Зачёт. Стрра, свва, механизм действия биокатализаторов. Классификация и номенклатура. Сходство от синтетических
 Скачать 110.13 Kb.
|
|
Иммобилизация ферментов. Физ. и химические методы иммобилизации. Иммобилизованные ферменты – это препараты ферментов, молекулы которых связаны с носителем, сохраняя при этом полностью или частично свои каталитические свойства. Иммобилизация фермента позволяет: повысить устойчивость фермента (нагреванию, автолизу, действию агрессивных сред и т. д); многократно использовать фермент; прерывать реакцию в нужный момент; отделять фермент от реагентов и продуктов реакции. Химические способы иммобилизации ферментов основаны на образовании ковалентных связей между ферментом и носителем, а также на ковалентном сшивании молекул фермента между собой. Преимущества: высокая прочность конъюгата, можно повышать стабильность фермента. Физические методы основаны на использовании следующих подходов: 1) адсорбция фермента на носителе в результате электростатических, гидрофобных, вандерваальсовых взаимодействий – достигается путем контакта водного раствора фермента с носителем; 2) включение фермента в полупроницаемую капсулу; 3) включение фермента в гелевые структуры – фермент включается в трехмерную сетку полимерных цепей, образующих гель; 4) Включение в двухфазную систему (фермент растворим только в одной из фаз, а продукт – в другой; позволяет работать с высокомолекулярными субстратами). В качестве носителей могут применяться как органические, так и неорганические материалы. Органические носители: природные (полисахариды, белки, липиды) и синтетические полимерные носители. В качестве неорганических носителей используют матрицы на основе силикагеля, глины, керамики, природных минералов. Адсорбция фермента на нерастворимом носителе, преимущества: относительная простота методики; доступность носителей. Недостатки: недостаточная прочность связывания; многие носители биодеградируемы. При иммобилизации ферментов необходимо соблюдать следующие условия: 1. Активные группы матрицы не должны блокировать каталитический центр фермента. 2. Условия иммобилизации не должны приводить к потере активности фермента. Механическое включение фермента в гелевые структуры, необходимо учитывать: соответствие размера пор размеру фермента; природа матрицы (т.к. она создает микроокружение для фермента, может создавать рН отличное от рН раствора и повышать сродство субстрата к матрице, что повышает скорость ферментативной реакции). Весьма перспективным является использование в качестве биокатализаторов иммобилизованных клеток. Т.к. можно избежать дорогостоящие стадии выделения и очистки ферментов и необходимости их последующей стабилизации.
биотехнологии. Термозимы. Стр-ные и термодинамические основы функционирования термозимов при высоких температурах. Современные технологии молекулярной биологии и генной инженерии позволяет: 1) получать достаточные количества ферментов из экстремофилов для их последующего анализа и практического применения. 2) клонировать и достигать экспрессии этих ферментов в мезофильных организмах. Использование термостабильных ферментов (α-амилазы, глюкоамилазы и др.), выделенных из гипертермофилов, позволит: проводить процесс в одну стадию и при одних и тех же условиях (Крахмал используется для производства сахаров) отказаться от дорогостоящих ионообменников Сериновые щелочные протеиназы широко используются в качестве добавок к моющим средствам. Протеиназы из экстремофилов сохраняют нативность при высоких температурах, в присутствии высоких концентраций детергентов и других денатурирующих агентов. Pyrococcus, Thermococcus, Staphylothermus, Sulfolobus. Максимальную активность эти ферменты проявляют при температурах от 90 до 110 °С и значениях рН от 2 до 10. Термостабильные ДНК-полимеразы используются в ПЦР и играют важную роль в генной инженерии. Термозимы стабильны в условиях высокой температуры, высоких концентраций солей и экстремальных значений рН (Archaea и Bacteria). Термостабильные ферменты содержат больше изолейцина и меньше глицина. Возросшая термостабильность коррелирует с увеличением жесткости белковой структуры за счет уменьшения содержания остатков глицина, увеличением количества спрятанных, гидрофобных остатков, более компактной структурой белка благодаря уменьшению отношения площади поверхности к объему, уменьшением полостей (впадин, выемок), оптимизация распределения зарядов за счет устранения отталкивающих взаимодействий; увеличение количества ионных пар; организации взаимодействий между зарядами в своеобразную сеть, минимизация отношения поверхность/объем.
