Технология_получения_гамма-глобулинов-17_04_2014. Технология получения гаммаглобулинов
 Скачать 78.53 Kb.
|
Технология получения гамма-глобулиновот marun310 | skachatreferat.ruСОДЕРЖАНИЕ |Определения |3 | |Обозначения и сокращения |4 | |Введение |5 | |1. Основная часть |6 | |1.1 История применения препаратов гамма-глобулина |- | |1.2 Характеристика препарата гамма-глобулина |- | |1.3 Выделение гамма-глобулина |7 | |1.4 Способ получения гамма-глобулина из плаценты |9 | |1.5 Способ получения гамма-глобулинов путем спиртового метода Кона | | |1.6 Способ получения гамма-глобулина для лечения эпизоотического лимфангоита лошадей |12 | | | | | |16 | |Заключение |21 | |Список литературы |22 | || | ОПРЕДЕЛЕНИЯ В данной курсовой работе используются следующие определения: Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) – особый класс гликопротеинов, присутствующих на поверхности B-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и в сыворотке крови и тканевой жидкости в виде растворимых молекул, и обладающих способностью очень избирательно связываться с конкретными видами молекул, которые в связи с этим называют антигенами. Гамма-глобулин – фракция сывороточных белков – глобулинов (иммуноглобулинов) крови, содержащая иммунные антитела. Сыворотка иммунная, антисыворотка (antiserum, множ. antisera) – сыворотка, содержащая в своем составе антитела против определенных антигенов. Альфа глобулины – фракция белков сыворотки крови в состав которой входят гликопротеиды и липопротеиды. Гликопротеиды – это белки, связанные с производными углеводов, в крови они участвуют в транспорте различных веществ, свертывании крови и иммунитете. Липопротеи́ны (липопротеиды) – класс сложных белков, простетическая группа которых представлена каким-либо липидом. Бета-глобулины – фракция глобулинов сыворотки крови, состоящая из гликопротеидов, липопротеидов и металлопротеидов (трансферрин, церулоплазмин), обладающая средней между фракциями альфа- и гаммаглобулинов электрофоретической подвижностью Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Антиген (англ. antigen от antibody-generating – «производитель антител») – это любая молекула, которая специфично связывается с антителом. ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ В данной курсовой работе используются следующие обозначения и сокращения: |ПЭГ |- |полиэтиленгликоль| |Мес. |- |месяц | |oC |- |градусы Цельсия | |% |- |проценты | |Об/мин |- |оборотов в минуту | |Мл |- |миллилитры | |Кг |- |килограммы | |ИФА |- |иммуноферментный анализ | Млн/мл - миллион на миллилитр ЭЛЛ - эпизоотический лимфангоит лошадей ВВЕДЕНИЕ Гамма-глобулины, глобулярные белки сыворотки крови позвоночных животных и человека, являющиеся носителями основной массы антител. По сравнению с другими белковыми фракциями сыворотки крови (альбумины и глобулины) гамма-глобулины обладают наименьшей электрофоретической подвижностью [1]. Гамма-глобулины представляют собой группу белков с близкими физико-химическими свойствами, в состав которых входят также углеводы. В то же время гамма-глобулины неоднородны по молекулярной массе и химическому составу. Методом электрофореза установлено, что содержание гамма-глобулинов в сыворотке крови составляет (в % к общему количеству сывороточных белков): у лошади 18-26; крупного рогатого скота 14-35; овцы 15-30; свиньи 12-30; собаки 10- 25; кролика 8-20; курицы 16-30; крысы 6-15; мыши 10-15; карповых рыб 2-10. Содержание гамма-глобулинов зависиттакже от возраста, пола, породы, физиологического состояния животного и других факторов. Новорождённые телята не содержат в крови гамма-глобулины, они получают их с первой порцией молозива матерей. Количество гамма-глобулинов в крови увеличивается при патологических процессах. Накопление гамма-глобулинов происходит также после иммунизации животных [2]. Для получения гамма-глобулинов применяют спиртовой, солевой, риваноловый, эфирно-спиртовой методы, а также осаждение их солями тяжёлых металлов и выделение при помощи ионообменных смол и др. Гамма-глобулины получают из донорской или плацентарной крови, а специфические гамма-глобулины выделяют из сывороток животных, иммунизированных соответствующими антигенами. В настоящее время гамма-глобулины используют для профилактики и лечения инфекционных болезней животных: сибирской язвы, чумы и рожи свиней, болезни Ауески и ящура, а также желудочно-кишечных болезней телят и поросят и др. [8]. Клиническое применение гамма-глобулина. Гамма-глобулин используется для профилактики и лечения инфекционных заболеваний преимущественно у детей. Для профилактики кори здоровым детям в возрасте от 3 мес. до 4 лет (а больным и ослабленным независимо от возраста), имевшим контакт с больным корью, вводят 1,5-3 мл препарата однократно. Пассивный иммунитет сохраняется в течение 3-4 недель. Целью данной курсовой работы является изучение методов получения гамма-глобулинов. Для этого были поставлены задачи: 1. Описать способ получения гамма-глобулина из плаценты и путем спиртового метода. 