--ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ. Трансплантация эмбрионов
 Скачать 72.62 Kb.
|
|
С целью исключения длительного воздействия гонадотропинов СЖК на яичники предложено применять антисыворотку на гонадотропины: донора обрабатывают антисывороткой спустя четыре дня после инъекции ГСЖК. При этом, по сообщению Н.И. Сергеева (1986), реагируют суперовуляцией 9,2; выход нормальных эмбрионов с 1,8 возрастает до 4,1. Однако такие результаты достигаются после первых двух обработок ГСЖК; число животных, реагирующих на третью обработку, снижается на 50%, выход годных для пересадки эмбрионов уменьшается до 2,8 на прореагировавшего донора. Более стабильные результаты дает стандартный препарат СЖК (фоллигон) в сочетании с антисывороткой чехословацкого или бельгийского производства: суперовуляцией при этом реагируют около 90% доноров, на каждого из них получают в среднем 7,4 овуляции. Более эффективно применять фолликулостимулирующий гормон (ФСГ-П) с 9-х по 12-е сут полового цикла. Преимуществом этого препарата является то, что при многократной (5—8 раз) обработке число овуляций и нормальных эмбрионов не снижается, а в отдельных случаях даже возрастает. В связи с быстрой инактивацией в организме ФСГ-П вводят дробными дозами (расход препарата на курс обработки — 32—50 мк). Предложено несколько вариантов использования ФСГ-П. Так, В.П. Беляев и др. (1988) получили хороший суперовуляторный ответ при применении ФСГ-П с интервалом 12 ч в убывающих дозах: 8 + 8 + 8 + 5 + 3 + 3 + 2 + 2 мг; через 48 ч от начала обработки корове-донору инъекцировали эстрофан в дозе 2 мг (500 мкг), при этом полиовуляцией реагировало свыше 71% коров со средним числом овуляций 8,7 (извлечено 6,5 эмбриона на донора, из которых 4,8 полноценных). Эстрофан лучше вводить дважды с промежутком 12 ч: первый раз — 500 мкг, второй — 250 мкг. Следует иметь в виду, что около 30% животных не реагируют на ФСГ. Если обработку коров-доноров проводить с учетом индивидуальной реактивности организма на гормональные препараты, суперовуляторный ответ животных можно повысить (В.В. Мадиссон, С.Н. Крылов, 1986). Выявлена положительная связь эмбрионопро-дуктивности и молочной продуктивности у коров-доноров: от коров с более высоким уровнем молочной продуктивности получали эмбрионов больше, чем от менее продуктивных животных. Установлена значительная вариабельность суперовуляции (от 1 до 100 фолликулов) в зависимости от вида, качества, дозы, времени, кратности применения препарата, метода обработки животных, таких генетически детерминированных факторов, как уровень фол-ликулогенеза, количество первичных фолликулов, способных реагировать на гормональную обработку, иммунная реактивность организма, а также от породной принадлежности, возраста, лактационного статуса, состояния здоровья животного, размеров яичников и их чувствительности к гонадотропину, условий кормления и содержания доноров (Яблонский В.А., 1988). Существует несколько схем обработки коров-доноров. Схема 1. 10—12-е сут полового цикла — нативный препарат ГСЖК - 3000-3800 ИЕ, хормогон в смеси с ГСЖК - 500 ИЕ; 12-14-е сут — простагландин — 500—30 мкг/мг; 14—16-е сут — охота, осеменение; 21—23-е сут — извлечение эмбриона. Схема 2. 2-е сут полового цикла — витамин А — 150 000 МЕ, витамин Е— 100 мг, водистый калий — 100—200 мг; 10—12-е сут — на- тивный препарат ГСЖК — 3000—3800 ИЕ, витамин А — 7500 ИЕ, витамин У — 50 мг; 12—14-е сут — простагландин — 500—30 мкг/мг; 14—16-е сут — охота, осеменение; 21—23-е сут — извлечение эмбрионов. Схема 3. 8-е, 9-е, 10-е, 11-е, 12-е сут полового цикла — ФСГ-П — по 10 мг; 13-е сут — охота, осеменение; 20-е сут — извлечение эмбрионов. При так называемом методе вызывания суперовуляции на 16— 17-е сут полового цикла корове вводят 1500—3000 ИЕ ГСЖК. Уже на 2-е сут у животных появляется охота. Чтобы ее легче выявлять, на 10-е и 20-е сут им вводят по 10 мг экстрадиола бензоата, а на 21-е сут — в день охоты — внутривенно 1500—300 ИЕ хориального гонадотропина. Как уже упоминалось, в настоящее время обработку гонадотропинами проводят в лютеиновую фазу цикла. При этом сначала донорам вводят простагландин (однократно или, что лучше, двукратно с промежутком в 11 сут), определяют время появления охоты (примем эти сутки за «нулевые») и на 8—13-е сут после этого, т.