Зачёт. Стрра, свва, механизм действия биокатализаторов. Классификация и номенклатура. Сходство от синтетических
 Скачать 110.13 Kb.
|
|
O2 + 4e- + 4H+ → 2H2O Перенос электронов между активным центром фермента и доменами в полупроводнике при включении ферментов в органические полупроводники. Амперометрические ферментные электроды применяют в медицине, в микробиологической и пищевой промышленности для опр-я концентрации глюкозы. Принцип действия ферментного электрода для измерения концентрации глю амперометрическим методом: Платиновый катод отделен от окружающей среды двухслойным покрытием. Первый слой представляет собой мембрану с иммобилизованной глюкозооксидазой. Второй слой сформирован тефлоновой мембраной, проницаемой для кислорода (O2 свободно диффундирует через эту мембрану и восстанавливается на катоде): О2 + 2Н2О + 4е– → 4ОН-. Восстановление каждой молекулы кислорода сопровождается переносом 4 электронов. Ток, протекающий через измерительную ячейку, пропорционален концентрации О2. Если поместить электрод в раствор глюкозы, на мембране, содержащей глюкозооксидазу: глюкоза + О2+Н2О → глюконовая кислота + Н2О2 В результате окисления глюкозы содержание кислорода в среде будет снижаться, что приведет к уменьшению стационарного тока. К характеристикам ферментных электродов относят время отклика на изменение концентрации субстрата и стабильность. На время отклика (установление стационарного значения потенциала ферментного электрода) оказывают влияние следующие факторы: • скорость перемешивания раствора (чем больше скорость, тем меньше время отклика); • концентрация субстрата (рост концентрации приводит к уменьшению времени отклика); • толщина ферментного слоя (чем толще слой, тем больше время отклика); • наличие полупроницаемой защитной мембраны (ее присутствие увеличивает время отклика); • условия проведения ферментативной реакции (температурный режим, рН). Стабильность ферментного электрода зависит в первую очередь от способности иммобилизованного фермента сохранять свою активность и определяется следующими факторами: • способом иммобилизации фермента; • концентрацией фермента в реакционном слое; • толщиной ферментного слоя; • условиями проведения ферментативной реакции (температурный режим, рН).
Для потенциометрических измерений используются различные ионоселективные электроды, среди которых наиболее известен стеклянный электрод для измерения рН. Стеклянный электрод можно использовать для получения газового мембранного электрода. Потенциометрические электроды устроены аналогично амперометрическим. Единственное отличие состоит в том, что в них с реакционным слоем контактирует ионоселективный электрод, а не электрод из благородного металла. В амперометрических ферментных электродах применяют ферменты, относящиеся к классу оксидаз и катализирующие окисление различных субстратов кислородом. В потенциометрич. оксидазы или декарбоксилазы аминокислот, уреаза, нитрит- и нитратредуктазы. Амперометрических по сравнению с потенциометрическими электродами: + более высокая чувствительность - высокий потенциал (500–900 мВ), при котором происходит детекция, что приводит к помехам определения из-за наличия других электроактивных веществ - у кислородоселективного электрода к неточностям определения могут также привести колебания в концентрации кислорода в исследуемых образцах. В измерительной ячейке, где находятся ионоселективный электрод с ферментом и электрод сравнения, возникает разность потенциалов, которая зависит от активности потенциалопределяющих ионов в растворе: E = E0+(2,3RT/nF)lga (уравнение Нернста), где E – разность потенциалов между ионоселективным электродом и электродом сравнения, мВ; E0 – константа, зависящая в основном от свойств электрода сравнения; n – заряд иона с учетом его знака; F – постоянная Фарадея; T – температура, К; a – активность соответствующего иона. Активность – эффективная концентрация свободных ионов в р-ре. Активность и концентрация связаны соотношением: а = γС, где а – активность, С – концентрация, γ – коэффициент активности. Для очень разбавленных растворов активность ионов почти равна их концентрации.
