Зачёт. Стрра, свва, механизм действия биокатализаторов. Классификация и номенклатура. Сходство от синтетических
 Скачать 110.13 Kb.
|
Отличия: (обусловлены белковой природой ферментов)
Механизм: На основании специфичности действия и субстратной специфичности выделяют 6 классов ферментов. Оксидоредуктазы. Катализируют окислительно-восстановительные реакции. Трансферазы. Осуществляют межмолекулярный перенос различных атомов, групп атомов и радикалов. Гидролазы. Этому классу принадлежат ферменты, которые катализируют гидролитическое расщепление (при участии молекулы воды) внутримолекулярных связей С–О, С–N, С–С. Лиазы катализируют присоединение определенных групп к двойным связям или наоборот обеспечивают негидролитический разрыв связей С–С, С–О, С–N путем отщепления определенных групп от субстрата с образованием двойной связи. Изомеразы катализируют структурные изменения в пределах одной молекулы. Лигазы (синтетазы) катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ или другого нуклеозидтрифосфата. Первое число показывает, к какому из шести классов принадлежит фермент. Второе число в индексе обозначает подкласс и указывает группу в доноре водорода, подвергающуюся окислению. Третье – показывает тип используемого акцептора. Четвертое число – порядковый номер фермента в его подклассе. Строение биокатализаторов: сложная пространственная структура и наличие химических групп. В структуре белков можно условно выделить несколько уровней организации: 
Первичная структура. Линейная последовательность аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями. Боковые цепи аминокислотных остатков взаимодействуют друг с другом и непосредственным окружением белка, тем самым определяя геометрическую конфигурацию белковой молекулы. Вторичная структура. Это способ расположения полимерной цепи в пространстве, обусловленный главным образом водородными связями между близко расположенными аминокислотными остатками. Некоторые аминокислоты способствуют образованию α-спирали. Другие чаще встречаются в составе β-структуры. Глицин, пролин и аспарагин обычно расположены в местах изгиба цепи. Очевидно, что способ укладки полипептида прямо детерминируется его первичной структурой. Если в каком-либо месте цепи сосредоточено несколько остатков, способствующих образованию спирали, то образуется спираль. Спираль растет в обоих направлениях до тех пор, пока не натолкнется на остаток, препятствующий ее образованию. Третичная структура. α-спирали и β-слои – представлены в белке лишь частично. Они перемежаются неупорядоченными участками, в которых белковая цепь обладает значительной гибкостью. В результате белковая молекула сворачивается в глобулу. Именно эта структура является биологически функциональной. Основной является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами растворителя (воды). Неполярные гидрофобные радикалы аминокислот погружаются внутрь белковой молекулы, в то время как полярные радикалы ориентированы в сторону воды. В такой форме белковая молекула обладает минимальной свободной энергией. Увеличение свободной энергии укладки белка компенсируется образованием внутримолекулярных ковалентных и нековалентных связей, приводящих к снижению энтальпии фолдинга. благодаря гидрофобному эффекту. Во время фолдинга белка степень упорядоченности в объеме воды снижается. В результате этого увеличивается энтропия системы. Если сумма –TSap и Hfold больше, чем –TSconf, то изменение свободной энергии укладки Gfold отрицательно, и следовательно, термодинамически выгодно. В этом случае белок будет спонтанно свертываться в глобулу со стабильной конформацией. Формирование гидрофобного ядра и мозаичной поверхности, содержащей как гидрофильные, так и гидрофобные элементы, – накладывает ограничение на размер глобулы. Доменами называют области в третичной структуре белка, которым свойственна определенная автономия структурной организации. Во впадине, разделяющей домены, формируется каталитический центр. В стабилизации пространственной структуры белков основную роль играют нековалентные связи = слабые взаимодействия. К ним относятся вандерваальсовы силы, водородные связи, электростатические взаимодействия заряженных групп и гидрофобные взаимодействия. В создании устойчивых конформаций белков важную роль играют также ковалентные связи между SH-группами. Дисульфидные связи значительно реже образуются во внутриклеточных ферментах. По-видимому, внутри клеток ферменты защищены от многих воздействий и не нуждаются в дополнительной стабилизации. Четвертичная структура. Упаковка в пространстве отдельных полипептидных цепей (субъединиц), обеспечивающий формирование единого в структурном и функциональном отношениях белка. Четвертичная структура стабилизируется теми же силами, что и третичная.
