Тема 41 Полимеразная цепная реакция
 Скачать 327.5 Kb.
|
|
Пиросеквенирование Пиросеквенирование – это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». Секвенирование одной цепочки нуклеотидов ДНК происходит путем синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Световой сигнал образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы. Этапы пиросеквенирования: 1. ДНК фрагментируются на участки по 300-500 пар оснований. Комплементарные цепи фрагмента разделяются и образуют одноцепочечную матрицу. К каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид – «адаптер», последовательность которого позволяет позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу. Основной задачей олигонуклеотида является опосредованное связывание цепи ДНК с сефарозной микросферой (бусиной). 2. Образовавшийся комплекс «одноцепочечная ДНК-бусина» окружается эмульсионной сферой (капля масла), в которую заключены компоненты реакционной смеси для ПЦР (Taq-полимераза, праймеры, буфер для ПЦР) – так называемая эмульсионная ПЦР (эПЦР). 3. Внутри этой сферы в процессе амплификации (так называемая клональная амплификация) на каждой бусине накапливаются копии исходного, прикрепленного к ней, фрагмента ДНК. 4. По завершении процесса амплификации эмульсия разрушается, и освободившиеся бусины с накопленными на них ампликонами переносятся в специальные шестигранные камеры слайда: по одной в каждую камеру. Слайд представляет собой срез блока, полученного путём нескольких раундов вытягивания и сплавления оптических волокон. В результате каждой итерации, диаметр индивидуальных волокон уменьшается, волокна формируют пучки шестигранной упаковки. Каждое волокно имеет сердечник диаметром 44 мкм, окружённый 2–3 мкм слоем плакировки (оболочки). Затем сердечники вытравливаются, и в результате получаются камеры около 55 мкм глубиной и с расстоянием между центрами соседних камер около 50 мкм. Объём таких «реакторов» – 75 пиколитров; плотность размещения на поверхности слайда – 480 камер на квадратный миллиметр. Каждый слайд несёт их около 1,6 миллионов. Слайд помещается в проточную камеру таким образом, что над отверстиями камер создаётся канал высотой 300 мкм, по которому в них поступают необходимые реактивы. 5. Доставляемые в проточную камеру реактивы текут в слое, перпендикулярном оси лунок. Такая конфигурация позволяет одновременно осуществлять реакции на бусинках, несущих ДНК-матрицы, внутри отдельных камер. Добавление и удаление реагентов и продуктов реакции происходит за счёт конвекционного и диффузионного переноса. 6. Помимо бусинок с ДНК-матрицей, в каждую камеру вносят бусины еще меньшего размера, каждая из которых несет на своей поверхности иммобилизованные ферменты, необходимые для пирофосфатного секвенирования (ДНК-полимераза, АТФ-сульфурилаза, люцифераза и апираза), а также субстрат аденозин-5'-фосфосульфата (APS) и люциферин. Нуклеотиды (одного вида за один раунд) и другие реактивы, необходимые для реакции секвенирования, подаются последовательно в проточную камеру, куда помещается слайд. Дно слайда находится в оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, подключённым к прибору с зарядовой связью (CCD-сенсор, charge coupled device). Это позволяет регистрировать излучаемые фотоны со дна каждой индивидуальной камеры, в которой произошло встраивание известного нуклеотида. Каждый раз, когда определённый нуклеотид встраивается в растущую цепь ДНК в какой-нибудь из камер, в ней высвобождается молекула пирофосфата, которая, в свою очередь, является необходимым предшественником компонента другой ферментативной реакции. Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат (АТФ) в присутствии аденозин-5'-фосфосульфата. АТФ выступает источником энергии для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ. Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой. Невключенные нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом. В 2005 году учёные из 454 Life Sciences, используя свою технологию пиросеквенирования, сумели расшифровать 600 000-нуклеотидный геном бактерии Mycoplasma genitaliumс точностью до 99,4%, а также 2 100 000-нуклеотидный геном Streptococcus pneumoniae. На данный момент пиросеквенирование используется для количественной оценки в следующих направлениях:
Таким образом, пиросеквенирование позволяет решить ряд важных задач практической медицины, тем не менее, существует ряд недостатков, снижающих производительность анализа, но увеличивающих его цену:
Следует отметить и тот факт, что полногеномные исследования, равно как и поиск SNP, для которых только предполагается роль в развитии патологических состояний, представляют интерес в рамках масштабных научных проектов. Напротив, в практике клиницистов наибольшую значимость приобретают полиморфизмы, для которых доказана роль в развитии тех или иных заболеваний, и полученная в ходе анализа информация может быть однозначно истолкована, позволит назначить терапию, скорректировать образ жизни или рекомендовать дополнительные исследования. Кроме того, несмотря на то, что стоимость одного исследования с использованием секвенаторов, представляется доступной для рутинной работы лаборатории, тем не менее, один запуск такого прибора на сегодняшний день составляет порядка $10 000. С этой точки зрения, наиболее эффективным и практичным подходом на данный момент является анализ SNP методом ПЦР. Однако в реализации данного подхода существует ряд технических особенностей, способных повлиять на качество