтобы получить максимальное значение ВР/ТМ, либо с помощью линейной ионной ловушки, обеспечивающей максимальную скорость и чувствительность. Наиболее используемым режимом в нем стало применение орбитальной ионной ловушки для получения спектров в широком массовом диапазоне, и линейной – для параллельного сбора МС/МС-спектров. Это позволило достигнуть максимальной точности и разрешения при обнаружении ионов-предшественников в спектрах сложных смесей и проводить тандемные масс-спектрометрические эксперименты с чувствительностью и скоростью, соответствующими временным масштабам ЖХ. Масс-спектрометр LTQ Orbitrap на момент своего появления решал сразу несколько насущных проблем исследований в области протеомики по идентификации пептидов. Во-первых, высокоточное измерение ВР/ТМ, реализованное в приборе, значительно упрощало идентификацию ионов по их m/z в сложных смесях, поскольку позволяло использовать для этого поиск по базам данных. Так, при полном сканировании в масс-анализаторе Orbitrap с разрешающей способностью 120 000 по ширине пика на полувысоте (FWHM) на m/z 400 а.е.м. экспериментатор за одно хроматографическое разделение получает список возможных предшественников, структуру которых можно уточнить с помощью фрагментации с использованием CID. Во-вторых, LTQ Orbitrap оказался пригодным для применения в качестве инструмента количественного анализа. Cтабильность точного измерения массы позволила создавать узкие окна для количественного извлечения ионов предшественников, высокая разрешающая способность – снижать влияние химического шума, а быстрота сканирования (3–5 Гц) в сочетании с тандемной МС обеспечили возможность однозначного подтверждения содержания аналитов даже при их низком уровне. И, наконец, в-третьих, в приборе была применена автоматическая регулировка усиления (АРУ), кото- рая представляет собой короткое предварительное сканирование в линейной ионной ловушке для того, чтобы определить величину ионного тока в интересующем диапазоне масс. Это позволяет поддерживать необходимое количество ионов в С-образной ловушке для последующего масс-анализа, устраняя проблемы с величиной пространственного заряда и поддерживая высокую чувствительность. Однако несмотря на успех в исследовательском сообществе, LTQ Orbitrap имел несколько существенных ограничений. Прежде всего, используемый в приборе метод фрагментации на основе CID хотя и хорошо показал себя для идентификации пептидов, однако был неприменим для фрагментов белковых молекул с посттрансляционными модификациями (ПТМ), такими как, например, фосфорилирование и гликозилирование. Кроме того, на практике точное измерение массы в тандемных МС-экспериментах оказывалось недостаточно быстрым для применения вместе с ЖХ сверхвысокого давления. Чтобы решить эти проблемы, в следующей модели масс-спектрометра – LTQ Orbitrap XL – была улучшена конструкция С-образной ловушки и реализованы дополнительные методы фрагментации, такие как диссоциация, индуцируемая столкновениями при повышенной энергии (HCD), и позднее – диссоциация при переносе электрона (ETD). Включение камеры высокоэнергетичных столкновений (HCD-камера) в конструкцию Orbitrap было произведено по примеру ее применения в тройных квадрупольных и квадруполь-времяпролетных масс-спектрометрах. В приборе она располагалась непосредственно после С-образной ловушки (СЛАЙД ). Это было сделано в первую очередь для того, чтобы за счет удаленного расположения уменьшить перетекание газа из HCD-камеры в масс-анализатор с линейной ионной ловушкой. Кроме того, такая геометрия делала прибор более компактным и обеспечивала бóльшую гибкость в эксплуатации. Для решения задач протеомики объединение Orbitrap с камерой активных столкновений было в частности полезно тем, что в ней генерируются ионы иммония, естественного маркера при секвенировании пептидов de novo. И это не только облегчает процесс установления их структуры, но и содействует активному расширению библиотек фрагментации. В LTQ Orbitrap XL вместе с орбитальной ионной ловушкой также впервые был использован еще один метод фрагментации, ETD. Он был разработан в 2004 году для улучшения определения аминокислотных последовательностей в белках и пептидах, а также установления локализации, структуры и содержания неустойчивых ПТМ. Первоначально в качестве ETD-реагента использовались анионы флуорантена, которые генерировались в источнике, расположенном за камерой активных столкновений. Через нее и С-образную ловушку они попадали в масс-анализатор с линейной ионной ловушкой, где, собственно, и реагировали с пептидными катионами. Поскольку при этом фрагментируются преимущественно пептидные цепи, посттрансляционные модификации сохраняются без изменений. Фрагментация по методу ETD носит неэргодичный характер (т.е. результат зависит от пути протекания процесса), чувствительна к зарядовой плотности и способствует выявлению предшественников с высоким зарядом и низким m/z. Объединение данных, получаемых таким образом, с данными CID, позволило разработать оптимизированный метод дерева решений, используемый в масс-спектрометрическом анализе. Он нашел применение не только для идентификации и определения расположения ПТМ, но и для установления самих пептидных последовательностей. По своим характеристикам LTQ Orbitrap XL в конце 2000-х годов позволял решать большое число исследовательских задач. Он обеспечивал разрешение 60000 (на m/z 400 а.е.м. и скорости сканирова- ния 1 Гц) и массовую точность 1–3 ppm в диапазоне m/z до 4000 а.е.м. Однако требовалось дальнейшее повышение чувствительности и скорости сканирования для того, чтобы работать со сложными белковыми смесями, не прибегая к их глубокому предварительному фракционированию и обработке. Для решения этих задач компания Thermo Fisher Scientific выпустила в 2009 году новый масс-спектрометр LTQ Orbitrap Velos (слайд) . Он обладал более высокой чувствительностью (в 3–5 раз в режиме полного сканирования и до 10 раз в режиме МС/МС). Это было достигнуто за счет изменения интерфейса ввода ионов путем использования новой ионной оптики (S-линза) и создания новой двухкамерной конструкции масс-анализатора с линейной ионной ловушкой. Назначением S-линзы, кольцевых радиочастотных устройств, служила эффективная фокусировка ионов в узком ионном пучке для увеличения надежности и эффективности его транспортировки. В двухкамерной ионной ловушке первая камера высокого давления была оптимизирована для выделения и фрагментации ионов, вторая – низкого давления – для их ускоренного анализа. Все вместе это позволяло увеличить поток ионов в систему, а затем быстро и эффективно ими манипулировать. Кроме того, теперь время впрысков ионов для тандемной МС определялось не по различным предварительным сканированиям, выполняемым для каждого предшественника (АРУ), а по ионным интенсивностям, измеренным в результате предыдущих полных спектров (предиктивная АРУ). Тем самым также сокращалась длительность аналитического процесса, что дало возможность увеличить частоту сканирований до 10 Гц и сделать в протеомике обыденным анализ нефракционированных образцов [4]. |