Достаточно сложно воссоздать естественное окружение фермента в технологическом реакторе. Ферменты в живой клетке или адсорбированы на биологических мембранах, или встроены во внутреннюю часть мембраны, или же локализованы внутри замкнутых мембранных образований. Поэтому многие ферментативные р-ии в живой клетке протекают на поверхности раздела фаз. Среда, в которой функционируют ферменты in vivo, по своим физико-химическим параметрам (диэлектрическая проницаемость, полярность, вязкость) существенно отличается от используемого in vitro водного р-ра. Также, свойства самой воды вблизи поверхности раздела фаз значительно отличаются от воды “объемной”. Прим., такая вода более реакционноспособна при гидролизе. Т.е. использование чисто водных растворов в биокатализе создает доп. проблемы, прим., связанные с плохой растворимостью субстратов или продуктов реакции. Эти ограничения можно преодолеть при проведении ферментативной р-ии в системе, в состав которой помимо воды входит органический растворитель. Присутствие в среде органического р-ля влияет на процесс образования фермент-субстратного комплекса за счет изменения растворимости субстрата и его распределения в системе. В водно-органических смесях гидрофильные субстраты концентрируются у поверхности фермента, а гидрофобные локализуются в объеме р-ля. Органические р-ли могут влиять на эффективность контакта субстрата с ферментом. При небольших концентрациях полярных растворителей активность Е сохраняется. При дальнейшем повышении концентрации Е полностью или практически полностью теряют каталитическую активность. Причины, приводящие к потере активности ферментов в водно-органических смесях: обратимую денатурацию и необратимую инактивацию биокатализатора. В основе механизма денатурации лежит: разрушение системы водородных связей и нативных гидрофобных взаимодействий; гидрофобные остатки из внутр. области “выходят” на поверхность белка; агрегации молекул денатурированного белка. Увеличение содержания в водно-органических смесях неводного компонента приводит к сдвигу равновесия обратимых реакций гидролиза-синтеза в сторону синтеза.
Гетерогенные биокаталитические системы характеризуются наличием поверхности раздела между молекулами биокатализатора и органическим растворителем, в объеме которого локализуется субстрат. Макрогетерогенные системы. Е сохраняют высокую селективность, стерео- и энантиоспецифичность. по сравнению с водными растворами. Активности суспендированных Е на несколько порядков ниже. На эффективность влияют содержание воды в системе, органического растворителя, способ получения системы. Суспензии биокатализаторов в неполярных и полярных органических растворителях. При полном отсутствии воды в с-ме биокатализатор практически не проявляет каталитической активности. Повышение содержания воды в с-ме приводит к восстановлению ферментативной активности благодаря гидратации фермента и увеличению подвижности групп активного центра. Дальнейший рост концентрации воды снижает каталитическую активность биокатализатора (еще большее увеличение подвижности молекул биокатализатора из-за чего органический р-ль может проникать во внутренние области белка, нарушая каталитически активную конформацию). Эффективность биокатализа зависит также от природы органического р-ля. Полагают, что из-за высокого сродства к белкам полярные растворители в большей степени снижают субстратную специфичность суспендированных ферментов и оказывают на них наиболее сильное инактивирующее действие. Третий фактор – способ получения системы, сначала в органическом растворителе суспендируют лиофилизованный из водного раствора ферментный препарат. Затем в систему добавляют необходимое количество воды. Суспендированные в органических растворителях ферменты характеризуются исключительно высокой термостабильностью. Это объясняется повышением “жесткости” белковой молекулы в неводных средах, т.к. происходит компактизация белковой глобулы. Системы типа жидкость–жидкость. Микроокружение ферментов в подобных системах лишь незначительно отличается от такового в водных растворах, так как биокатализатор благодаря локализации в водной фазе прямо не контактирует с органическим растворителем. Двухфазная система вода–органический р-ль, не смешивающийся с водой (хлороформ, эфир, жирные алифатические спирты, углеводороды) позволяет целенаправленно сдвигать равновесие реакции. Это достигается за счет удаления конечных продуктов из реакционной среды. Фермент локализован в водной фазе с-мы. Растворенные в органической фазе субстраты способны свободно диффундировать из нее в воду, где они подвергаются химическим превращениям под влиянием фермента. Образовавшиеся продукты могут, в свою очередь, диффундировать обратно в органическую фазу. Поскольку продукты