Фермент обеспечивает пространственное сближение двух субстратов и их строгую взаимную ориентацию в активном центре. Специфичность ферментов: ключ – замок. Присутствие субстрата индуцирует структурные изменения активного центра, обеспечивающие связывание субстрата. Одновременно с этим происходит изменение структуры субстрата, благодаря чему достигается его комплементарность измененному активному центру Субстраты при этом приобретают оптимальное положение для образования переходного состояния. Связывание субстрата в активном центре приводит к удалению гидратной оболочки субстрата, в результате чего создаются, по сравнению с раствором, совершенно другие условия для катализа. Эффект стабилизации переходного состояния вследствие взаимодействия между субстратом и аминокислотными остатками фермента. Фермент индуцирует конформационное изменение в молекуле субстрата, приводящее к ослаблению специфических связей. Определенная ориентация кислотных и основных групп активного центра фермента делает возможным перенос протонов в субстрате. Определенные (чаще всего нуклеофильные) группы активного центра могут образовывать ковалентные связи с субстратом, приводя к образованию более реакционноспособных по сравнению с субстратом структур. Кофактор + апофермента.
Под специфичностью действия понимают способность фермента из многих возможных с данным субстратом реакций ускорять лишь одну. Субстратная специфичность может быть абсолютной, относительной и с выраженной неспецифичностью. Связывание субстрата в активном центре фермента обеспечивается слабыми нековалентными взаимодействиями и сопровождается уменьшением свободной энергии системы. Для превращения субстрата в продукт следует затратить энергию, необходимую для ориентации реагирующих групп, образования нестабильных зарядов, перегруппировки связей и т. д. Участники реакции должны перейти на более высокий энергетический уровень, то есть оказаться в переходном состоянии. Энергия, необходимая для достижения переходного состояния, называется энергией активации. Переходное состояние – это геометрическая и электронная структура, отражающая комбинированное состояние фермента и субстрата, в котором реализуется оптимальная ориентация реагирующих групп и происходит постоянное образование и разрыв связей. Скорость реакции находится в обратной зависимости от величины энергии активации: чем выше ∆G± , тем ниже скорость. Это понятно, поскольку скорость реакции пропорциональна концентрации активированного комплекса, которая тем выше, чем ниже энергия активации. Мало с чем сравнимая эффективность ферментов как катализаторов объясняется их способностью снижать энергию активации и смещать равновесие в сторону образования переходного состояния. Достигается это благодаря очень прочному связыванию структуры переходного состояния. Энергия связывания переходного состояния (∆Gсвяз = -RTlnKравн) является отрицательной величиной, поэтому ее возрастание будет снижать энергию активации: (∆G± = ∆G± кат + (–RTlnKравн). Увеличение энергии связывания лиганда по мере перехода от субстрата к переходному состоянию фактически обеспечивает ферментативный катализ.
Из-за слабости стабилизирующих сил молекула белка может сравнительно легко принимать несколько альтернативных конформаций. Под денатурацией понимают нарушение уникальной пространственной структуры нативного белка, приводящее к частичной или полной потере характерных для него свойств. Денатурация приводит к развертыванию молекулы белка. При этом амидные группы пептидной цепи образуют водородные связи с окружающими их молекулами воды, которых намного больше, чем внутримолекулярных. Стабильность нативной структуры белков крайне низка и денатурация фермента может быть вызвана множеством факторов. Воздействия, которые могут вызывать инактивацию ферментов: Нагревание, переохлаждение, облучение, ультразвук, сорбцию на границах раздела фаз. Химическая инактивация вызывается щелочами и кислотами, ПАВ, органическими растворителями, окислителями (О2, Н2О2), восстановитлями – ионами металлов. Биологическая происходит в результате воздействия протеаз и протеинкиназ. Механических факторов, например гидравлических сил, возникающих при движении потока жидкости. Процесс инактивации ферментов можно представить в виде двух- стадийной схемы: N↔D→U, где N, D и U – соответственно нативная, обратимо денатурированная и необратимо инактивированная формы фермента. Другими словами, резкое охлаждение приводит к своеобразной фиксации белка в необратимо денатурированном состоянии, из которого он уже не может самопроизвольно ренатурировать.
Разрыв полипептидной цепи (Наиболее чувствительными к высокотемпературному гидролизу являются пептидные связи, образованные остатками аспарагиновой кислоты) и хим. модификация отд. функциональных групп белка: каталитических SH-групп в среде катионов тяжелых металлов, окисление функциональных групп фермента, расщепление дисульфидных связей, фосфорилирование белков in vivo, дезаминирование остатков аспарагина, радиационная инактивация ферментов (γ-облучение и УФ-свет) – воздействию в первую очередь подвергаются функциональные группы ферментов, пептидные связи и SH-группы, уменьшается число структурообразующих взаимодействий и происходит формирование высоконеупорядоченных конформаций и агрегатов. Можно использовать обратную химическую реакцию. Например, ферменты, инактивация которых была вызвана окислением SH-групп, удается реактивировать с помощью восстанавливающих агентов – тиолов. Гидролиз пептидных связей, фосфорилирование или дезамидирование остатков аспарагина, является более сложной задачей. Для реактивации агрегированных белков необходимо разрушить межмолекулярные ковалентные и нековалентные контакты. Для этих целей можно использовать концентрированные растворы мочевины, а также экстремальные значения рН. Реактивация необратимо денатурированных ферментов: На первом этапе добиваются полного разворачивания инактивированного фермента путем разрушения всех нековалентных взаимодействий, на следующем этапе создают условия, при которых развернутый белок может свернуться в каталитически активную конформацию (добавление эффекторов).
