сро гиста 4. Тема 4 м етод селезеночных колоний и его значение для изучения стволовых клеток крови
 Скачать 0.74 Mb.
|
|
СРО Тема №4: М етод селезеночных колоний и его значение для изучения стволовых клеток крови Подготовила: Замирбеккызы А. Специальность: Общая медицина Группа: 148 Проверила: Меруерт Муратовна НАО “Медицинский университет Астана” Кафедра гистологии и цитологии План 1. Введение. Немного истории 2. Суть метода селезеночных колоний 3. Клеточные культуры 4. Получение гемопоэтических колоний в селезенках у летально облученных мышей 5. Приготовление суспензии клеток селезеночных колоний 6. Морфологический анализ селезеночных колоний 7. Значение метода селезеночных колоний для изучения СКК 8. Список использованной литературы Введение. Немного истории Крупным стимулирующим импульсом в становлении молекулярно-генетической теории кроветворения стали исследования J. Е. Till, Е. A. McCulloch (1961). Эти авторы создали методику, значение которой в настоящее время не меньше, чем значение методики культивирования тканей вне организма; разработанной в начале XX века Carrel (1911). Клонирование кроветворных клеток в селезенке облученных мышей позволило создать удобную модель для исследования кроветворных клеток, их поведения под влиянием различных факторов, характера пролиферации и дифференцировок. Эта модель дает возможность изучить кинетику кроветворных клеток, в том числе выявить их свойства на разных уровнях кроветворения. J. Е. Till, Е. A. McCulloch (1961) вводили смертельно облученным мышам костный мозг здоровых и через 7 — 10 дней обнаружили в селезенке облученных животных колонии, состоящие из развивающихся кроветворных клеток. J. P. Lewis и соавт. (1964) доказали, что образующиеся форменные элементы в колониях относятся ко всем клеточным линиям. Была выявлена также зависимость между числом введенных костномозговых клеток и числом колоний. A. J. Becker и соавт. {1963) и ряд других авторов для получения «селезеночных колоний» использовали костномозговые клетки с хромосомной меткой. Все колонии, образовавшиеся в селезенке облученной мыши, имели клетки с хромосомной меткой донора. Приведенные материалы свидетельствовали о существовании в костном мозге кроветворных клеток, способных давать колонии клеток крови в определенных условиях. Они были названы колониеобразующими и отнесены в разряд стволовых плюрипотентных, родоначальных клеток, о которых в свое время говорил А. А. Максимов. Было определено количество стволовых клеток в костном мозге и периферической крови. D. W. Barnes и соавт. (1968) установили, что на 100*10 9 миелокариоцитов приходится приблизительно 10 — 20 стволовых клеток. В периферической крови их примерно в 50 — 100 раз меньше. Немало исследований посвящено цитологической характеристике и свойствам стволовых клеток. J. М. Yoffey (1973) в согласии с А. А. Максимовым представляет себе стволовую клетку в виде малого лимфоцита. Повторяя Н. Г. Хлопина, J. М. Yoffey полагает также, что не всякий малый лимфоцит может переходить в стволовую клетку, часть из них не имеет плюрипотентных свойств. G. Cudkowiez, М. Bennett (1971) доказали прямую зависимость числа гемопоэтических колоний в селезенке облученного животного от количества трансплантированных с костным мозгом лимфоидных клеток. R. J. Haas и соавт. (1973) произвели эксперимент на крысах: было получено потомство, содержащее изотоп Н 3 -тимидина во всех ядросодержащих клетках организма, через 4 нед после рождения крысам прекращалось введение Н 3 -тимидина. Спустя месяц большинство ядерных клеток теряли метку (новые клетки синтезировали ДНК из предшественников, не содержащих меченый тимидин). Однако небольшая группа клеток долго сохраняла метку. Эти клетки (эндотелиальные, ретикулярные и небольшая фракция лимфоидоподобных клеток костного мозга) не размножались, находились в покое. Если опустошить проникающим излучением костный мозг, то восстановление кроветворения происходит