2. Описать способ получения гамма-глобулина для лечения эпизоотического лимфангоита лошадей. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1.1 История применения препаратов гамма-глобулина. История применения препаратов из крови человека для профилактики и лечения инфекционных заболеваний относится к 1918 г., когда Nieolle и Consei предложили для предупреждения кори у детей использовать сыворотку крови реконвалесцентов, a Degkvitz (1919) разработал методику ее применения. Поскольку в основном болеют корью дети, возможность получения от них кровиограничена, стали использовать цельную кровь взрослых лиц в связи с тем, что все они в прошлом перенесли корь, а постинфекционный иммунитет при этом заболевании является полноценным и длительным, практически пожизненным, исключая лиц, перенесших митигированную корь. Вначале использовали кровь родителей, а в дальнейшем плацентарную, получаемую без вреда для рожениц, в количестве от 60 до 150 мл, сразу же после родов, а также абортную кровь здоровых женщин. Из последней готовили сыворотку, а с 40-х годов гамма-глобулин, извлекаемый спиртовым методом на холоду, гарантирующим от наличия вируса эпидемического гепатита [7]. Широкое применение гетерологичных сывороточных препаратов, в основном являющихся сывороткой гипериммунных лошадей (специфические гамма-глобулины или очищенные от балластных белков, в основном методом Диаферм-3, сыворотки), приводило к сенсибилизации к данному белку лиц, получавших эти препараты с лечебной или профилактической целью. Известно, что подобная гиперчувствительность у человека может сохраняться в течение ряда лет (3 - 7) и при повторном введении приводила к появлению тяжелых явлений, вплоть до анафилактического шока, заканчивавшегося иногда смертью. Все это направляло мысли исследователей на расширение использования метода, применяющегося при серопрофилактике кори, для иммунолопрофилактики и терапии других инфекционных болезней. Появились публикации, содержащие материалы проверки противокоревого гамма-глобулина (правильнее, человеческого, так как он применяется для профилактики ряда других инфекционных заболеваний и в особенности эпидемического гепатита) на наличие антител к вирусам гриппа, осповакцины, клещевого энцефалита, полиомиелита, а также стрептококка, дифтерийному токсину, коклюшной палочке и др. [7]. 1. 2 Характеристика препарата Специфический противогриппозный гамма-глобулин из сыворотки крови иммунизированных доноров. Противогриппозный донорский гамма-глобулин представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую жидкость, получаемую из сыворотки венозной крови доноров, многократно иммунизированных живой гриппозной вакциной типов А2 и В. В процессе храненияпрепарата возможно появление незначительных, легко разбивающихся осадков, что не является противопоказанием к введению гамма-глобулина [9]. Гамма-глобулин противолептоспирозный. Противолептоспирозный поливалентный гамма-глобулин изготавливают из гипериммунной противолептоспирозной поливалентной воловьей сыворотки. Препарат представляет собой прозрачную, бесцветную или бледно-розовую жидкость, содержащую антитела к серологическим типам лептоспир grippotyphosa, pomona, icterohaemorrhagiae, tarassovi, canicola. В качестве стабилизатора используют 2 - 4% гликокол [9]. Гамма-глобулин человеческий. Гамма-глобулин человеческий содержит преимущественно иммуноглобулины (IgG) с широким спектром антибактериальных и противовирусных антител, формирующихся в результате перенесенных инфекционных заболеваний или профилактических прививок. Препарат биодоступен в кровообращении донора в течение 2-3 от момента введения. Гамма-глобулин человеческий содержит антитела IgG, аналогичные таковым у нормальных индивидуумов. Как правило, препарат производят из плазмы, получаемой из не менее 1000 донорских доз, и характеризуется срезом подклассов иммуноглобулинов G, отражающим состав естественной плазмы человека. Препарат, будучи введенным внутримышечно в соответствующей дозе, стимулирует иммунную систему организма. Период пассивного иммунитета сохраняется в течение прибл. 3-4 недель [10]. 1. 3 Выделение гамма-глобулина Широкое практическое применение в настоящее время имеет метод очистки, сводящийся к выделению гамма-глобулиновой фракции иммунных сывороток. Наиболее детально этот метод изучен применительно к получению так называемого «коревого» гамма-глобулина из человеческой крови. В последние годы интенсивно изучаются методы выделения гамма-глобулина из гипериммунных сывороток против клещевого энцефалита, бешенства, лептоспироза, сибирской язвы. Обнадеживающие результаты получены при выделении гамма-глобулина из некоторых антитоксических сывороток. Принцип метода сводится к фракционированию сывороток спиртоводными осадителями при разных значениях рН и при температуре ниже нуля. Цельюфракционирования является отделение иммунного гамма-глобулина от альбумина, альфа- и бета-глобулинов. Очистка проходит в три стадии. 