Биология. Сравнение характера накопления ауксина в онтогенезе растений с использованием трансгенных растений
 Скачать 2.89 Mb.
|
|
ГБОУ ОЦ «Школа на проспекте Вернадского» Сравнение характера накопления ауксина в онтогенезе растений с использованием трансгенных растений Плющева Александра Васильевна Научный руководитель: к.б.н. Куприянова Евгения Владимировна Москва 2017 Содержание
Аннотация В работе исследовалась мутантная линия модельного растения Arabidopsisthaliana, несущая мутацию в гене taeихарактеризующаяся изменениями морфологии листа, которые могут являться результатом аномально высокого содержания в них ауксина. С помощью одного из самых эффективных методов - гистохимической окраски insitu– был проведен сравнительный анализ распределения ауксина в трансгенных растениях A.thaliana, в геном которых встроен репортерный ген β-глюкуронидазы GUS. Введение Выяснение функции генов модельных объектов до сих пор является актуальной и сложной задачей для исследователей. Продукт одного гена может выполнять различные функции в разных тканях и органах, на разных этапах онтогенеза. Одним из самых эффективных методов для изучения функции генов и их взаимодействия является метод с использованием трансгенных растений, в геном которых встроены репортерные гены. Этот метод позволяет определить локализацию продукта не только в тканях растений, но и в одной клетке, а также выявить очень слабый уровень экспрессии генов, даже тот, который не детектируется другими современными методами. Использование таких трансгенных растений имеет большое прикладное значение и позволяет не только изучать закономерности морфогенеза растений, но и создавать новые биологически безопасные сорта, у которых экспрессия генов, контролирующих хозяйственно-важные признаки, наблюдается только в определенных органах и тканях, а также для мониторинга загрязнения окружающей среды. С этой целью получают трансгенные растения, в геноме которых имеются репортерные гены, слитые с регуляторными участками тех генов, которые участвуют в ответе на стрессовые воздействия. Итак, целью нашей работы явилось сравнение распределения ауксина в растениях Arabidopsisthaliana дикого типа и мутанта tae с использованием трансгенной линии DR5::GUS. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: - Анализ содержания активного ауксина на разных этапах онтогенеза A. thaliana - Изучение распределения ауксина в листьях растений разного возраста с использованием трансгенной линии A.thaliana - Исследование влияния мутации taeniataна содержание и распределение активного ауксина в проростках и листьях разного возраста - Анализ связи между образованием почек на листьях мутанта и участками локализации на листьях ауксина. 1. Обзор литературы Ауксин (ИУК, гетероауксин) является одним из основных гормонов высших растений и присутствует почти во всех тканях. Впервые был замечен Чарльзом Дарвином в 1880 году и описан Ф. Кеглем в 1935 как идонил-3-уксусная кислота. Ауксин выполняет множество функций: активирует деление и растяжение клеток, является необходимым при формировании сосудов и боковых корней (вызывает закладку корней и ингибирование их роста), стимулирует выработку этилена. Поддержание необходимого уровня ауксина в клетках и тканях растительного организма обеспечивается за счет процессов его синтеза, транспорта, образования конъюгатов с различными соединениями. Существует несколько путей биосинтеза ИУК в растительных тканях, и три из них основаны на синтезе ауксина из аминокислоты триптофана. В зависимости от вида растения образование ИУК из триптофана может идти через индолил-3-пиро-виноградную кислоту, через триптамин и через индолил-3-ацетальдоксим. Также существует триптофан-независимый путь. Из всех фитогормонов только для ИУК характерно ярко выраженное полярное передвижение по тканям растительного организма (Медведев, 2012). Основной полярный поток ауксина в побегах и корнях направлен сверху вниз, по клеткам камбия, флоэмной и ксилемной паренхимы. Полярный транспорт гетероауксинов обуславливает апикальное доминирование и обеспечивает дифференцировку тканей в ходе развития растения. Ауксин способен влиять на расположение листьев (филлотаксис), а подавление его транспорта блокирует формирование листьев растения (Reinhardt Etal, 2000). Образовав конъюнгаты с аминокислотами или сахарами, ауксин способен «инактивироваться» и запасаться в организме растения. Объектом исследования являются линии однолетнего двудольного растения семейства крестоцветных – Arabidopsisthaliana. Это небольшое цветковое сорное растение является генетической моделью, имея целый ряд преимуществ: небольшой размер, короткий жизненный цикл, способность к самоопылению, небольшой геном (первый секвенированный геном растений), высокая плодовитость, миниатюрность, которая дает возможность выращивать это растение в лабораторных условиях круглый год. 2. Материалы и методы В работе использовали следующие линии A. thaliana из коллекции кафедры генетики МГУ: - растения дикого типа (раса Blanes), - мутантная линия, которая несет рецессивную мутацию taeniata (tae), - трансгенные линии A. thaliana, содержащие репортерный ген GUS (DR5::GUS, tаeDR5::GUS). Растения дикого типа (раса Blanes) и мутанта taeвыращивали при 16-часовом фотопериоде как в теплице на почве, так и в ростовой комнате на чашках Петри с агаризованной средой Квитко (Квитко, 1960, Табл.1). Интенсивность освещения 4000 лк, температура в теплице 20 – 27оС (день 25-27оС и ночь 20-22оС), в ростовой комнате 24оС. Перед посадкой на среду семена стерилизовали раствором (70% спирт и 5% перекись водорода) в течение 3 минут. Таблица 1: Состав среды Квитко
Для анализа характера распределения ауксина использовали достаточно простой, но очень информативный метод гистохимического окрашивания in situ. Растения трансгенной линии A.thaliana, содержали конструкцию (DR5::GUS) слитого гена DR5, синтетического промотора ответа на ауксин, с репортерным геном GUS из E.coli, кодирующим бета-глюкорунидазу. Инкубация растительных образцов проводилась в 20мМ растворе X-Gluc, в который входит фосфатный буфер (гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия), X-gluc (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронид) и TWEEN 20. (в термостате 48ч при 37оС). В результате ферментативного гидролиза X-gluc и последующих реакций окисления и димеризации образуется нерастворимый продукт синего цвета (дихлоро–броминдиго) (Кавай-оол и др., 2011). После инкубации окрашенные образцы помещались в 70% этанол для удаления хлорофилла, который затрудняет анализ (смена раствора проводилась 3 раза, до полного обесцвечивания). Окрашенные образцы анализировали под микроскопом. 3. Результаты Анализ распределения ауксина в растениях дикого типа и мутанта taeniata Проведен анализ содержания активного ауксина на разных стадиях онтогенеза растений A. thaliana. В молодых проростках растений дикого типа экспрессия трансгена DR5::GUSвыявлена на кончиках и вдоль сосудов семядольных листьев и корней (рис. 1А). Анализ распределения ауксина в листьях растений разного возраста показал экспрессию слитого гена DR5::GUSв локальных участках листьев розетки (в кончиках зубчатых выростов листа) (рис.1Б). Эти локальные участки соответствуют местам расположения гидатод. Высокий уровень экспрессииDR5::GUS наблюдали в тычинках распускающихся бутонов (рис.1В). А Б В    |