за счет группы лимфоидоподобных клеток. Ретикулярные и эндотелиальные клетки остаются метаболически неактивными. Однако морфологически отличить колониеобразующие клетки от обычных лимфоцитов пока не удалось. Выявлены различия функциональных свойств между костномозговыми и периферической крови стволовыми клетками, в частности, их способности к пролиферации в культуральных средах, более активных у костномозговых. Суть метода селезеночных колоний Классическим методом экспериментального изучения гемопоэза является метод селезеночных колоний Тилла и МакКаллоха (1961). Принцип метода заключается в том, что мышей облучают летальной дозой рентгеновских лучей (900- 1000 рад), после чего им инокулируют клетки костного мозга необлученных сингенных животных. Сингенными называются животные, имеющие одинаковый генотип по главному комплексу гистосовместимости и поэтому между ними возможна пересадка тканей без отторжения. После инокуляции клеток костного мозга в селезенке реципиентов появляются колонии диаметром 12 мм, состоящие из донорских клеток. Селезеночные колонии могут состоять из одного типа клеток, например, предшественников эритроцитов или гранулоцитов, а могут быть гетерогенными и состоять из разных типов клеток. Гомогенные колонии образованы потомством унипотентных клеток, а – потомством полипотентных клеток. Метод селезеночных колоний может также применяться на сублетально облученных мышах, у которых будут формироваться колонии из собственных клеток-предшественниц. Соответствующие составу колоний клетки- предшественницы обозначаются как колониеобразующие единицы, или КОЕ. Селезеночные колонии могут состоять из одного типа клеток, например, предшественников эритроцитов или гранулоцитов, а могут быть гетерогенными и состоять из разных типов клеток. Гомогенные колонии образованы потомством унипотентных клеток, а – потомством полипотентных клеток. Метод селезеночных колоний может также применяться на сублетально облученных мышах, у которых будут формироваться колонии из собственных клеток- предшественниц. Соответствующие составу колоний клетки-предшественницы обозначаются как колониеобразующие единицы, или КОЕ. 📍Дальше пойдут отрывки из автореферета “Перенос генов в клетки костного мозга с помощью лентивирусных векторов EX VIVO” Радюхиной Натальи Владимировны, ссылка на который будет в списке использованной литературы для более детального ознакомления Для переноса генов использовали переживающие первичные культуры, образованные клетками субпопуляций костного мозга с фенотипами LincKit+ , Linc-Kit+ Sca-1+ или CD105+ Sca-1+ . Переживающая культура не позволяет в течение длительного времени наблюдать за трансдуцированными клетками, однако дает возможность быстро, в течение недели, оценить эффективность трансдукции костномозговых клеток. Выделенные с помощью метода иммуномагнитной сепарации клетки костного мозга высевали в лунки 24- луночного планшета в концентрации 0,5- 1×105 клеток/мл в среде RPMI 1640 с добавлением 15% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы и 10% смеси сред, кондиционированных клетками линий линий NCTC клон 929 и WEHI-3B (2:1), и культивировали, в течение 5-7 дней при 37°C в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2. Для оценки стабильности интеграции генетической конструкции в геном клеток-«мишеней» и экспрессии репортерного гена проводили трансдукцию клеток линии NIH/3T3 (эмбриональные фибробласты мыши). В контексте решения данной задачи преимущество этих клеток состоит в том, что в отличие от клеток костного мозга, их можно легко культивировать на протяжении длительного периода времени. Клетки линии HEK-293T использовали для получения препаратов псевдовирусных частиц. Эти клетки являются производными эпителия почки человека. Культура получена из клеток культуры HEK-293 путем вставки в их геном большого Т-антигена вируса SV40. Такие клетки характеризуются высокой способностью трансфицироваться. Клетки