Тема 41 Полимеразная цепная реакция
 Скачать 327.5 Kb.
|
|
Сравнение результатов ПЦР и микроскопии На данный момент микроскопические методы исследования широко применяют в диагностике инфекционных болезней бактериальной этиологии, паразитарных и (реже) вирусных заболеваний. В повседневной практике лаборатории микроскопическое исследование, как правило, используют для ускоренной ориентировочной диагностики. Основные задачи микроскопии:
Этот метод рассматривается, как самый быстрый и дешевый, его использование связано с минимальными требованиями к организации лаборатории. Тем не менее, существует ряд ограничений в использования микроскопии для диагностики инфекционных заболеваний:
Так, при диагностике трихомониаза микроскопический метод имеет самую низкую чувствительность: в среднем – 30% (для женщин – 50-60%, для мужчин – 10-12%), тогда как метод ПЦР достоверно определяет возбудителя в 90-96% случаев. Такие показатели микроскопии обусловлены потерей микроорганизмом характерной подвижности после извлечения во внешнюю среду. Особенно затруднительна диагностика в случае низкотитражных препаратов или препаратов, содержащих значительное количество клеток эпителия и лейкоцитов. В очаге воспаления трихомонада часто представлена округлыми формами, напоминающими полиморфноядерные лейкоциты, кроме того, типичные морфологические признаки теряются во время фиксации и окрашивания, создавая трудность для этиологической идентификации. Сравнение чувствительности микроскопических методов исследования и ПЦР применительно к таким микроорганизмам, как N.gonorhoeae и C.trachomatis, свидетельствует, что в первом случае частота выявляемости патогена в микроскопии у мужчин – 80-95%, у женщин – 30-50%, а во втором – 10-12%. При этом, использование метода ПЦР дает возможность определять указанные микроорганизмы с чувствительность более 95%. Микроскопия микроорганизмов в нативном состоянии (главным образом фазово-контрастная) имеет ограниченное применение, главным образом, при выявлении их подвижности и изучении морфологии микроорганизмов, лишенных клеточной стенки (микоплазм и L-форм бактерий). L-формы – бактерии, частично или полностью лишённые клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию. Возникают спонтанно или индуцировано – под воздействием агентов, блокирующих синтез клеточной стенки: антибиотиков, ферментов, ультрафиолетовых и рентгеновских лучей, аминокислоты глицина. L-форма обнаружена у патогенных видов холерного вибриона, токсигенных штаммов Clostridium tetani, Treponema pallidum. L-формы нередко обнаруживаются в организме при таких длительно протекающих патологических процессах, как бруцеллез, септический эндокардит. Важно учитывать, что существенным ограничением микроскопических исследований является также использование их для количественного анализа. Например, анализ состояния биоценоза урогенитального тракта предусматривает количественное определение широкого спектра условно-патогенных аэробных и анаэробных микроорганизмов, для которых доказана роль в развитии воспалительных процессов органов малого таза на фоне снижения количества ключевого представителя нормофлоры – бактерий рода Lactobacillus. Традиционно при световой микроскопии выявляют не более 10 морфотипов: Lactobacillus spp., Gardnerella vaginalis, Bacteroides spp., Mobiluncus spp., Fusobacterium spp., Leptotrihia spp., Veillonella spp., Candida spp. При этом морфотипы факультативно-анаэробных бактерий, обнаруживаемых в мазках, морфологически однотипны у многих видов и родов бактерий – колиформные палочки или грамположительные кокки. Например, Atopobium vaginae не имеет специфических микроскопических признаков, как G.vaginalis и Mobiluncus spp., и выглядит под микроскопом как обычная коринобактерия, довольно часто встречающаяся у здоровых женщин. При этом данный микроорганизм является одним из основных факторов развития рецидивирующего бактериального вагиноза и его осложнений. Кроме того, при микроскопии мазков можно выявить микроорганизмы, присутствующие в биоматериале в количестве, обычно превышающем 105 КОЕ/мл, тогда как многие факультативно-анаэробные и аэробные бактерии могут проявлять патогенный эффект при сравнительно небольшом их количестве (до 104 КОЕ/мл), которое не выявляется при микроскопии. Поэтому диагностическая ценность микроскопического исследования вагинального отделяемого резко снижается. В связи с этим возникает