выводятся из сферы р-ии, равновесие последней смещается в сторону их образования. В силу недостаточно развитой поверхности раздела фаз скорость ферментативного процесса в системах типа жидкость–жидкость часто лимитируется скоростью массопереноса. При интенсивном перемешивании система, состоящая из двух макрофаз, переходит в эмульсию. За счет этого можно добиться ускорения реакции. Однако при этом существенно возрастает вероятность контакта фермента с поверхностью раздела и его инактивации поверхностным натяжением на границе раздела фаз. Уровень инактивации фермента в двухфазных системах жидкость–жидкость можно снизить при переходе от макроэмульсий к микроэмульсиям, в которых поверхность раздела стабилизирована (ПАВ). Микрогетерогенные системы(мицеллярные (микроэмульсионные) системы) – гидратированные обращенные мицеллы ПАВ в неполярных органических растворителях. Внутренняя поверхность ассоциатов ПАВ образована полярными (ионными) головами ПАВ, а внешний слой – углеводородными хвостами этих соединений. Обращенные мицеллы в своем ядре содержат некоторое количество гидратационной воды, благодаря которой обеспечивается микросреда для функционирования фермента. Двойственная природа обращенных мицелл создает уникальную возможность формирования оптимального с точки зрения термодинамики микроокружения белка: молекулы гидрофильных белков могут локализоваться в водном ядре гидратированной обращенной мицеллы, избегая непосредственного контакта как с органическим растворителем, так и с полярной поверхностью внутренней полости мицеллы. Иногда в результате включения фермента в мицеллы его свойства заметно изменяются. В частности, это может приводить к активации ф- та. Применяют для ферментативного превращения водонерастворимых соединений (ферментативное окисление спиртов, расщепления жиров и при синтезе стероидов).
Ферменты используются для обнаружения и количественного определения различных веществ: металлов (Ag, Cu, Hg, Zn и т. д), органических и неорганических соединений, мутагенов, канцерогенов, метаболитов. Детекции количеств, недоступных определению с помощью большинства физико-химических методов. Специфичность по отношению к S(определение S в многокомпонентной смеси, без ее предварительного разделения на составляющие). Высокая каталитическая активность (катализируют реакции химического превращения субстрата даже при его низких концентрациях, можно определять микроколичества вещества). Ферментативный микроанализ простой и быстрый (не надо разделять смеси или концентрировать анализируемый образец, высокая скорость биокатализа). Многообразие веществ, которые определяются (либо субстраты, либо его эффекторы). Вещество (А) определяют по скорости реакции его превращения в конечный продукт (Р). А→P Начальная скорость этой реакции ϑ0 пропорциональна концентрации исходного вещества [А]. ϑ0=κ[А], где κ–константа скорости реакции. Чем выше концентрация вещества [А], тем больше ϑ0 Концентрацию вещества А определяют с помощью предварительно построенного калибровочного графика, отражающего зависимость ϑ0 от [А]. Другие варианты кинетического метода: ферментативную р-ю останавливают через определенное время. Зная концентрацию А и измерив концентрацию образовавшегося продукта Р, можно построить калибровочный график, описывающий зависимость [Р] от [А]. Пределы обнаружения анализируемых соединений определяются не только каталитической активностью фермента, но и другими кинетическими параметрами индикаторной реакции. E + S ↔ES →P + E где Е – фермент, S – субстрат, ES – фермент-субстратный комплекс, Р –продукт. При [E] << [S]0 начальная стационарная скорость такого рода реакции описывается уравнением Михаэлиса–Ментен. Согласно уравнению Михаэлиса–Ментен, концентрация субстрата [S]0 будет пропорциональна v0 только при условии, когда [S]0 << Km. Верхняя граница определения [S] ограничена величиной Km. Нижняя граница зависит от чувствительности метода регистрации. (см.лекию 6). Необратимое ингибирование – тип ингибирования, при котором ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональных групп фермента. Обратимое ингибировани: конкурентное и неконкурентное. Использование сопряженных ферментативных систем значительно увеличивает чувствительность микроанализа. В живой клетке многие ферментативные процессы тесно взаимосвязаны между собой, т. е. продукт одной реакции является субстратом другой. В том случае, когда достаточно сложно по какой-либо причине обнаружить продукт какой-нибудь ферментативной реакции, можно подобрать второй фермент, превращающий продукт этой реакции в легко детектируемое вещество. Благодаря сопряженным системам существенно расширяется круг определяемых веществ и в ряде случаев повышается чувствительность анализа (измерение содержания сахарозы).