Стабильность ферментных электродов колеблется в достаточно большом диапазоне – от нескольких дней до нескольких месяцев. Однако в процессе эксплуатации ферментного электрода его операционные характеристики постепенно изменяются. Это затрудняет стандартизацию измерений и препятствует широкому внедрению ферментных электродов в клиническую и аналитическую практику. Методы (хроматографические, спектрофотометрические и др.), использующиеся в клинической практике: длительные, сложные, непригодны для быстрого анализа большого числа образцов, дорогостоящие, т.к. ферменты используются один раз и много различных реагентов, ферментные электроды решают эти проблемы. Применение ферментных электродов в клинической практике позволяет существенно сократить расход реактивов при проведении измерений и значительно упрощает схему анализа. Наряду с явными преимуществами: • простая методика, не требующая значительных временных затрат; • возможность поточного анализа; • высокая селективность; • небольшое количество ферментов, необходимых для проведения анализа, и возможность их многократного использования; • простая методика подготовки пробы; ферментные электроды имеют некоторые недостатки: • относ. большое время отклика, связанное с временем, необходимым для осуществления диффузии субстрата; • необходимость частой градуировки электрода в связи с зависимостью чувствительности от скорости потока и влияния посторонних хим. веществ, например неорганических ионов на электродную функцию электрода. Ферментные электроды используются: выявления тех или иных метаболитов; анализа ферментов сыворотки крови (глутаматпируваттрансаминаза).
К кислород-проницаемой тефлоновой пленке кислородного электрода Кларка плотно прилегает мембрана не с иммобилизованным ферментом, а с иммобилизованными антителами к анализируемому антигену. В раствор, содержащий анализируемый антиген, добавляют определенное количество антигенов, предварительно меченных каталазой. Иммуноферментный электрод погружают в исследуемый раствор и выдерживают при нужной температуре в течение необходимого времени. Меченые и немеченые антигены, конкурируя между собой, связываются с антителами на поверхности электрода. Удаляют свободные антигены, путем промывки иммуноферментного электрода. Добавляют в исследуемый раствор пероксид водорода. По сигналу электрода определяют скорость образования кислорода в результате катализируемой каталазой реакции: H2O2 → H2O + 1/2O2 Строят кривую зависимости сигнала от числа немеченых антигенов. Для анализа метаболитов и ферментов используются аналитические проточные реакторы с иммобилизованными ферментами. Действие колоночного реактора, предложенного для определения триптофана: колонка набивается сефарозой с соиммобилизованными на ней двумя ферментами: триптофаназой и лактатдегидрогеназой. В анализируемую смесь добавляют два кофактора: пиридок- сальфосфат и НАДН2 и пропускают ее через колонку. Убыль НАДН2 оценивали спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность при 360 нм выходящего из колонки анализируемого раствора. Для анализа метаболитов в колоночных ферментных реакторах может быть использован микрокалориметрический датчик. Система состоит из двух идентичных колонок, заполненных носителем с иммобилизованным на нем ферментом. В нижней части каждой из колонок имеется термистор. При пропускании через колонки простого буфера разность температур между термисторами будет равна нулю. При введении в одну из колонок субстрата в результате ферментативной реакции произойдет тепловыделение. Разность температур между измерительной колонкой и колонкой сравнения будет пропорциональна количеству превращенного субстрата.
Энзимопатология, энзимодиагностика, энзимотерапия Ферменты можно эффективно использовать для коррекции различного рода метаболических нарушений в организме. Применения ферментов в качестве медикаментозных средств: 1. Заместительная терапия ряда наследственных заболеваний и функциональной недостаточности пищеварительных желез. Применение пищеварительных ферментов для компенсации врожденной или приобретенной недостаточности некоторых органов, например поджелудочной железы. Недостаток собственных ферментов компенсируют путем употребления специальных препаратов, содержащих смесь различных ферментов – пепсина (гидролаза пептидных связей), трипсина (сериновая протеиназа), химотрипсина, липазы и α-амилазы 2. Тромболитическая терапия (для лизиса тромбов в кровеносных сосудах). Стрептокиназа – фермент, который способствует активации плазминогена (является естественным предшественником протеиназы плазмина, предотвращающей образование тромба в кровеносной с-ме). Многие осложнения, связанные с применением стрептокиназы, были сняты благодаря внедрению иммобилизованной стрептокиназы, т.