существенная проблема по установлению этиологии воспалительного процесса/дисбиоза, определению тактики ведения пациента и, как следствие, наблюдается увеличение числа рецидивов. Результаты, полученные методом ПЦР, в данном случае отличаются высокой специфичностью и чувствительностью, поскольку позволяют избежать субъективной оценки морфотипов и их количества, не зависят от тинкториальных особенностей исследуемых микроорганизмов. Кроме того, появляется возможность дифференцировки процесса: аэробный/анаэробный дисбиоз, дисбиоз смешанного генеза и определение наиболее эффективных в каждом отдельном случае терапевтических или коррекционных мероприятий. Сравнение результатов ПЦР и культурального метода Культуральный метод, наряду с микроскопией микроорганизмов, входит в «золотой стандарт» диагностики. Объективными причинами тому являются:
Но в применении культурального метода существуют не менее объективные ограничения:
Существует несколько общих условий взятия материала для проведения исследований с помощью культурального метода. Пробы берут до начала антибактериальной терапии или после выведения антибактериального препарата из организма. Если исследование необходимо провести в период лечения, то при посеве материала в него добавляют ингибитор препарата (например, пенициллиназу в случае применения бета-лактамного антибиотика). Количество материала должно быть достаточным для проведения анализа. Материал, полученный от больных с хроническими вялотекущими инфекционными процессами, содержит меньше микроорганизмов, чем при остром процессе, поэтому для выделения возбудителя требуется большее его количество. Транспортировку материала для исследования осуществляют в предельно сжатые сроки. Охлаждение материала в холодильнике при температуре 4°С (или на льду) позволяет увеличить время до начала исследования на 30-60 мин. Более длительное хранение может привести к гибели возбудителей или изменению количественных соотношений компонентов микрофлоры. Поэтому в случаях, когда хранение и транспортировка длятся более суток, используют консервант или транспортные (поддерживающие, накопительные) среды и специальные средства, сохраняющие жизнедеятельность микроорганизмов. Так, для транспортировки образцов материала, предназначенных для выделения анаэробных бактерий, применяют герметизированные флаконы или пробирки, заполненные бескислородным газом. В некоторых случаях посев необходимо производить ex tempore (при коклюше, менингококковой инфекции, дизентерии). Методы, позволяющие провести посев материала у постели больного, значительно повышают вероятность выделения возбудителя. При соблюдении перечисленных требований чувствительность культурального метода, например, при диагностике гонореи у мужчин, составляет – 95-98%, тогда как у женщин – не более 80-85%. В случае выявления трихомонады – 70-85%, С.trachomatis – 60-80%. Во всех перечисленных случаях метод ПЦР демонстрирует чувствительность не менее 95-98%. Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении труднокультивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Некультивируемыми называют такие формы микроорганизмов, которые в ответ на действие неблагоприятных факторов прекращают рост на питательных средах, но сохраняют жизнеспособность, а при улучшении условий культивирования возобновляют пролиферацию. В настоящее время известно около 45 видов микроорганизмов, относящихся к 30 родам, у которых обнаружена некультивируемая форма. Из них 30 видов – патогенны для человека, 15 видов – условно-патогенны или являются эубионтами человека, животных или растений. Среди бактерий есть возбудители таких инфекций, как чума, холера, тулерямия, легионеллез, шигеллез, сальмонеллез. Достаточно часто наблюдаются расхождения результатов культурального метода и ПЦР на этапе количественной оценки компонентов сложных систем, таких, как биоценозы. Это вполне объяснимо с точки зрения невозможности синхронизировать рост микроорганизмов – компонентов биоценоза - и определить их соотношения в единицу времени. Кроме того, основные этиологические агенты анаэробных дисбиозов не культивируются в стандартных лабораторных условиях, что искажает картину при анализе состояния микрофлоры того или иного биотопа. Таким образом, можно заключить, что несовпадение результатов между различными лабораторными методами исследования и ПЦР – достаточно распространенная ситуация, которая обоснована пределами чувствительности методов, поставленными задачами и квалификацией специалиста. Проведенная в зарубежных исследовательских центрах оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что экспресс-тесты, имеют чувствительность 40-60%, ИФА – 50-70 %, прямая иммунофлуоресценция – 55-75%, культуральное исследование – 60-80%, а ПЦР – 90-100 %. Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это связано с наиболее острой проблемой метода – контаминацией. Контаминация Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул нуклеиновых кислот, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты. Основными видами контаминации являются:
Основными правилами предотвращения контаминации в лаборатории ПЦР являются:
Существует несколько способов борьбы с контаминацией. Одним из этих способов является использование фермента N-урацил-гликозилазы (УГ). В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием смеси дНТФ, в которой дТТФ заменен на дУТФ (урацил), и после термоциклирования все образующиеся в пробирке ампликоны будут содержать урацил. Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации. Другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации. Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция не идёт со 100%-ной эффективностью и, соответственно, после инактивации продуктов амплификации из миллиардов копий амплифицированного фрагмента хотя бы несколько останутся целыми, что существенно снижает ценность такого подхода. Кроме того, всегда остается риск кросс-контаминации от образца к образцу в процессе пробоподготовки. Таким образом, оба эти метода лишь в некоторой степени позволяют устранить источник контаминации и не гарантируют отсутствия ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Есть третий способ борьбы с результатами контаминации, рассматриваемый скорее как казусный – значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25-30 циклов). Но даже при таком подходе риск получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов велик. Наиболее радикальным подходом для решения этой проблемы, является использование флуоресцентных методов детекции, которые позволяют регистрировать результаты анализа, не открывая пробирки. Тем самым исключается этап электрофореза – основной источник контаминации. Для уверенности в отсутствии контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать отрицательными контролями. В качестве отрицательных контролей рекомендуется использовать воду из комнаты пробоподготовки (после каждого десятого клинического образца желательно обрабатывать вместо биологического образца пробирку с водой). Все реактивы рекомендуется хранить отдельными порциями (аликвоты). Если, несмотря на принятые меры, обнаружены следы контаминации, то все используемые порции реактивов следует заменить на новые, а все поверхности помещения, оборудования, пипетки и пр. обработать дезинфицирующими препаратами. Порядок обеззараживания и утилизации отработанного исследуемого материала и отходов после проведения исследований, а также действия при контаминации лаборатории нуклеиновыми кислотами и ампликонами регламентированы МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Согласно этим указаниям:
Тем не менее, проблема контаминации остается актуальной для большинства учреждений, использующих метод ПЦР в рутинной работе, поэтому наиболее принципиальным моментом является правильная организация лаборатории. Другие системы для расшифровки ДНК, появление которых на рынке ожидается в течение 1-2 лет, относятся уже к «третьему поколению» и основываются на анализе одиночных молекул. Они разрабатываются компаниями VisiGen и Helicos. Секвенаторы Ion PGM, разработанные специалистами компании Ion Torrent (США), – первые секвенаторы нового поколения, считывающие последовательность ДНК с использованием полупроводниковой технологии. Новая технология поможет сделать секвенирование ДНК более доступным для лабораторий. Использование автоматических секвенаторов позволило существенно снизить стоимость секвенирования одного звена с 1 $ до 0,1 $. Тем не менее, развернутые системы исследования с использованием секвенаторов сохраняют достаточно высокий ценовой уровень, равно как и стоимость самого оборудования и расходных материалов не позволяет на данный момент широко внедрить эту технологию. Интересным направлением является вариант метода секвенирования – пиросеквенирование. |