Субхонова С.301А.сам.раб.фармхимия. Современные методы анализа антибиотиков

• Название: Современные методы анализа антибиотиков
• Дата: 04.02.2022
• Размер: 5.42 Mb.
• Имя файла: Субхонова С.301А.сам.раб.фармхимия.rtf
• Тип: Самостоятельная работа; #352018
• страница: 3 из 6

2. Количественное определение антибиотиков

В процессе производства требуется определить содержание антибиотика в культуральной жидкости в ходе ферментации, во всех промежуточных продуктах при выделении и очистке и, наконец, в готовом препарате. Для этого применяют большое количество самых разнообразных биологических и химических методов.

Количество антибиотиков выражают в так называемых единицах действия (ЕД). Определение единицы не одинаково для всех антибиотиков. У антибиотиков, которые были выделены в чистом виде, единица определяется как микрограмм чистого вещества. К сожалению, здесь нет единства, так как у некоторых антибиотиков за единицу принимается микрограмм соли (например, хлортетрациклин солянокислый), а у других − микрограмм основания(например, у стрептомицина).

Активность антибиотических препаратов в твёрдом состоянии выражается количеством единиц в 1 мг вещества. Содержание антибиотика в культуральной жидкости, в концентратах и растворах выражается числом единиц в 1 мл жидкости.

Количественное определение антибиотиков можно проводить как химическими, так и микробиологическими методами. Главными преимуществами химических методов являются их быстрота и сравнительно высокая точность. Преимуществом же микробиологических методов является их намного большая специфичность: посторонние примеси, содержащиеся в испытуемых образцах, не влияют в такой степени на результаты, как это бывает при химических методах.

Микробиологически можно определить и содержание таких антибиотиков, химические и физико-химические свойства которых ещё подробно неизвестны.

2.1 Микробиологическое исследование антибиотиков

Основным принципом микробиологических методов количественного определения активности антибиотика является определение степени задержки роста микроба, чувствительного к данному антибиотику. Культуры или микробы, используемые для этой цели, называются тест-культурами, или тест-микробами. Задержка роста, вызванная определённым количеством используемого материала с неизвестным содержанием антибиотика (например, культуральной жидкости, промежуточного продукта на стадии выделения лекарственно формы препарата и т. п.), сравнивается с задержкой роста тест-культуры, вызванной определённым, известным количеством данного антибиотика (стандартом).

Микробиологические методы определения активности антибиотиков можно в основном разделить на методы, при которых воздействие на тест-культуру исследуется на жидкой среде, и методы, при которых воздействие антибиотика на тест-культуру оценивается с применением твёрдой питательной среды. К первой группе относятся методы серийных разведений и турбидиметрические методы; ко второй группе − методы диффузии в агар на чашках и методы диффузии в агар в капиллярах или пробирках. Основными требованиями, которые необходимо предъявлять к микробиологическим методам количественного определения антибиотиков, являются следующие.

1. Точность.

2. Чувствительность.

3. Простота техники эксперимента.

4. Наиболее короткое время инкубации.

Более или менее совершенное выполнение всех этих требований зависит прежде всего от применяемого метода. Для достижения максимальной чувствительности, кроме того, немалую роль играет культура, используемая для определения. Важным критерием метода является также хорошая воспроизводимость результатов в условиях различных лабораторий.

2.1.1 Методы разведений

Принципом методов разведений является определение количества антибиотика, которое полностью подавляет рост тест-культуры. При этом раствор анализируемого образца с неизвестным содержанием антибиотика и раствор стандарта с известным содержанием антибиотика разводят в геометрической прогрессии питательной средой, предварительно засеянной тест-культурой. По истечении необходимого времени инкубации определяют максимальное разведение образца и стандарта, которое ещё подавляет рост тест-культуры. Путём сравнения этих разведений вычисляют активность исследуемого образца. Вследствие того что оценку проводят по качественному признаку ("растёт"-"не растёт"), этот метод не удовлетворяет первому из перечисленных выше требований. Вместе с тем главным преимуществом методов разведений является их высокая чувствительность, возможность определять очень малые количества антибиотиков, а в некоторых случаях – и короткое время (около 3 часов), необходимое для получения результатов.

При определении содержания антибиотиков в жидкостях тела методом серийных разведений можно использовать индикаторы, реагирующие на изменение рН или окислительно-восстановительного потенциала в процессе роста тест-микроба, например бромкрезоловый красный, метиленовый синий, тимоловый синий, водный синий или феноловый красный и др.

2.1.2 Турбидиметрические методы

Турбидиметрические методы, как и методы разведений, обычно удовлетворяют требованиям, указанным в пп. 2-4, но при этом их точность по сравнению с методами разведений значительно выше ввиду возможности непрерывного проведения количественных измерений.