1 стадия. Условия: концентрация спирта 25%, Т °С 5°С, рН 6,8-7,2 В осадок выпадает гамма-глобулиновая фракция; кроме того, он содержит значительные примеси, главным образом, бета-глобулина. Раствор, содержащий альбумины, а также часть альфа- и бета-глобулинов после отделения осадка путем фильтрации или центрифугирования выбрасывают. Осадок растворяют в солевом растворе (0,01 М - NаС1), после чего осуществляется вторая стадия очистки. 2 стадия. Условия: концентрация спирта 13-17%, Т °С -3...-6°С, рН 5,1. В осадок выпадает бета-глобулин, липоидные вещества и небольшое количество альфа- и гамма-глобулинов. После отделения осадка раствор, содержащий очищенный гамма-глобулин, подвергается дальнейшей обработке. 3 стадия. Условия: концентрация спирта 25-26%, Т °С 5...6,5°С, рН 7,0-7,2, NаС1 0,05-0,07 мл. В осадок выпадает гамма-глобулин. [pic]Схема 1 – Фракционирование сывороток спиртовыми осадителями В схеме 1 описываются стадии получения гамма-глобулинов. Для лучшей очистки гамма-глобулина допускается переосаждение белковых осадков, полученных на 1-й и 3-й стадиях очистки. Повторным извлечением гамма-глобулина из балластных белков после 2-го осаждения достигается повышение выхода [3]. Конечный выход гамма-глобулина составляет 8-10% от общего белка сыворотки. Для удаления спирта и получения в сухом виде осадок подвергается сублимационному высушиванию. Сухой гамма-глобулин до растворения может сохраняться в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием или иным поглотителем влаги не долее одного месяца. Дальнейшей обработке может подвергаться и сырой осадок, максимально освобожденный от спирта путем суперцентрифугирования и отстаивания в течение 12-18 часов при температуре -5 °С. При изготовлении жидкого гамма-глобулина осадок растворяется в физиологическом растворе или дистиллированной воде (если растворяется сухой осадок, в котором содержится NаС1) так, чтобы довести количество белка до 10-10,5%. Содержание NаС1 врастворе должно быть доведено до 0,85%. В качестве консерванта к препарату добавляется мертиолят в конечной концентрации 1:15000. В 10%-м растворе гамма-глобулина устанавливается рН 7,0-7,5 и с помощью рефрактометра точно проверяется количество белка. После этого раствор подвергается стерилизующей фильтрации при температуре 2-8 °С. Разливка в ампулы производится после проверки-стерильности. Готовый препарат должен быть прозрачным или слегка опалесцирующим и содержать 10 % белка. Каждая серия контролируется методом электрофореза. Выпуск препарата допускается в том случае, если гамма-глобулиновая фракция составляет 97 % от количества общего белка [3]. Содержание спирта в готовом препарате в тех случаях, если обработке подвергался сырой осадок, не должно превышать 4,5 %. Каждая серия профильтрованного гамма-глобулина подвергается контролю на стерильность и безвредность. Отличие от контроля безвредности сывороток заключается в количестве вводимого препарата (свинке вводится 1 доза гамма-глобулина) и длительности срока наблюдения (за мышами наблюдают 4 дня). Годным признается препарат, не вызывающий общих и местных реакций в течение периода наблюдения. Препараты гамма-глобулина должны сохраняться при температуре 4-10 °С. Срок годности их полтора года; по истечении этого срока, если препарат не изменил своих физических свойств, он может применяться в течение еще одного месяца. 1.4 Способ получения гамма-глобулинов Известен способ получения гамма-глобулина, включающий измельчение плаценты, ее электроплазмолиз путем пропускания через сужающийся зазор между парными электродами после предварительного замораживания воздухом или без него, отделение жидкой фазы от твердой и выделение целевого продукта из жидкой фазы. [pic] Схема 2 – Способ получения гамма-глобулинов из плаценты. В схеме 2 описан способ получения гамма-глобулинов из плаценты. Способ получения состоит в том, что планцету измельчают, в процессе перемешивания пропитывают сжиженным газом при температуре выше 0oC и давлении выше атмосферного, сбрасывают давление до атмосферного, подвергаютэлектроплазмолизу путем пропускания через сужающийся зазор между парными электродами, на которые накладывают противофазные ультразвуковые колебания, направленные вдоль оси, проходящей от центров электродов и наиболее узкому зазору между ними, а затем отделяют жидкую фазу от твердой и выделяют целевой продукт из жидкой фазы. Способ обеспечивает повышение выхода гамма-глобулина. Недостатком этого способа является низкий выход целевого продукта вследствие неполного разрушения клеточной структуры плаценты и частичного разрушения целевого продукта в процессе электроплазмолиза при образовании шунтирующих перемычек между воздушными включениями в сырье [4]. Способ реализуется следующим образом. Плаценту измельчают, например, на волчке после чего пропитывают сжиженным газом, предпочтительно выбранным из ряда, включающего инертные газы, азот, закись азота, двуокись