линий HEK-293T, NIH/3T3, культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 50 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,02 mM L-глутамина в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2. Пассирование клеток проводили 2 раза в неделю, когда конфлуентность монослоя достигала 80-90%. Клеточные культуры использованные в данном методе Получение гемопоэтических колоний в селезенках у летально облученных мышей Для тестирования результатов трансдукции клеток костного мозга in vivo использовали метод получения гемопоэтических колоний в селезенках летально облученных мышей с некоторыми модификациями. Самок мышей со средней массой 18-20 г подвергали летальной дозе облучения (10 Гр) в течение двух сеансов по 25 минут с перерывом в 3 часа (мощность дозы 17 сГр/мин). Через 1-24 ч после облучения самкам в хвостовую вену вводили 0,5 мл среды DMEM, содержащей 3×103 трансдуцированных клеток донорского костного мозга самца с фенотипом Linc-kit+ . Было проведено два эксперимента по получению селезеночных колоний. В первом эксперименте для трансдукции клеток использовали псевдовирусные частицы, полученные на основе экспрессионного вектора pLA-CMV-сop- GFP-H1, содержащие ген сopGFP под промотором CMV. Во втором эксперименте клетки трансдуцировали псевдовирусными частицами на основе вектора pLA-MSCVDsRed-H1, которые содержали ген dsRed под промотором MSCV. Через 10 дней (эксперимент по трансдукции гена сopGFP) или 12 дней (эксперимент по трансдукции гена dsRed) после введения клеток костного мозга животных умерщвляли, извлекали селезенки, проводили их визуальный осмотр на наличие колоний и фотографировали с помощью цифровой камеры Nikon Coolpix. Для проведения цитофлуориметрического и ПЦР-анализов готовили суспензию клеток колоний. Приготовление суспензии клеток селезеночных колоний Для приготовления одноклеточной суспензии из селезенок вырезали наружные колонии, которые осторожно гомогенизировали с помощью металлического пестика в отдельных микроцентрифужных пробирках (CorningCostar) (объем пробирок 1,5 мл) в среде DMEM и пропускали через клеточное сито с диаметром пор 30 мкм (Miltenyi Biotec). Морфологический анализ селезеночных колоний Для проведения морфологического анализа часть селезенок с колониями фиксировали по Буэну и после проведения рутинной гистологической проводки заливали в парафиновую среду HISTOMIX. Гистологические срезы толщиной 5 мкм получали на микротоме Reichert Jung 2050 SuperCut (Германия), окрашивали гематоксилин - эозином или гематологическим красителем по Гимзе (Sigma) и заключали в синтетическую среду Depex. Срезы изучали с помощью микроскопа Leica CTR5000, оснащенного цифровой фотокамерой Leica DFC 420C и системой для анализа изображения Leica Application Suite Las. Значение метода селезеночных колоний для изучения СКК КОЕ-С не идентичны СКК, метод селезеночных колоний, используется для анализа СКК и в настоящее время. Его модификация, предложенная японскими исследователями, позволила продемонстрировать, что истинные СКК также способны формировать визуально различимые кроветворные клоны-колонии в селезенке в более поздние сроки по сравнению с мультипотентными предшественниками (Liang et al., 1999; Ikehara, 2000; Yang et al., 2002). Таким образом, метод селезеночных колоний остается адекватной моделью исследования клоногенных кроветворных клеток разной степени зрелости и в зависимости от срока наблюдения позволяет вести дифференцированный учет как родоначальных клеток, так и СКК. Список использованной литературы 1. Гистология, эмбриология, цитология: учебник / Данилов Р.К., Боровая Т.Г. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2020. 2. https://www.serdechno.ru/depres/osnovy/9633.html 3. https://studfile.net/preview/5621917/page:40/ 4. https://cardioweb.ru/files/autoref/74.pdf 5. https://www.dissercat.com/content/eksperimentalnoe-issledovanie- kletochnykh-mekhanizmov-krovetvoreniya-v-ontogeneze |