полученного результата. В первую очередь, это касается способов детекции. Одни из первых коммерческих наборов, направленных на анализ полиморфизмов, представляли собой системы с аллель-специфичными праймерами и последующей детекцией результатов в формате электрофореза. Объективным недостатком такого решения является выcокая степень субъективности при интерпретации результатов, а также риск контаминации. Следующим шагом в данном направлении было использование интеркалирующих красителей, типа SYBR-GREEN. С точки зрения качества полученных результатов стоит отметить, что использование красителей этой группы значительно чаще приводит к детекции не только специфической последовательности, но и неспецифических продуктов амплификации (например, димеров), по сравнению с аналогичными показателями при использовании флуоресцентных зондов. Кроме того, тест-системы с интеркалирующими красителями подразумевают использование двух пробирок для определения одного SNP, что сокращает пропускную способность лаборатории. Напротив, использование флуоресцентных зондов для ПЦР в режиме «реального времени» позволяет реализовать подход: «один SNP – одна пробирка». Еще одним существенным недостатком является сложность в интерпретации результатов, полученных с использованием интеркалирующих красителей, с точки зрения автоматизации данного процесса. Принимая во внимание значимость анализа полиморфизмов в клинической практике, основными направлениями усовершенствования метода ПЦР были: автоматизация процесса обработки полученных данных и выдачи результата; повышение точности и стабильности работы системы. Здесь следует отметить вариант ПЦР с функцией HRM (High Resolution Melting). В основе данного подхода лежит гетеродуплексный анализ с использованием интеркалирующих красителей и последующим плавлением ампликонов в одной пробирке. Генотипирование производится автоматически, на основе анализа форм кривых, с применением специализированного программного обеспечения. Недостатком такого подхода является сложность в интерпретации форм кривых для разных генотипов, для чего возникает необходимость вводить математические методы анализа полученных результатов. Кроме того, разница температур плавления для различных генотипов (в тех случаях когда она должна быть) должна составлять более 0,1°С, что делает систему устойчивой, позволяя проводить надежное автоматическое генотипирование и оставляя возможность для визуальной интерпретации результатов. Минимизировать ошибку интерпретации позволяет разница температур для аллельных вариантов не менее 4-5 °С, что обеспечивает максимальную стабильность и воспроизводимость результатов. Заслуживающим внимания приложением метода HRM является возможность поиска новых SNP в пределах амплифицированного участка, что актуально для решения научных задач. Таким образом, использование метода ПЦР с детекцией результатов в режиме «реального времени» и наборов реагентов с флуоресцентными зондами позволяет решить актуальные задачи диагностических лабораторий, проводящих исследования SNР. Микрофлюидные технологии Развивающимся направлением ДНК-диагностики является использование технологии с применением микрофлюидных чипов. Это отражает одну из основных тенденций развития современной аналитической техники – миниатюризацию. Наиболее яркое воплощение этой тенденции явилось в системах: «лаборатория на чипе» (Lab-on-a-Chip), или микроаналитических системах полного анализа (micro Total Analysis System).Основой таких систем является аналитический микрочип, на котором реализуются основные стадии определения искомой ДНК. В основе использования биочипов лежит метод гибридизационного анализа – комплементарное связывание нуклеотидов. Это метод прямого обнаружения специфической последовательности нуклеотидов (ДНК или РНК) при помощи коротких олигонуклеотидных одноцепочечных фрагментов. В зависимости от варианта анализа или в анализируемый образец, или в олигонуклеотид вводят репортерную группу (зонд). Наиболее распространенной репортерной группой, включаемой в состав олиго- и полинуклеотидных зондов, является витамин биотин (природный кофактор группы ферментов – карбоксилаз). При анализе последовательностей РНК гибридизационную пробу – исследуемый фрагмент генома – готовят методом ОТ-ПЦР с последующей in vitro транскрипцией (получают комплементарную ДНК – кДНК) и включением биотинового зонда. Размер амплифицированного фрагмента находится в пределах 100-1000 пар нуклеотидов. Главным элементом биочипов является матрица микроячеек, каждая из которых содержит олигонуклеотиды, специфичные одному из множества исследуемых фрагментов кДНК. После нанесения их на биочип молекулы исследуемого образца соединяются со своей «комплементарной парой». Следующий шаг – промывка, чтобы удалить лишние не связавшиеся ни с чем биологические молекулы. Для проведения пероксидазной реакции используется коньюгат, состоящий из фермента, связанного со стрептавидином. Этот коньюгат образует очень прочный комплекс биотин-стрептавидин, который используется как связующий мостик между образовавшимся в ходе гибридизации дуплексом кДНК и ферментной меткой. Наибольшее распространение в качестве ферментной метки получила пероксидаза хрена, которую впервые применили Накане и Пирс. Под действием пероксидазы, субстрат H2O2 образует с красителем диаминобензидином (ДАБ) нерастворимый в воде и спирте комплекс коричневого цвета, который накапливается вокруг фиксированного дуплекса. Полученную на экране компьютера гибридизационную картину для анализируемой пробы сравнивают с гибридизационной картиной для положительного контроля и гибридизационной картиной для отрицательного контроля. В настоящее время анализ с использованием биочипов находит широкое применение на практике. Он отличается высокой чувствительностью, простотой процедуры выполнения, возможностью одновременного анализа множества параметров, специфичностью и воспроизводимостью. Применение биологических микрочипов может быть очень эффективно в таких сферах деятельности, как:
