Микробиология. Микра. Типы питания. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на аутотрофы
 Скачать 48.72 Kb.
|
|
Культивирование вирусов в культуре клеток . Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц или других биологических объектов, способны размножаться вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде (`матрасы', флаконы, пробирки и др.). Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и злокачественно перерожденных тканей, обладающих более активной по сравнению с нормальными клетками взрослого организма способностью к росту и размножению. В зависимости от техники приготовления различают три вида культур клеток: + однослойные - клетки, способные прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла лабораторной посуды в виде монослоя; суспензионные - клетки, размножающиеся во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании; органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются ограничено). 14.Бактериофаги.Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные фаги. Лизогенная и фаговая конферсия. Жизненный цикл вирулентных бактериофагов Адсорбция бактериофага Прикрепление фага к бактерии происходит при помощи поверхностных структур бактериальной стенки, служащих рецепторами для вирусов. Например, рецепторы для фагов ТЗ, Т4 расположены в липополисахаридном слое, для Т2 и Т6 — в наружной мембране. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений (например, триптофана для Т2-фага). При избытке фага на одной клетке может адсорбироваться до 200-300 вирусных частиц. Инъекция бактериофага После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом, находящимся в дистальной части отростка. Базальная пластина хвоста лизирует прилегающий фрагмент клеточной стенки, выделяя присутствующий в отростке лизоцим. Одновременно в чехле высвобождаются ионы Са2+, активизирующие АТФазу, что вызывает сокращение чехла и вталкивание стержня хвоста через ЦПМ в клетку. Затем вирусная ДНК впрыскивается в цитоплазму (внедрение вирусной ДНК). Поскольку диаметр канала лишь немного превышает диаметр молекулы ДНК (около 20 нм), то ДНК способна попадать в цитоплазму только в форме нити. Репродукция бактериофага Проникнув в клетку, ДНК фага «исчезает»; уже через несколько минут обнаружить вирус не удаётся. В этот, так называемый скрытый период (эклипс) вирус берёт на себя генетическое управление клеткой, осуществляя полный цикл репродукции фага. К его окончанию составляющие фага соединяются в зрелый вирион. Синтез фаговых белков. В первую очередь синтезируются ферменты, необходимые для образования копий фаговой ДНК. К ним относятся ДНК-полимераза, киназы (для образования нуклеозидтрифосфатов) и тимидилат синтетаза. Они появляются в клетке через 5-7 мин после её заражения. Клеточная РНК-полимераза транскрибирует вирусную ДНК в мРНК, которая транслируется бактериальными рибосомами в «ранние» белки фага, включая вирусную РНК-полимеразу и белки, способные посредством различных механизмов ограничивать экспрессию бактериальных генов. Вирусная РНК-полимераза осуществляет транскрипцию «поздних» белков (например, белков оболочки и эндолизина), необходимых для сборки фаговых частиц дочернего поколения. Некоторые вирусы расщепляют ДНК клетки-хозяина до нуклеотидов, чтобы использовать их для синтеза собственных нуклеиновых кислот. Выход дочерних популяций бактериофага Вновь синтезированные белки формируют в цитоплазме пул предшественников, входящих в состав головок и хвостов дочерних вирусных частиц. Другой пул содержит ДНК потомства. Специальные аффинные области в вирусной ДНК индуцируют объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНК-содержащих головок. Заполненная головка затем взаимодействует с хвостовой частью, образуя функциональный фаг. Весь процесс (от адсорбции до появления вновь синтезированных вирусов) занимает около 40 мин. После образования потомства («урожай», или выход фага, составляет 10-200 из одной инфицирующей частицы) клетка хозяина лизируется, высвобождая дочернюю популяцию. В разрушении клеточной стенки участвуют различные факторы: фаговый лизоцим, увеличенное внутриклеточное давление. Вирус, по-видимому, также стимулирует образование аутолизинов либо блокирует механизмы, регулирующие их синтез (подобные литические факторы выявлены в фаголизатах многих бактерий). По характеру взаимодействия с клеткой бактерии бактериофаги делятся на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги всегда лизируют клетку бактерии. Умеренные фаги могут вызвать лизис клетки бактерии, но могут перейти и в неинфекционную форму. В этом случае молекула ДНК фага прикрепляется к ДНК бактерии и передается с нею дочерним клеткам. Фаг, существующий в такой форме, называется профагом. Клетки бактерии, имеющие в своей хромосоме профаг, называются лизогенными, а явление совместного существования ДНК бактерии и профага называется лизогение 15.примениние бактериофагов в медицине и биотехнологий. Получение препаратов бактериофагов. Бактериофаги используют: в ветеринарии для: профилактики и лечения бактериальных заболеваний птиц и животных; лечения гнойно-воспалительных заболеваний слизистых глаз, полости рта; профилактики гнойно-воспалительных осложнений при ожогах, ранениях, операционных вмешательствах; в генной инженерии: для трансдукции - естественной передачи генов между бактериями; как векторы, переносящие участки ДНК; с помощью фагов можно конструировать направленные изменения в геноме хозяйской ДНК; в пищевой промышленности: в массовом порядке фагосодержащими средствами уже обрабатывают готовые к употреблению продукты из мяса и домашней птицы; бактериофаги применяют в производстве продуктов питания из мяса, мяса птицы, сыров, растительной продукции, и пр.; в сельском хозяйстве: распыление фагопрепаратов для защиты растений и урожая от гниения и бактериальных заболеваний; для защиты скота и птицы от инфекций и бактериальных заболеваний; для экологической безопасности: антибактериальная обработка семян и растений; очистка помещений пищеперерабатывающих предприятий; санитарная обработка рабочего пространства и оборудования; профилактика помещений больниц; проведение экологических мероприятий [3]. Для получения фага содержащий фаг материал (например, испражнения больных дизентерией) засевают в жидкую питательную среду (бульон) и выдерживают в термостате при 37° С 18-20 часов для накопления фага. Затем бульонную культуру фильтруют через бактериальные фильтры для отделения фага от бактериальных клеток. Фильтрат добавляют к свежей культуре дизентерийной палочки, а после ее просветления (свидетельство присутствия и размножения фага и лизиса бактериальных клеток) вновь проводят фильтрацию и добавляют к свежей культуре дизентерийной палочки, т.е. проводят многократное пассирование через культуру чувствительных к фагу бактерий, в результате чего увеличивается количество (титр) выделяемого фага. После накопления достаточного количества фага бульонную культуру вновь отфильтровывают и получают препарат фага. Таким образом, препараты фага – фильтраты бульонных культур лизированных ими бактерий (прозрачные жидкости светло-желтого цвета). Фаги также выпускают в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей и свечей (готовят из фильтратов). |