При определении веществ, являющихся эффекторами фермента, учитываются другие кинетические закономерности. Верхняя граница детектируемых концентраций обратимых ингибиторов определяется величиной ki. Взаимодействие с ферментом обратимых неконкурентных ингибиторов можно описать в виде следующей схемы: E + I →EI где I – ингибитор, ki = [EI]/([E][I]). Необратимое ингбирование наблюдается в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр (прим. ионы тяжелых металлов (ртути, серебра, мышьяка), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра). Для необратимых ингибиторов: E + nI → Ei Уменьшение активности фермента Δ[E] будет пропорционально концентрации ингибитора: Δ[E] = n[I], где n – число молекул ингибитора, взаимодействующих с одной молекулой фермента.
Основой ферментных электродов являются электрохимические датчики (электроды), которые в соответствии с принципом их действия можно разделить на амперометрические и потенциометрические. К амперометрическим датчикам относятся платиновые, золотые, угольные электроды. Наибольшую известность среди них получил кислородный электрод Кларка. Этот электрод состоит из платинового катода, серебряного анода, электролита и газопроницаемой полимерной мембраны. Для создания ферментного электрода датчик и фермент объединяют в единую конструкцию. В простейшем случае растворимый фермент или фермент, иммобилизованный на растворимом носителе, помещают в приэлектродный слой, который отделен от остального пространства полупроницаемой мембраной. Однако чаще всего фермент иммобилизуют непосредственно на поверхности электрода или к поверхности электрода прикрепляется пленка (мембрана целлюлозная, поликарбонатная) с иммобилизованным ферментом. Работа ферментного электрода: молекулы субстрата диффундируют из раствора пробы в реакционный слой, где подвергаются химическим превращениям под воздействием фермента. Образуется или расходуется вещество, к которому селективно чувствителен электрохимический датчик (электрод). Изменение его конц-ии обнаруживается в виде изменения потенциала или тока. Диффузионный перенос субстрата из объема раствора в реакционный слой способствует выравниванию локального градиента концентрации. Устанавливается стационарное состояние, при котором скорость ферментативной реакции равна скорости диффузии, а сигнал электрохимического датчика становится постоянным и пропорциональным скорости реакции. Повышение концентрации субстрата может вызывать изм-е сигнала. Если электрод чувствителен к продукту реакции – сигнал будет увеличиваться. Сигнал будет уменьшаться, если датчик реагирует на субстрат. При определении концентрации вещества амперометрическим способом регистрируется ток, проходящий через ячейку, где находятся электрод с ферментом и электрод сравнения, на которые накладывается заданное электрическое напряжение. Между током i и концентрацией определяемого компонента Cx существует определенное соотношение: Сx = f(i) Ф-т в режиме амперометрического биосенсора ускоряет процесс обмена e- между субстратом и электродом, т. е. проявляет электрокаталитическую активность: Перенос электронов с помощью медиатора – диффузионно-подвижного промежуточного низкомолекулярного переносчика электронов, к-рый выбирается из числа специфических субстратов фермента, проявляющих электрохимическую активность на электроде: S +E → P + E0 E0 + M → E + M0 Электрод : M0 → M+ – e- где E, E0 – окисленная и восстановленная формы активного центра фермента; M, M0 – окисленная и восстановленная формы медиатора Прямой электрокаталитический перенос электронов между электродом и активным центром фермента: Пример : лакказа (Cu-содержащая оксидаза),сорбированная на электроде. |