Развитие микрофлюидики привело к появлению приборов, в которых осуществляется воспроизводимое управление нано- и пиколитровыми объемами жидкости. Это позволяет:
Тем не менее, микрочиповые технологии для ПЦР не позволяют избавиться от общего недостатка метода – необходимости градуировки для точных измерений. Технологии секвенирования ДНК с использованием биологических микрочипов пока еще достаточно дороги в использовании и имеют ряд ограничений:
Поэтому применение биочипов для анализа микроследов или объектов, содержащих деградированную ДНК, пока затруднено. Развитие ПЦР в режиме «реального времени» Основными перспективами развития классического метода ПЦР, в первую очередь, ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» являются:
Повышение продуктивности является ключевой целью клинических лабораторий. Это возможно при наличии систем, которые позволяют уменьшить количество действий, занимающих много времени, таких как маркировка образцов, пробоподготовка, выделение. Полная автоматизация подразумевает освобождение оператора для выполнения других этапов лабораторной работы. Кроме того, ручной труд при обработке пробы составляет приблизительно 70% стоимости тестирования. Автоматизированная система с использованием маркировочных систем позволяет проводить контроль за образцами на всех этапах: от регистрации до утилизации. Это существенно снижает ошибки на этапе идентификации образцов и загрузки их в блок пробоподготовки, равно как и на всех последующих этапах, включая этап формирования протокола исследования. Принципиальным является внедрение системы рутинного дозирования жидкостей, стандартизацию их объема во всех образцах, переноса из пробирки в пробирку и перемешивания. Это важно и с точки зрения нормализации концентрации ДНК с использованием наборов для проведения ПЦР, что значительно повышает качество работы на всех ее этапах. Этап выделения нуклеиновых кислот требует выполнения трудоемких операций, чреват существенными потерями, негативно сказывающимися на результативности проводимого анализа. Автоматическая экстракция нуклеиновых кислот удовлетворяет потребности лаборатории в высокопроизводительной пробоподготовке, обеспечивает точность экстракции и технологическую безопасность. Кроме того, автоматизация процесса позволяет минимизировать количества реагентов, необходимых для качественного выделения ДНК/РНК. Таким образом, существенно снижается стоимость и возрастает скорость данного этапа. Переведение исследований в плашечный формат позволяет не только оптимизировать этап загрузки образцов, но и способствует увеличению производительности лаборатории в целом. Использование технологии горячего запаивания планшетов обеспечивает максимальную герметизацию, направленную на снижение риска выпаривания образцов, разрушения пробирки из-за ошибки пользователя, и обеспечивает максимальную защиту от контаминации внешней среды и кросс-контаминации образцов. Преимущество «пакетного» исследования – экономия за счет готовой технологии изучения. Набор необходимых исследований определяется в зависимости от поставленных задач, например, развернутый анализ проблем репродукции, семейного бесплодия, привычного невынашивания беременности, использования вспомогательных репродуктивных технологий. В результате в сжатые сроки клиницист получает развернутую лабораторную информацию о заявленной проблеме, что позволяет определить тактику ведения пациентов и сформировать наиболее эффективную схему лечения. Кроме того, данный формат чрезвычайно важен с точки зрения реализации скрининговых и многопараметрических исследований. При этом принципиальным является снижение себестоимости одного параметра, по сравнению с аналогичными показателями в рамках анализа с использованием отдельных тест-систем. Таким образом, современное развитие ПЦР в направлении полной автоматизации процесса позволяет максимально оптимизировать условия работы лаборатории, увеличить ее пропускную способность и повысить качество проводимых исследований. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На сегодняшний день метод ПЦР имеет огромное научное и прикладное значение, с его помощью были реализованы масштабные исследования в области медицины и биологии. Был совершен прорыв в диагностике широкого спектра инфекционных и генетических заболеваний, онкопатологий. Накопленная за этот период времени информация позволила сформировать принципиально новый персонифицированный подход к комплексному обследованию пациентов и определить альтернативные варианты терапии с учетом их особенностей генотипа и популяционной принадлежности. Итак, с момента возникновения идеи многократного увеличения числа копий искомой молекулы ДНК прошло сравнительно немного времени, тем не менее, технология ПЦР совершила гигантский рывок и стала неотъемлемой частью рутинной лабораторной практики, продолжая при этом совершенствоваться и развиваться. ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ
|