углерода, предельные и непредельные углеводороды, содержащие до четырех атомов углерода в молекуле, и их смеси. Эти газы практически не взаимодействуют с белками и не вызывают химических изменений в них. Пропитку осуществляют при температуре выше 0oC для исключения замораживания плаценты и давлении выше атмосферного, которое обеспечивает жидкое фазовое состояние газа или газовой смеси при температуре пропитки. В условиях перемешивания пропитка измельченной плаценты сжиженным газом происходит за 10 - 15 мин. Затем давление сбрасывают до атмосферного. Это приводит к мгновенному вскипанию впитанного плацентой сжиженного газа с взрывным увеличением внутриклеточного давления. В результате происходит разрыв до 90% клеточных оболочек плаценты, уцелевших в процессе механического измельчения на волчке, что значительно (почти в 2 раза) превышает количество клеточных оболочек, разрушаемых при обработке измельченной плаценты замораживанием с последующей дефростацией, как это предусмотрено способом-прототипом. Обработанную таким образом плаценту подвергают электроплазмолизу. Для этого ее пропускают через сужающийся зазор между парными электродами, колеблемыми в противофазе с улектрозвуковой частотой в направлении оси, проходящей от центров электродов к наиболее узкомуучастку зазора между ними. В процессе прохода через узкий зазор между электродами происходит уплотнение измельченной массы плаценты, выдавливание из нее наиболее крупных газовых пузырей. Мелкие пузыри при отсутствии колебаний электродов, как это предусмотрено способом-прототипом, остаются в массе плаценты и образуют полости с высоким электрическим сопротивлением, перемычки сырья между которыми являются шунтирующими, то есть проводящими электрический ток высокой мощности. В результате происходит локальный перегрев плаценты в местах образования шунтирующих перемычек, сопровождающийся термодеструкцией белковых веществ, в том числе глобулярных [4]. При наложении на электроды механических ультразвуковых колебаний происходит коагуляция мелких газовых пузырей и их удаление из массы сырья. В результате вся измельченная плацента подвергается одинаковому воздействию электрического тока в процессе плазмолиза, а химический состав белков остается неизменным. Кроме того, ультразвуковое воздействие, так же как и электрическое разрушает уцелевшие клеточные оболочки в измельченной плаценте, поэтому после электроплазмолиза в поле механических ультразвуковых колебаний плацента не имеет вообще уцелевших клеточных оболочек, в то время как при реализации способа-прототипа при наилучших результатах остается не менее 8% клеток с неразрушенными оболочками. После электроплазмолиза плаценту направляют на отделение жидкой фазы от твердой, например центрифугированием и последующим прессованием шлама. Выход жидкой фазы на стадии ее отделения по сравнению со способом-прототипом в лучшем варианте его осуществления увеличен на 6%, концентрация белка выше на 1 - 3%. Из жидкой фазы целевой продукт выделяют известными приемами, например спиртовым осаждением. Выход гамма-глобулина по сравнению со способом-прототипом в его наилучшем варианте увеличен на 8,5% [4]. 1. 5 Способ получения гамма-глобулина Способ получения гамма-глобулина путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта с сохранением степени специфическойактивности, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0, 5-1, 5, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0, 2-0, 6, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5-10. Чистота препаратов антител, получаемых при использовании этого метода, зависит от того, сколь большая часть гамма-глобулинов приходится на долю выделяемых антител, а также от степени предварительного удаления балластных веществ, главным образом липопротеинов. Известен способ получения гамма-глобулина путем его фракционирования по методике Кона спиртовым осаждением на холоде. Использование спиртового метода Кона получения гамма-глобулина ограничено трудоемкостью, длительностью процедуры, необходимостью большого количества холодильного оборудования. К тому же препараты, полученные из молока и молозива, содержат кроме гамма-глобулина альбумин, альфа- и бета-глобулины и молочные сахара. Известен также способ получения гамма-глобулина, включающий очистку сыворотки от балластных белков путем ее обработки охлажденным хлороформом в их изоэлектрической точке при рН 5, 0 - 5, 6 с последующим концентрированием препарата известным образом, например путем обработки З % жидкости сульфатом аммония 40 – 50 %-ного насыщения, сульфатом натрия в 18 %-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленглнколем. Однако известные способы не обеспечивают высокой степени очистки целевого продукта с сохранением необходимой степени специфической активности. Длительный и сложный технологический процесс включает открытые стадии и стадии, оказывающие денатурирующие воздействия на сывороточные белки, что является одной из причин снижения активности сывороток на 20 – 30 % [5]. Цель изобретения - повышение степени очистки гамма-глобулина с сохранением 45 высокой специфической активности. . Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения гамма-глобулина путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0, 5 -1,5, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0, 2 - 0, 6, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5 – 10%. Учитывая сложный состав таких биологических жидкостей, как сыворотка крови, молоко, молозиво, желчь, феномен селективного выделения гамма-глобулина обработкой полиэтиленимином, хлороформом и полиакриловой кислотой можно объяснить следующим образом: с помощью полиэтиленимина удаляются из биологической жидкости альбумин и основная часть мелкомолекулярных белков (преальбумин, трансферин, постальбумини др. ), полиэтиленимин флоккулирует в этом случае белки с малым суммарным зарядом; хлороформ денатурирует крупномолекулярные структурные компоненты, но с малым суммарным зарядом, в том числе липопротеины, глюкопротеины и в последующем переводит их в нерастворимое состояние; при обработке полиакриловой кислотой осаждаются альфа-2-макроглобулины и бета-глобулины, а также образовавшиеся на вышеуказанных этапах агрегаты денатурированного белка и остатки полиэтиленимина. Селективное выделение гамма-глобулина возможно только вышеуказанной поочередной обработкой. Изменение очередности обработки не дает подобного эффекта, так как присутствие в биологической жидкости мелкомолекулярных белков снижает эффективность удаления крупномолекулярных компонентов – липопротеинов, глюкопротеинови др. После этой обработки в биологической жидкости, в основном, находятся крупномолекулярные белки, из которых в дальнейшем с помощью полиакриловой кислоты удается получить гамма-глобулин. Пример 1. К 100 мл сыворотки крови крупного рогатого скота добавляют равное количество дистиллированной воды, а затем по каплям добавляют 10 мл 10 %-ного водного раствора полиэтиленимина, создав таким образом его 0, 5 %-ную конечную концентрацию в смеси. Смесь перемешивают до образования флоккул в течение 5 - 10 мин После образования флоккул в жидкость добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 50 % его конечной концентрации в растворе, и ее энергично гемогенизируют в течение 5 - 10 мин. После центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об. мин в надосадочную жидкость добавляют 1 мл 40 %-нойполиакриловой кислоты, что составляет 0, 2 % ее конечной концентрации в растворе. Затем проводят центрифугирование при 3000 об. минимум 20 мин. Для дальнейшего применения используют надосадочную жидкость. При необходимости получения препарата с более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40 – 50 %-ного насыщения, сульфатом натрия в 80 %-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8 – 10 %-ной конечной концентрации. Полученный осадок ресуспендируют в заданном объеме и используют для дальнейших исследований. Пример 2. К 100 мл молозива свиней (рН 7, 0 - 7, 6) добавляют 10. мл 10 %-ного водного раствора полиэтиленимина, создав таким образом его 1 %-ную конечную концентрацию в растворе. Смесь перемешивают 5 - 10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 10 % его конечной концентрации, и энергично гемогенизируют в течение 5 - 10 мин, а затем центрифугируют З5 при 3000 об. минимум 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют 1О мл 4 %-ной полиакриловой кислоты, что составляет 0, 4. ее конечной концентрации, и центрифугируют при 3000 об. мин 20 мин. Последующее 40 концентрирование с помощью средств, указанных в примерах 1 и 2, не всегда целесообразно в связи с высоким содержанием антител в молозиве. Таблица 1 - Результаты опытов по выделению гаммаглобулиновой фракции из молока и молозива |Источники |Белок, |% |Активность, |pH |Активность, |РРИД | |гамма-глобулинов | | | | | | | |Молозиво свиньи |12,5 |1,8 |>6,5 |>6,5 |>7,65 |>8,0 | Данные таблицы 1 свидетельствуют об универсальности способа получения гамма-глобулинов. Так при получении гамма-глобулинов из молозива, содержание белка уменьшилось в 7 раз, потери активности не было отмечено. На примере смолоком была отмечена небольшая потеря специфической активности в реакции нейтрализации, но не в РРИД [5]. Таблица 2 - Результаты опытов по получению гамма-глобулинов с использованием известного (контрольного) и предлагаемого способов |Вид |Характеристика |День |Вещество для |Исходный препарат |Гамма-глобулин | |животного |сыворотки |отбора |концентрирования | | | | | | | | | | Таблица 4 – Селективное выделение гамма-глобулинов | |Белок, % |% содержание в сыворотке, % | |Вид донора | | | | |До обработки |После обработки |альбумин |(-глобулин |(-глобулин |(-глобулин | |КРС |Норма |7,5 | |40,0 |17,0 |13,0 |30,0 | |Свинья |Норма |7,5 | |47,0 |17,0 |18,0 |20,0 | |Морск свин |Норма |6,2 | |54,6 | | | | Из таблицы 4 видно, что при обработке сыворотки по предлагаемому способу происходит