Принципом, на котором основаны эти методы, является измерение задержки роста тест-организма, проявляющейся в большем или меньшем помутнении питательной среды. Для измерения помутнения используют фотоэлектрические нефелометры. Путём сравнения интенсивности задержки роста, вызванной действием неизвестного количества антибиотика со стандартной кривой, выражающей степень задержки, вызываемой известными количествами антибиотика, производят вычисление активности анализируемого образца. Турбидиметрические методы по сравнению с методами диффузии обычно являются сравнительно менее точными, так как микроорганизм, растущий на жидких питательных средах, при рабочих условиях проведения анализа более чувствителен к изменчивым факторам внешней среды.

На результат могут повлиять и некоторые сопутствующие вещества, содержащиеся в испытуемом образце; при методах диффузии влияние этих веществ вследствие их меньшего проникновения в агар устраняется. Этими веществами являются, например, жирные кислоты или глюкозодегидрогеназа. Эти методы нельзя применять для определения активности антибиотиков в образцах, которые являются либо окрашенными, либо дают мутный раствор, если только это явление нельзя устранить путём соответствующей обработки стандарта.

Источником ошибок могут быть и конечные, неспецифические изменения окраски культуры или изменения помутнения, которые могут произойти, например вследствие изменения рН при выращивании микроорганизмов. Несмотря на это, однако, турбидиметрические методы применяются весьма широко, главным образом потому, что по сравнению с методами диффузии в агар они требуют значительно меньшего времени инкубации.

2.1.3 Методы диффузии в агар

При производстве и разработке технологии получения антибиотиков, пожалуй, наиболее часто применяют методы диффузии в агар, которые по сравнению с предыдущими двумя методами обеспечивают большую точность результатов. В некоторых модификациях с помощью этих методов можно определять даже доли микрограмма антибиотика. Их недостаток состоит в том, что они требуют относительно длительного времени инкубации (примерно 18 часов). По сравнению с турбидиметрическими методами методы диффузии являются более выгодными также и потому, что они обычно требуют меньше места для инкубации.

Методы диффузии в агар на чашках основаны на том, что антибиотик диффундирует из испытуемого образца в питательную агаровую среду, засеянную чувствительной к данному антибиотику культурой. Вокруг образца образуется круглая зона, в пределах которой тест-культура не растёт. Начало этому методу положила оксфордская группа исследователей, которая разработала так называемый метод с цилиндриками. По этому раствор антибиотика (образца и стандарта) заливают в полые цилиндрики, помещённые на поверхность засеянной тест-микробами агаровой среды в чашках Петри. Определение активности производят путём сравнения величин зон задержки роста у образца и стандарта при одном и том же разведении.

При методах диффузии в агар на чашках образующиеся зоны задержки не являются точно круглыми, и, следовательно, измерение их диаметра в разных направлениях даёт непостоянные и тем самым недостаточно точные результаты. От этого недостатка свободны линейные методы диффузии, при которых измеряется задержка роста, получавшаяся вследствие диффузии раствора антибиотика лишь в одном измерении. При этих методах раствор антибиотика либо наливают на засеянную тест-микробами питательную среду в пробирке, либо засеянную питательную среду насасывают в стеклянные капилляры, которые погружают затем в раствор антибиотика. Рост и здесь может быть выявлен вследствие гемолиза или изменения окраски индикатора, добавленного к агаровой питательной среде. Весь процесс может быть в ряде операций механизирован и автоматизирован.

При приготовлении растворов испытуемого образца и стандарта для количественного определения антибиотиков методами диффузии значительно более серьёзной задачей является выбор жидкостей, применяемых для растворения. Обычно для растворения образца и стандарта применяют фосфатные буферные растворы, рН которых выбирают так, чтобы разложение антибиотика было как можно меньшим, а тест-культура была наиболее чувствительной. Для стрептомицина, например, выбирают буфер с рН>7,0, для пенициллина и тетрациклиновых антибиотиков – буфер с рН<7,0.

В соответствии с этим устанавливают и рН используемой для определения агаровой питательной среды. Здесь, однако, нужно иметь в виду, что рН среды влияет на рост тест-организма и что фосфатные анионы оказывают стабилизирующее действие на растворы пенициллина.

Особой проблемой микробиологического определения активности антибиотиков является определение отдельных антибиотиков в смесях методом, отличным от хроматографического. Эта проблема возникла впервые, когда нужно было определять отдельные пенициллины относительно друг друга. Ввиду того что активность отдельных пенициллинов различна при испытании с разными культурами, можно, кроме хроматографического метода, использовать и так называемое дифференциальное титрование, при котором образец, содержащий смесь пенициллинов, титруют либо турбедиметрическим, либо методом диффузии в агар с использованием нескольких различных тест-организмов. Присутствие отдельных пенициллинов в смеси затем рассчитывают на основании соотношения известной активности отдельных пенициллинов против отдельных тест-культур. При определении содержания пенициллина и стрептомицина в лекарственных формах, содержащих смесь этих антибиотиков, можно либо инактивировать пенициллин с помощью пенициллиназы, либо определить пенициллин с микробом, устойчивым к пенициллину. Подобные же методы применяют и при определении других антибиотиков в смесях.