е. в активную лютеиновую фазу, инъекцируют 1500—3000 ИЕ ГСЖК. На этом принципе основывается «датский» метод применения про-стагландина (или его аналога), вызывающего лютеолистический эффект и овуляцию. Для увеличения выхода эмбрионов и их биологической полноценности коровам-донорам вводят также витаминные препараты (А — 120—150 тыс. МЕ, Е — 80—100 мг), микроэлементы (йодистый калий — ежедневно с кормом по 100—200 мг). Французская схема подготовки доноров предусматривает предварительную синхронизацию у них охоты с помощью синхромата Б (новый простагландин, содержащий в своем составе аналог прогестерона и эстрадиола). Препарат имплантируют донору под кожу уха. На 9-е сут имплант удаляют. На 11-е сут у животного наступает охота. На 10—22-е сут доноров осеменяют и на 33-е сут извлекают эмбрионы. Ярко выраженная охота у доноров свидетельствует о хорошей реакции их яичников на гормональные препараты. Установить приблизительное количество созревших фолликулов в процессе осеменения трудно. Лучше это сделать после овуляции по количеству образовавшихся желтых тел и числу извлеченных эмбрионов и яйцеклеток. При отсутствии у коров реакции на гормональную обработку их исключают из числа доноров. Чтобы вызвать суперовуляцию у овец-доноров им вводят на 12— 13-е сут полового цикла сывороточный гонадотропин 700—1500 ИЕ. Охота наступает через 2—4 сут, у 74—100% обработанных овец наблюдается суперовуляция. В начале течки можно вводить внутривенно зоз 500—100 ИЕ ХГЧ (хорионического гонадотропина) (Влахов К.Н., 1982). Неплохие результаты получают при введении на 11-е сут полового цикла 12 000 ИЕ СЖК, а через 68 ч — 260 мкг простагландина. При этом происходит от 3 до 38 овуляций (Аверилл Р.Л., 1958; Сергеев Н.И. идр., 1984). У свиней суперовуляцию вызывают применением ГСЖК в дозе 600—800, при этом число овуляций достигает 33—38. Для стимуляции полиовуляции у кобыл им вводят 2000—3000 ИЕ ХГЧ. Осеменение самок-доноров. После гормональной обработки самок-доноров в период стадии полового возбуждения (во время фазы половой охоты до наступления овуляции) их подвергают осеменению. В настоящее время воспроизводство стада сельскохозяйственных животных базируется на широком использовании метода искусственного осеменения. У коров, обработанных гонадотропинами в фолликулиновую стадию (на 15—16-е сут полового цикла), охота наступает через 3— 7 сут. У коров же, подвергнутых комбинированной обработке гонадотропинами и простагладином Ф-2 альфа в лютеиновую фазу полового цикла, охота наступает через 36—75 ч после инъекции простагландина и длится в среднем 24 ч (до 36—48 ч). Для ее обнаружения проводят пробу на охоту через каждые 3—4 ч. Овуляция начинается спустя 54—60 ч после введения простагландина; она растягивается до двух суток. Искусственно осеменять коров надо через 8—12 ч после обнаружения охоты (Ньюкомб, 1980 — не позже 48 ч после применения простагландинов), повторно — через 12 ч; при затянувшейся охоте проводят третье (а возможно, и четвертое) осеменение через такой же промежуток времени. Если начало охоты не удалось установить, корову-донора осеменяют в фиксированное время — через 56 и 72 ч после инъекции простагландина. Для искусственного осеменения коров-доноров используют высококачественную сперму быков-производителей, оцененных по качеству потомства и признанных улучшателями. Применяют цервикальный способ искусственного осеменения с ректальной фиксацией шейки матки; в дозе вводимой спермы должно быть не мене 40—50 млн активных спермиев. Искусственное осеменение овец проводят: в августе-сентябре — для получения зимнего ягнения и в октябре-ноябре — для достижения весеннего ягнения с завершением всей работы в течение 35—40 сут. Отбор маток в охоте начинают рано утром при помощи баранов-пробников. Осеменяют овцематок в период охоты дважды: утром — вскоре после установления у них феномена охоты, повторно — вечером того же дня или (при продолжающейся охоте) на следующее утро. Искусственное осеменение осуществляют визоцер-викальным способом с использованием влагалищного зеркала и стеклянного шприца-катетера или шприца-полуавтомата. Вводят в цервикальный канал на глубину 1—2 см от 0,06 (свежеполученной) до 0,1—0,2 мл (разбавленную) сперму с содержанием в дозе не менее 50 млн активных спермиев (активность спермиев свежеполученной спермы должна быть не менее 8 баллов, сохраняемой кратковременно — не ниже 7 баллов). Искусственное осеменение свиней проводят в следующие сроки: 1) при трехкратном в течение дня выявлении у свиноматок фазы половой охоты — однократно в среднем через 24 ч после начала охоты; 2) при двукратном в течение дня выявлении у свиноматки охоты — первый раз — спустя 12 ч после установления признаков охоты, повторно — через 12 ч; 3) при однократном в течение дня выявлении свиноматок в