к. она: более стабильна, не искажает общую формулу крови, не токсична, более безопасная с точки зрения иммуногенности. Для разрушения тромбов можно использовать урокиназу, превращающую плазминоген в плазмин. Фибринолизин- гидролизует фибрин (основной белка, образующегося при свертывании крови). 3. Терапия воспалительных процессов. Протеазы гидролизуют денатурированные белки в омертвевших тканях и не затрагивают нативные внутриклеточные белки, менее чувствительные к действию протеаз благодаря компактной третичной структуре. Это различие положено в основу использования растворов протеаз для лечения осложненных ран и гнойно-некротических процессов. 4. Лечение онкологических заболеваний. Для некоторых опухолей и лейкемических клеток аспарагин -незаменимая аминокислота. Аспарагиназа, введенная в область опухолевых клеток, разрушает аспарагин и вызывает этим торможение их роста и последующую гибель. На нормальные клетки аспарагиназа существенного влияния не оказывает, так как они способны синтезировать аспарагин 5. Терапия вирусных заболеваний. Вирусные НК в период интенсивной репликации, транскрипции и трансляции по сравнению с нуклеопротеидными комплексами инфицированной клетки в меньшей степени защищены от действия нуклеаз. Нуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота используют для лечения вирусных заболеваний. Для лечения клещевого энцефалита применяют панкреатическую РНКазу. Панкреатическая ДНКаза – при герпесных и аденовирусных инфекциях 6. Использование ферментов в качестве локальных литических средств для расщепления и удаления из организма некротических масс и экссудатов. Протеолитические Е расщепляют некротизированную ткань и фибринозные образования, разжижают вязкие секреты, экссудаты (жидкость, накапливающаяся при воспалениях в тканях и полостях тела). Трипсин (из поджелудочной железы крупного рогатого скота) облегчает удаление вязких секретов и экссудатов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей (трахеитах, бронхитах, пневмонии и т. д. Применяется в виде аэрозоля для ингаляции или в иммобилизованном виде. 7. Использование ферментов для улучшения биодоступности лекарственных препаратов. Гиалуронидаза катализирует распад гиалуроновой к-ты до глюкозамина и глюкуроновой кислоты. В результате этого увеличивается проницаемость тканей. Препараты, содержащие гиалуронидазу (лидазу и ронидазу), получают из семенников крупного рогатого скота. 8. Специфическая модуляция активности ферментов, участвующих в патогенезе заболеваний, а также обеспечивающих детоксикацию ксенобиотиков. Недостатки применения ферментов: высокая иммуногенность, невысокая стабильность, низкий терапевтический индекс, кратковременность действия. Недостатки можно устранить с помощью специфической модификации ферментов:
Полиэлектролиты. Активность панкреатической РНКазы по отношению к вирусу стоматита в комплексе с сульфированными декстранами возрастала на несколько порядков. Ковалентная модификация с полисахаридами или полиэтиленгликолем часто приводит к снижению иммуногенности препарата, из-за снижения количества антигенных детерминант модифицированного белка. 3. Вторичная модификация В качестве вторичных модификаторов в некоторых случаях выступают антитела. Террилитин (протеолитический фермент), связанный через полимерную цепочку с антителами к фибрину, более специфичен при лизисе тромбов. Специфическая модуляция активности ферментов, детоксикация ксенобиотиков. Первая стадия (Цитохромы Р-450) биотрансформации ксенобиотиков микросомальная монооксигеназная система (может приводить к образованию как более, так и менее токсичных по сравнению с исходным соединением метаболитов). Вторая стадия обеспечивается ферментативными системами, ведущими различного рода реакции конъюгации и в большинстве случаев заканчивается полным обезвреживанием ксенобиотика и его реакционноспособных метаболитов. Индукция цитохромов Р-450 флавоноидами Механизмы:
-Часто продукты микросомального окисления ксенобиотика представляют большую опасность для клетки по сравнению с исходным соединением. -ускорение процессов микросомального окисления ксенобиотика сопровождается усилением генерации АФК (активных форм кислорода) и последующей инициацией процессов ПОЛ. Часто используют соединения подавляющие активность микросомальных монооксигеназ. Ингибирование цитохромов Р-450 флавоноидами Ингибирование генной экспрессии семейства CYP1 посредством блокирования AhR рецептора в ряде случаев определяет антиканцерогенную активность отдельных флавоноидов (пр. кверцетин). Связывания флавоноида с NADPH – цитохром Р-450 редуктазой или с цитохромом Р-450; Конкуренции с другими субстратами Модификации мест их связывания Изменение липидного микроокружени, вследствие чего затрудняется перенос электронов к цитохрому. Эффекторное действие флавоноидов во многом определяется: особенностями структуры их пропанового фрагмента, наличием различных радикалов в ароматической части молекулы, степенью гликозилирования, местом присоединения углеводных остатков и их природой, конфигурацией гликозидных связей характером сочленения гликозидной части с агликоном (О-гликозиды, С-гликозиды). Лучше действовать на вторую стадию биотрансформации ксенобиотиков. Действие на глутатион S-трансферазы(ГТ),которые конъюгируют ксенобиотики и их реакционноспособные метаболиты с глутатионом, восстанавливают органические гидропероксиды, участвуют в метаболизме конечных цитотоксичных продуктов ПОЛ обеспечивают связывание и внутриклеточный транспорт ряда эндогенных лигандов (билирубина, желчных кислот, жирных кислот, производных гема, нейромедиаторов и стероидных гормонов). Глутатион S-трансфераза 3 класса: альфа, мю и пи. У млекопитающих ГТ присутствуют практически во всех типах клеток. Изоферментный состав ГТ варьирует в зависимости от их локализации, что определяет разную устойчивость органов и тканей к окислительному стрессу,к действию ксенобиотиков и эндотоксинов. В растительной пище много химических соединений, выступающих в качестве индукторов ГТ, что приводит к снижению частоты раковых заболеваний. Флаваноны и флавоны увеличивают не только активность ГТ, но и активность других ферментов второй стадии биотрансформации ксенобиотиков (УДФ-глюкуронозилтрансфераз). При различных хронических и острых заболеваниях печени, сопровождающихся эндогенной интоксикацией организма, нормальное функционирование ГТ может нарушаться. Для профилактики цитотоксического действия ксенобиотиков при заболеваниях, сопровождающихся эндогенной интоксикацией организма используют эффекторные свойства флавоноидов. Введение экспериментальным животным растительных экстрактов из семян расторопши, лофанта, душицы и горца с повышенным содержанием флавоноидов ↓ снижает тяжесть патобиохимических проявлений холестаза, благодаря способности флавоноидов индуцировать ГТ печени. Глутатион S-трансферазы способны эффективно связывать билирубин и желчные кислоты, которые в избыточных количествах накапливаются в печени при холестазе. Билирубин и желчные кислоты благодаря своей гидрофобной природе активно взаимодействуют с мембранами и белками, вызывая различного рода повреждения.
Использующиеся в биотехнологических целях ферменты получают из различных природных источников. Степень чистоты получаемых ферментных препаратов во многом определяется областью их применения. Например, глюкозооксидаза, использующаяся в производстве яичного порошка, не должна содержать примесей протеолитических ферментов. Препараты протеаз, вводимые внутримышечно домашнему скоту перед забоем для мягчения мяса, должны быть лишены соединений, вызывающих какую-либо сильную физиологическую р-ю. Относительно чистые ф-ты применяются в процессах, св. с производством и обработкой пищевых продуктов. Протеиназы: Реннин (химозин) – используется при производстве сыра.Получают: желудок телят.Действует: отщепляет гликопептид от растворимого казеината кальция → малорастворимый параказеинат кальция (осаждается в виде творожного сгустка). Без фермента процесс створаживания молока 16 часов – с ферментом 15–30 минут. Протеиназы используются для ускорения созревания сыра. В ходе созревания микроорганизмы и ферменты гидролизуют жиры и белки молодого сыра, образуются вещества, придающие сыру характерный вкус. Использование нейтразы (протеиназы из Bacillus subtilis) сокращает время созревания сыра с 20 до 6 месяцев. Применяются в мясной промышленности: вызывают частичную деградацию белков и ускоряется созревание мяса. Мясо становится более мягким и нежным, его вкус, аромат и сочность улучшаются. Говядина считается созревшей через 10–14 дней выдержки, с ферментами созревает 1–2 суток. Для мягчения уже разделанных мясных туш используются относительно недорогие растительные протеазы – папаин и бромелайн. Протеазы могут вводить домашнему скоту внутримышечно перед забоем. Иногда ферменты наносят на полимерные пленки, в которые мясной продукт упаковывается. для обесклеивания шелка (протосубтилин) и высвобождения шелковых волокон, состоящих из фиброина. Коагулировавший белок