Агрегация ферментов в растворе наблюдается при повышенной температуре, при экстремальных значениях рН, а также в присутствии некоторых химических соединений. Чем выше концентрация белка в р-ре, тем быстрее идет агрегация. В формировании агрегатов принимают участие главным образом гидрофобные взаимодействия и водородные связи. Это итоге приводит к агрегации и/или химической модификации важных функциональных групп фермента. Для реактивации агрегированных белков необходимо разрушить межмолекулярные ковалентные и нековалентные контакты. Для этих целей можно использовать концентрированные растворы мочевины, а также экстремальные значения рН. Десорбция кофактора. При нагревании, действии хелаторов кофакторы могут диссоциировать из активных центров ферментов. Если при этом не произошло существенного изменения белковой конформации, то при добавлении в среду избытка кофактора денатурированный фермент может самопроизвольно реактивироваться. Если диссоциация кофактора сопровождается значительными конформационными сдвигами или хим. модификацией важных функциональных групп, фермент инактивируется необратимо. Распад олигомерных белков на отдельные субъединицы (действие мочевины, детергентов, кислот, нагревания). Подобная диссоциация провоцирует конформационные изменения в отдельных субъединицах, агрегацию субъединиц, диссоциацию кофакторов из активных центров, модификацию функциональных групп, которые в олигомерном белке были экранированы от контакта с растворителем. Инактивация поверхностным натяжением. Пенообразование может вызывать денатурацию ферментов, адсорбированных на границе раздела фаз. Добавление поверхностно-активных веществ снижает поверхностное натяжение на границе вода–воздух, поэтому этих условиях ф-ты не денатурируют. Сорбция на стенках реакционного сосуда. Стекло способно сорбировать на своей поверхности ферменты за счет образования слабых нековалентных взаимодействий. Сорбция приводит к уменьшению концентрации фермента в растворе: “кажущаяся” инактивация. Под влиянием денатурационных факторов способность белков сорбироваться на стенках сосуда может существенно возрастать. Это происходит благодаря появлению новых дополнительных центров взаимодействия с поверхностью сосуда. Десорбция фермента со стенок реакционного сосуда достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий между белком и сорбционными центрами на поверхности сосуда. Для этого можно использовать экстремальные значения рН, концентрированные растворы мочевины или гуанидинхлорида.
Для регенерации используется система сопряженных реакций. В зависимости от типа сопряженной реакции можно выделить способы регенерации:
Использование сопряженных субстратов: в систему вводят избыточное количество сопряженного субстрата того же фермента. НАД+ можно регенерировать, добавив в систему в качестве сопряженного субстрата этанол. В присутствии этанола число циклов регенерации может достигать 800. Необходимость использования высоких концентраций сопряженного субстрата, так как равновесие реакции сильно сдвинуто в сторону образования продукта. Введение в систему дополнительных реагентов усложняет процедуру выделения основного продукта из реакционной смеси.
В систему, содержащую фермент 1, который катализирует реакцию получения основного продукта, дополнительно вводят фермент 2, функционирование которого обеспечивает регенерацию кофермента. Используемые в системе ферменты должны иметь разную субстратную специфичность, для того чтобы исключить возможность конкуренции.
В качестве реагентов используются дитионит натрия и некоторые соли пиридиния. Однако эти соли могут ингибировать отдельные ферменты. В последнее время для применяют ФМН. Флавиновые коферменты участвуют в процессах регенерации НАД+ in vivo.
Повышенные температуры, экстремальные значения pH, высокие концентрации органических р-лей или ПАВ, невозможность многократно использовать фермент, сложность при разделении фермента от продукта.
Добавление субстратов или их аналогов. Субстрат связывается с активным центром фермента. Фермент-субстратный комплекс более устойчив, чем свободный фермент. Лактатдегидрогеназа в присутствии лактата более термоустойчива. Растворители типа многоатомных спиртов стабилизируют некоторые ферменты за счет повышения устойчивости внутримолекулярных водородных связей белка. Химотрипсин в присутствии глицерина более устойчив к протеолизу. ɑ-Амилаза в присутсвии сорбитола термически более устойчива и устойчива при хранении. При низких концентрациях солей катионы Са2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+, Mo2+, Cu2+ могут специфично взаимодействовать с особыми ферментами – металлопротеинами. Некоторые из них катионов – кофакторы. Их присутствие стабилизирует фермент. Са2+ значительно повышает термическую устойчивость у ɑ-Амилазы. Химическая модификация фермента нужна для:
Для химической модификации ферментов часто используют глутаровый альдегид. Сохраняется активная конформация фермента в денатурирующих условиях и затрудняется доступ протеаз к белку. |