Микробиология. Микра. Типы питания. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на аутотрофы
 Скачать 48.72 Kb.
|
Методы выделения чистых культур облигатных анаэробовДля получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы: Метод Цейсслера. (Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 часов. ) Метод Вейнберга. (Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате.) Метод Виньяля-Вейона.( В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов.) Метод Перетца. (Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6x6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри.) Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов. + Выращивание чистой культуры анаэробов производят путем посева материала из изолированной колонии на среду Китта-Тароцци, в состав которой входит мясной бульон, глюкоза и кусочки печени или фарша. Для предотвращения доступа кислорода среда покрыта слоем вазелинового масла. 3.рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий в замкнутой среде(периодическая культура)непрерывное культивирование. Промышленное культивирование бактерий Рост и размножение бактерий. фазы размножения. Рост бактерий – увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции. Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения. Рост всегда предшествует размножению. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние. Фазы размножение бактериальной клетки на жидкой питательной среде: 1) начальная стационарная фаза; то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится; 2) лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность – 3–4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увеличивается количество белка, РНК; 3) фаза логарифмического размножения; активно идут процессы размножения клеток в популяции, размножение преобладает над гибелью; 4) максимальная стационарная фаза; бактерии достигают максимальной концентрации, т. е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит; 5) фаза ускоренной гибели; процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества. Двухфазный рост бактерий. У бактерий, способных использовать два различных источника углерода, наблюдают двухфазный рост (так называемая диауксия). Примером может служить рост кишечной палочки на среде с глюкозой и сорбитолом: • Для подобных микроорганизмов характерен начальный пик роста, в течение которого бактерии утилизируют только один углевод. • После исчерпания его запасов наступает стационарная фаза, в течение которой в культуре инициируются синтез ферментов и механизмы транспорта для утилизации второго углевода. +• Если физиологические условия удовлетворительны, в бактериальной культуре начинается фаза вторичного экспоненциального роста, инициированная утилизацией второго углевода. 4.Основные принципы культивирования бактерий. Аппаратура для культивирования микроорганизмов. Культоральные свойства бактерий. Основные принципы культивирования бактерий. Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют. При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надг писывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры). Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий. К культуральным или макроморфологическим свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием, они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры. При описании колоний учитывают следующие признаки: форму колонии – округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т.д.; размер (диаметр) колонии – очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре); поверхность колонии – гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; профиль колонии – плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т.д.; прозрачность – тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая; цвет колонии (пигмент) – бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием; край колонии – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.; структура колонии – однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз; консистенция колонии – определяют прикасаясь к поверхности петлей, колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей). 5.искуственные питательные среды и их классификация. Требования предъявленные к искусственным средам. питательные среды являются основой бактериологических исследований. Они служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов, для изучения их свойств. На питательных средах создаются оптимальные условия для размножения микроорганизмов. Требования, предъявляемые к питательным средам. 1. Питательные среды должны содержать необходимые для питания микробов питательные вещества. 2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. 3. Питательные среды должны иметь достаточную влажность и вязкость, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса. 4. Обладать изотоничностью и иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал. 5. Питательные среды должны быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур. По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные готовят на основе жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агар-агара или желатина. 1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные Различают группу сред общего назначения - простых. К этой группе относят мясо-пептонный бульон (простой питательный бульон), мясо-пептонный агар {простой питательный агар), питательный желатин. Эти среды применяются для выращивания многих патогенных микробов. Также по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды. 2. По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные). Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения. 3.По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования {универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные). Также по назначению различают среды элективные(создаются условия для культивирования опред.вида бактерий,сначала будет вырастать тот микроогранизм, для которого эта среда будет элективной,подавляется рост сопутствующей микрофлоры), специальные(для тех, кто не растет на простых пит. средах) и дифференциально-диагностические( используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. (Эндо, Гисса). 6.Принципы и методы выявления чистых культур. Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами. Колония представляет собой видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам. Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований — идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма. Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов. Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры. Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах. При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент — Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент — Pseu-domonas aeruginosa. Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвениб соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам. Методы выделения чистых культур бактерий. Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют. При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надг писывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры). + Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий. 7.Международная классификация и характеристика ферментов бактерий. Методы определения гликолитических и протеолитических бактерий. Идентификация бактерий по ферментативной активности. Методы определения гликолитических и протеолитических бактерий — это посев бактерий в соответствующую среду.1. Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д.2. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения различных сахаролитических ферментов. Ферменты бактерий. г и д р о л а з ы, вызывающие расщепление протеинов, углеводов, липидов путем присоединения молекул воды; оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции; трансфера з ы, осуществляющие перенос отдельных атомов, от молекулы к молекуле; л и а з ы, отщепляющие химические группы негидролитическим путем; изомеразы, участвующие в углеводном обмене; л и г а з ы, способствующие биосинтетическим реакциям клетки. + Ферменты бактерий классифицируются на экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты выделяются бактериальной клеткой в окружающую среду для внеклеточного переваривания. Этот процесс осуществляется с помощью гидролаз, которые расщепляют макромолекулы питательных веществ до простых соединений — глюкозы, аминокислот, жирных кислот. Такие соединения могут свободно проходить через оболочку клетки и с помощью пермеаз передаваться в цитоплазму клетки для участия в метаболизме, являясь источниками углерода и энергии. Некоторые экзоферменты выполняют защитную функцию, например, пенициллиназа, выделяемая многими бактериями, делает клетку недосягаемой для антибиотика — пенициллина. 8.механизмы действия на микроорганизмы химических веществ. Дезинфекция. Аспетика, антисептика. Действие химических веществ. Химические вещества. Многие химические вещества действуют губительно на микроорганизмы. Такие вещества называют антисептиками. Их действие зависит от концентрации и продолжительности воздействия, а также от рН среды и температуры. Из неорганических соединений наиболее сильно действуют на микроорганизмы соли тяжелых металлов (золота, меди и, особенно, серебра). Например, ионы серебра адсорбируются на поверхности клетки, вызывая изменения свойств и функций цитоплазматической мембраны. Бактерицидным действием обладают многие окислители (хлор, йод, перекись водорода, калий марганцево-кислый), минеральные соли (сернистая, борная, фтористо-водородная). Эти вещества вызывают активные окислительные процессы, не свойственные метаболизму клетки, а также разрушают ферменты. Органические соединения (формалин, фенол, карболовая кислота, спирты, органические кислоты - салициловая, уксусная, бензойная, сорбиновая) также могут губительно воздействовать на микроорганизмы. Органические соединения вызывают коагуляцию клеточных белков, растворяют липиды и т. д. Бактерицидным действием обладают также эфирные масла, дубильные вещества, многие красители (фуксин, метиленовая синь, бриллиантовая зелень). Многие химические вещества используются в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности как дезинфицирующие вещества. Дезинфицирующие вещества вызывают быструю (в течение нескольких минут) гибель бактерий. Они более активны в средах бедных органическими веществами. Уничтожают не только вегетативные клетки, но и споры. Они не вызывают появления устойчивых форм микроорганизмов. В пищевой промышленности в качестве дезинфицирующих веществ применяют вещества, содержащие активный хлор (хлорамин, хлорная известь и т. д.). Применение антисептиков для консервирования пищевых продуктов ограничено, к использованию допущены немногие химические консерванты (бензойная, сорбиновая кислоты и их соли) в малых дозах (от сотых до десятых процента). |