удерживает другие компоненты грязи, например липиды и углеводороды, и удаляется с трудом. После нескольких стирок ткань приобретает серый оттенок и неприглядный внешний вид. Проблема сравнительно легко решается путем добавления в детергенты протеиназ, которые позволяют эффективно удалять загрязнения белковой природы. Оксидазы: глюкозооксидаза используется для деструкции глюкозы или в связывании кислорода. глюкоза + О2+Н2О → глюконовая кислота + Н2О2 Применяется в производстве и при хранении безалкогольных напитков на основе апельсинового сока, консервированных напитков, сухих пищевых продуктов, майонеза, соусов для салатов и расфасованного сыра (в присутствии кислорода образуются продукты окисления, имеющие неприятный запах). Используется для продления срока годности расфасованных пищевых продуктов: в упаковку с сыром добавляют глюкозооксидазу и глюкозу. Связывают О2, проникающий через упаковочные материалы с образованием Н2О2, который обладает бактерицидными свойствами. Глюкоза, содержащаяся в мясе, ускоряет его порчу. Иногда животным непосредственно перед забоем вводят внутривенно препарат глюкозооксидазы. Обработка овощей и фруктов замедляет окисление аскорбиновой кислотой. Амилазы: α-амилаза, β-амилаза, глюкоамилаза и α-1,6-глюкозидаза. крахмал используется для получения сахаров. Гидролиз крахмала в промышленном масштабе осуществляется разными способами: только кислотой, кислотой и ферментами и только ферментами. Использование ферментов позволяет контролировать глубину гидролиза крахмала и дает возможность получать конечную продукцию с желаемыми свойствами: вязкостью, сладостью, осмотическим давлением и устойчивостью к кристаллизации. для удаления клея из тканей α-амилаза: неупорядоченный разрыв любых α-1,4-гликозидных связей в амилозе и амилопектине с образованием олигосахаридов разной длины цепи: вязкость растворов крахмала снижается. В настоящее время используются термостабильные α-амилазы (работать при температурах, близких к 100 °С). Бумажная промышленность: снижение вязкости р-ры крахмала(бумага с регулируемой массой). Текстильная пром. Шлихтование и расшлихтовка. β-амилазыразрывают α-1,4-гликозидные связи только на невосстанавливающих концевых участках полимерной цепи. Образуется смесь мальтозы и декстринов. В результате образуются растворимые декстрины и олигосахариды и обеспечивается удаление крахмалосодержащих загрязнений. Расшлихтовка (удаляет шлихт из тканевого материала), это обеспечивает равномерность окрашивания и необх.стр-ру ткани. Глюкоамилазы - гидролиз невосстанавливающих концевых α-1,4-гликозидных связей крахмала, декстринов и мальтозы. применяются в производстве концентрированного сиропа (90–97% D-глюкозы) и получают кристаллическую глюкозу или концентрированные фруктозные сиропы. α-1,6-глюкозидазы Пектиназа: осветление соков, удаление пектина, концентрирование кофе (Aspergillus oryzae, A. niger, A. flavus). Виноделие. Добавление этих ферментов к раздавленному винограду приводит к повышению выхода сока, способствует более эффективному экстрагированию красящих веществ из кожуры и облегчает процессы фильтрования и отжимки. Пектолитические ферменты микроорганизмов применяются для переработки льносоломы. Для получения льноволокна на льнозаводах осуществляют тепловую мочку льна, во время которой пектиновые вещества льносолом разрушаются и высвобождаются льноволокна. Липаза: катализируют гидролиз и синтез эфиров, сост. из глицерина и длинноцепочечных жирных кислот. Источник поджелудочная железа, плесень (Rhizopus) способствующее пищеварению средство; улучшает вкусовые качества молочных продуктов. Липазы нашли широкое применение в биотехнологии: стабильны в органических растворителях. не требуют кофакторов, обладают широкой субстратной специфичностью. проявляют высокую энантиоселективность. Моющие средства. Обработка мяса липазными препаратами вызывает частичный гидролиз жиров ----нежирные мясные продукты. Для очистки водостоков от нерастворимых веществ - используют смеси протеаз, карбогидраз и липаз. Для обезжиривания шелкового волокна. β-галактозидаза (лактаза)Для иммобилизованной лактазы характерна стабильность – после 50 суток работы фермент сохраняет около 80 % своей первоначальной активности. Расщепляет лактозу. В присутствии лактозы происходит кристаллизация мороженого и другихмолочных продуктов и они приобретают неприятный вкус. После ферментативной обработки молоко приобретает новые диетические качества и может быть включено в пищевой рацион людей, организм которых неспособен синтезировать лактазу. Единственное средство для лечения лактазной недостаточности |