селективное выделение гамма-глобулина. Предлагаемый способ биологической жидкости дает возможность, в отличие от ранее используемых способов, получить высококонцентрированный препарат с заданной активностью. Из проведенных опытов выяснилось, чтопредлагаемый способ получения гамма-глобулина универсален; так как дает возможность получать гамма-глобулин не только из различных биологических жидкостей, но и из биологических жидкостей различных видов животных. Преимущество предлагаемого способа заключается также в том, что получаемый антительный препарат имеет значительно большую удельную серологическую активность, чем полученный по известному способу, и имеет возможность регулирования активности в зависимости от степени концентрирования. Предлагаемый способ простовоспроизводим, технологичен, легко выполнимый в аппаратном оформлении [5]. 1. 6 Способ получения гамма-глобулина для лечения эпизоотического лимфангоита лошадей Гамма-глобулин получают из сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) в возрасте 1,5 - 2 года массой 250 - 280 кг. Гипериммунизацию животных возбудителем болезни осуществляют в два цикла с интервалом в 30 дней. Во время первого цикла антиген вводят животным однократно в течение 3 дней в дозе по 4 мл, включающей 1 мл водной суспензии гриба (50 млн/мл), 1 мл физ.раствора и 2 мл 1%-ного раствора сапонина. Во время второго цикла антиген вводят животным также однократно в течение 2 дней в дозе по 8 мл, включающей 2 мл водной суспензии гриба, 2 мл раствора и 4 мл 1%-ного раствора сапонина. Через 5 дней после окончания второго цикла гипериммунизации животных подвергают обескровливанию. Из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку, pH которой устанавливают в пределах 6,9 - 7,2. В сыворотку добавляют 50%-ный водный раствор ПЭГ до конечной концентрации 20% и после двухчасовой экспозиции при 10oC сыворотку подвергают центрифугированию при 2500 об/мин в течение 30 мин для выделения гамма-глобулина с последующей его лиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата при хранении. Перед использованием сухой гамма-глобулин разводят в 10 мл физ.раствора. Больным лошадям вводят по 10 мл гамма-глобулин двукратно через день подкожно в область нижней трети шеи. Способ обеспечивает безопасность и высокую активность препарата. Изобретение относится к ветеринарной медицине и биотехнологии и касается способа получения гамма-глобулина длялечения эпизоотического лимфангоита лошадей (ЭЛЛ) [6]. ЭЛЛ (синонимы - африканский сап, японская кожная язва, псевдосап, эпизоотическое воспаление лимфатических сосудов, бластомикоз, гистоплазмоз, пантушко) - контагиозное хроническое заболевание однокопытных животных, характеризующееся поражением (воспалением) лимфатических сосудов кожи, лимфатических узлов и подкожной клетчатки, слизистых оболочек с образованием язв и абсцессов, кератитов и пневмонии. Возбудитель заболевания - дрожжевидный грибок Histoplasma farciminosus (синоним - Cryptococcus farciminosus) впервые описан в 1873 г. итальянским ученым Ривольта (Rivolta). Заболевание наиболее широко было распространено в Африке и Азии, зарегистрировано также в различных европейских странах, в том числе в России в ходе первой и второй мировых войн, что связано с контактом животных из различных по эпизоотической ситуации стран, частыми перемещениями больных лошадей, невыполнением необходимых ветеринарно-санитарных мероприятий. Основным источником заражения является больное животное. Однако инфицированные почва и предметы ухода также могут стать причиной заражения. В организм животного гриб проникает через поврежденные участки кожного покрова и локализуется в лимфатических сосудах, подкожной клетчатке и собственно коже. Клиническое проявление ЭЛЛ характеризуется появлением язв на коже, воспалением лимфатических сосудов и образованием узелков. Степень поражения зависит от вирулентности возбудителя и уровня защитных сил организма. Наряду с местным лечением при слабой степени поражения применяют хирургическое лечение и внутривенное введение 4%-ного водного раствора формалина и хлористой ртути в концентрации 1:1000. Для профилактики ЭЛЛ проводили диагностические и ветеринарно-санитарные мероприятия, направленные на выявление больных животных, своевременное лечение заболевших животных, тщательную дезинфекцию предметов ухода и неблагополучных помещений. Известен способ лечения лошадей, больных ЭЛЛ, путем подкожного введения в область верхней трети шеи 100 мл крови других лошадей, страдающих той же болезнью, и обработки пораженных участков меднымкупоросом . Недостатки данного способа состоят в том, что для лечения используют кровь больных животных, которая может содержать возбудитель болезни, что в значительной степени снижает ценность предложения. Решений, аналогичных предлагаемому изобретению, в доступных источниках информации не обнаружено [2]. Задачей создания изобретения является разработка способа получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ. Технический результат от использования изобретения заключается в обеспечении безопасности и высокой активности препарата. Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: способ получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ из биологической жидкости; в качестве биологической жидкости используют гипериммунную сыворотку крови животных-продуцентов; в качестве животных-продуцентов используют крупный рогатый скот (КРС); КРС используют в возрасте 1,2 - 2,0 лет массой 250 - 280 кг; КРС подвергают предварительной многократной гипериммунизации возбудителем болезни в среднюю треть шеи в два цикла с интервалом в 29 - 31 день; во время первого цикла КРС гипериммунизируют в течение 3 - 4 дней в дозе по 3 - 5 мл однократно; во время второго цикла - в течение 2 - 3 дней в дозе 7 - 9 мл однократно; через 4 - 6 дней после окончания гипериммунизации КРС подвергают обескровливанию; из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку; pH гипериммунной сыворотки устанавливают в пределах 6,9 - 7,2; в гипериммунную сыворотку добавляют 50%-ный водный раствор ПЭГ до конечной концентрации 20%; после двухчасовой экспозиции гипериммунную сыворотку подвергают центрифугированию при 2500 об/мин в течение 30 мин для выделения гамма-глобулина; гамма-глобулин высушивают лиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата. Изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата, во всех случаях, на которые испрашивается объем правовой охраны: способ получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ из биологической жидкости; в качестве биологической жидкости используют гипериммунную сыворотку кровиживотных - продуцентов; в качестве животных-продуцентов используют КРС; КРС подвергают предварительной многократной гипериммунизации возбудителем болезни в два цикла с интервалом в 29 - 31 день; во время первого цикла КРС гипериммунизируют в течение 3 - 4 дней в дозе по 3 - 5 мл однократно; во время второго цикла - в течение 2 - 3 дней в дозе по 7 - 9 мл однократно; через 4 - 6 дней после окончания гипериммунизации КРС подвергают обескровливанию; из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку; pH гипериммунной сыворотки устанавливают в пределах 6,9 - 7,2; в гипериммунную сыворотку добавляют 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 20%; после двухчасовой экспозиции гипериммунную сыворотку подвергают центрифугированию для выделения гамма-глобулина. Достижение технического результата предлагаемого способа можно объяснить следующим образом. Использование гипериммунной сыворотки крови в качестве биологической жидкости и КРС в качестве животных-продуцентов данной сыворотки обеспечивают безопасность применения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ, так как КРС не подвержен этому заболеванию. Предлагаемая схема гипериммунизации КРС позволяет получить высокий титр антител в крови животных. Обработка гипериммунной сыворотки крови КРС полиэтиленгликолем при pH 6,9 - 7,2 с последующим центрифугированием позволяет произвести полное избирательное выделение гамма-глобулина высокой степени чистоты и активности. Полученный гамма-глобулин содержит высокий титр высокоочищенных антител, вступающих во взаимодействие с возбудителем и нейтрализующих его, что препятствует дальнейшему размножению криптококка в организме животных. Применение гамма-глобулина, полученного предлагаемым способом на больных эпизоотическим лимфангоитом лошадях обеспечивает их выздоровление в 85 - 90% случаях через 30 - 40 дней. Предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения: КРС используют в возрасте 1,5 - 2 лет массой 250 - 280 кг; для выделения гамма-глобулина гипериммунную сыворотку центрифугируют при 2500 об/мин в течение 25 - 35 мин;полученный гамма-глобулин высушивают лиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата при хранении. При исследовании совокупности существенных признаков, характеризующих предлагаемый способ, не выявлено каких-либо аналогичных известных решений, касающихся способов получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ. Пример 1. Для получения гамма-глобулина для лечения ЭЛЛ используют в качестве биологической жидкости гипериммунную сыворотку крови животных-продуцентов, в качестве которых используют КРС в возрасте 1,5 - 2 лет массой 250 - 280 кг. Для гипериммунизации КРС используют в качестве антигена водную суспензию микроконидий гриба эпизоотического штамма Cryptococcus farciminosus Rivolta с концентрацией 50 млн/мл. Гипериммунизацию животных возбудителем болезни осуществляют подкожно в среднюю треть шеи в два цикла с интервалом в 30 дней. Во время первого цикла антиген вводят животным в течение 3 дней однократно в дозе по 4 мл, включающей 1 мл водной суспензии гриба, 1 мл физиологического раствора и 2 мл 1%-ного раствора сапонина. Через 30 дней проводят второй цикл гипериммунизации КРС. Во время второго цикла антиген вводят животным также подкожно в среднюю треть шеи в течение 2 дней однократно в дозе по 8 мл, включающей 2 мл водной суспензии гриба, 2 мл физиологического раствора и 4 мл 1%-ного раствора сапонина. Через 5 дней после завершения второго цикла гипериммунизации животных подвергают обескровливанию. От одной головы КРС получают - 12 л крови, из которой можно приготовить примерно 250 доз гамма-глобулина. Из полученной крови отделяют гипериммунную сыворотку. pH сыворотки снижают до 6,9 - 7,2. Затем в нее добавляют 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 20%. Сыворотку перемешивают и после двухчасовой экспозиции при 10oC ее подвергают центрифугированию на центрифуге Mistral 6 L при 2500 об/мин в течение 30 мин для отделения осадка, содержащего гамма-глобулин. Полученный гамма-глобулин имеет пастообразную консистенцию желтовато-коричневого цвета. Гамма-глобулин ресуспендируют в физиологическом растворе в 1/50 исходного объема. Полученный гамма-глобулин высушиваютлиофилизацией для обеспечения стабильности свойств препарата при хранении. Перед высушиванием в каждую ампулу помещают 4 мл концентрата гамма-глобулина. Активность полученного препарата в РДП составляет 1 : 64, в ИФА - 1 : 64000. Содержание белка в препарате определяют методом Лоури и его количество составляет [pic]30 мг/мл. Перед использованием сухой гамма-глобулин разводят в 10 мл физиологического раствора. Больным лошадям вводят по 10 мл гамма-глобулина двукратно через день подкожно в область нижней трети шеи. Пример 2. Проверку лечебно-профилактичских свойств гамма-глобулина против ЭЛЛ на лабораторных животных (мышах) осуществляли следующим образом. Для опыта были приготовлены живые микроконидии гриба криптококка с концентрацией 20 млн/мл и лиофилизированный гамма-глобулин с активностью в ИФА 1 : 1000, полученный так, как описано в примере 1. Для определения лечебно-профилактических свойств гамма-глобулина в опыт взяли 35 мышей, которым ввели живые микроконидии криптококка в дозе 0,1 мл с концентрацией 20 млн/мл. Через 14 дней 10 контрольных мышей декапитировали и из тканей легких сделали высевы на косяки с КДА. Остальным мышам, разделенным на две группы, ввели гамма-глубулин в дозе 0,1 мл и 0,2 мл (по 0,1 мл через день). После 7 суток инкубации мышей декапитировали, сделали высевы на КДА с тканей легкого мышей. Наблюдение с момента высева вели в течение 15 дней. Оценку свойств гамма-глобулина проводили по проценту занимаемой площади выросших колоний криптококка. Таким образом, можно заключить, что гамма-глобулин КРС обладает лечебным действием против ЭЛЛ, причем двукратное введение препарата дает лучшие результаты. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Я считаю, что в настоящее время производство гамма-глобулина играет огромную роль в медицине. Так как в гамма-глобулине человека установлено присутствие различных противовирусных и противобактериальных антител (против вирусов кори, полиомиелита, коклюшные, брюшнотифозные агглютинины) и антитоксинов (дифтерийного, стафилококкового и др.), что определяет его профилактическое и лечебное действие. В настоящее времямикробиологическая промышленность России и других стран производит иммунные сыворотки и иммуноглобулины для лечения больных различными инфекционными заболеваниями. Это предусмотрено в отношении возбудителей тех болезней, в патогенезе которых первостепенное значение играют экзотоксины (дифтерия, ботулизм, столбняк и др.), а также ряда опасных для здоровья людей болезней – стафилококковой инфекции, сибирской язвы, лептоспироза, гриппа, бешенства, клещевого энцефалита. На сегодняшний день выделены гамма-глобулины против гриппа, дизентерии, инфекционного гепатита, клещевого энцефалита, коклюша, кори, краснухи, оспы, свинки, сибирской язвы и скарлатины. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Балашенко С. Г., Урбан В. П., Иммунные глобулины в ветеринарии. Минск, 1972; 2. Незлин Р. С., Строение и биосинтез антител, М., 1972; 3. Гусев А.А., Борзионов В.Д., Утешева Е.Н., Котова М.В., Старов С.К., Гусева Е.В., 1998; 4. Жилюк А.С. Использование новых физических методом обработки пищевых продуктов для получения гамма-глобулина, Одесса, 1972, с. 5 – 22 5. Ж. А. Шажко, В. А. Мищенко, Н.А. Улупов, В. В. Михалишин, Н. Н. ШутьА. Б, Смирнов иН.А. Яременко, 1977. 6. Ярилин А.А., Иммунология. 2010 7. Борисов Л.Б., Микробиология. 2005 8. http://www.medical-enc.ru 9. http://www.kelechek.ru 10. http://www.biomed.lublin.pl/ru ----------------------- Фракционирование 1 стадия. Концентрация спирта 25%, Т °С 5°С, рН 6,8-7,2 ( осадок выпадает гамма-глобулиновая фракция 2 стадия. Концентрация спирта 13-17%, Т °С -3...-6°С, рН 5,1 ( осадок – бета-глобулин, липоидные вещества и небольшое количество альфа- и гамма-глобулинов 3 стадия. Концентрация спирта 25-26%, Т °С 5...6,5°С, рН 7,0-7,2, NаС1 0,05-0,07 мл. ( осадок – гамма-глобулин. Плацента Пропитка сжиженным газом Сбрасывают давление до атмосферного Электроплазмолиз Отделяют жидкую фазу от твердой Гамма-глобулин |