фазе половой охоты (утром) — сразу после ее установления и повторно через 24 ч. Применяют два способа внутриматочного искусственного осеменения: 1) осеменение разбавленной спермой по технологии ВИЖ при помощи прибора ПОС-5 (вводят сперму в объеме 1 мл на 1 кг массы животного, но не более 150 мл, содержащую 3—5 млрд активных спермиев); 2) фракционный способ осеменения при помощи универсального зонда УЗК-5 (вводят 40—50 мл неразбавленной или слегка разбавленной спермы, содержащей 2—3 млрд активных спермиев, а затем от 70—80 до 100 мл солевого раствора). Для осеменения используют сперму активностью: свежеполученную — активностью не менее 7 баллов, кратковременно сохраняемую — активностью не менее 6 баллов. Искусственное осеменение кобыл проводят при наличии у них фолликула 3-й и 4-й стадий зрелости (при ярком проявлении признаков охоты 3-й и 4-й ступени) и повторяют каждые 24 ч до наступления овуляции и затухания признаков охоты. Осеменяют кобыл внутриматочно при помощи резинового или эбонитового катетера со стеклянным шприцем вместимостью 30—40 мл. В дозе спермы (от 25 до 45 мл) должно быть не менее 300 млн активных спермиев. Активность спермиев должна быть: в свежеполученных эякулятах — активностью не менее 6 баллов, в замороженной и оттаянной сперме — активностью не менее 2 баллов. Извлечение эмбрионов. Так как при суперовуляции фолликулы вскрываются не одновременно, то и оплодотворение яйцеклеток и прохождение их по яйцеводу растягивается во времени. На 4— 5-е сут основное количество эмбрионов перемещается из яйцепро-вода в рог матки, хотя около 10% из них могут задерживаться в яйцепроводе до 8-х сут. Постепенно эмбрионы смещаются от верхушки рога матки к его передней части и на 7—8-е сут здесь оказывается около 73% их количества, примерно 20% задерживается в средней части рога, а 7% — в яйцепроводах. До 8—9-х сут эмбрионы пребывают в свободном состоянии. У коров-доноров на шестые-седьмые сутки после осеменения осторожной пальпацией через прямую кишку подсчитывают количество желтых тел, определяют степень их развития. После этого эмбрионы извлекают. Извлечение эмбрионов у животных-доноров можно осуществлять двумя методами: хирургическим и нехирургическим. До середины 1970-х гг. эмбрионы у коров извлекали в основном хирургическим методом, добывая их из яйцевода или рога матки, в зависимости от того, на какой стадии проводили операцию. При применении хирургического метода донора выдерживают 1—1,5 сут на голодной диете, а за 6 ч до операции исключают водопой. Предложено несколько оперативных доступов: по белой линии живота, в области голодной ямки (слева или справа), через верхний слой влагалища. Хирургическое извлечение эмбрионов путем лапаротомии по белой линии чаще проводят у телок, в условиях хорошо оборудованной клиники. Премедикация включает внутимышечную инъекцию 2 мл рам-пуна, 4 мл 0,1 %-го раствора атропина или 4 мл комбелена. Животное фиксируют на операционном столе в спинном положении. Операцию проводят под общим наркозом (внутривенно 10%-й раствор хлоралгидрата из расчета 100 мл на 100 кг массы животного). После обезболивания и подготовки операционного поля делают разрез живота длиной от 15 до 30 см по белой линии как можно ближе к тазу (спереди молочной железы). Осуществив разрез брюшины, вводят руку в брюшную полость, отыскивают и извлекают один рог матки вместе с яйцепроводом и яичником, в котором подсчитывают количество желтых тел. Тело фиксируют в раневом отверстии. Для извлечения эмбриона матку промывают большим количеством жидкости. Вымывание эмбрионов можно проводить маточным или маточно-яйцепроводным способом. В обоих случаях сначала делают небольшой разрез стенки рога матки вблизи ее тела, через него вставляют катетер Фолли и продвигают к верхушке рога. В баллончик-манжетку катетера нагнетают 20—30 см воздуха. При использовании маточного способа прокалывают верхушку рога матки иглой, через нее вводят шприцем подогретую до 37°С промывную жидкость — среду Дюльбекко с добавлением 1%-го бычьего альбумина или стерильной сыворотки (в просвет рога вводят порционно до 120 мл жидкости). Вытекающую через катетер Фолли промывную жидкость собирают в стерильный флакон (пробирку) вместимостью 150 мл. Аналогично поступают с другим рогом матки. зоб Маточно-трубный способ отличается тем, что для вымывания эмбрионов тупую иглу с эластичным шлангом (резиновую или стеклянную канюлю) вставляют в ампулу яйцевода со стороны воронки и через нее подают промывную жидкость, которая проходит через яйцепровод, рог матки и по катетеру Фолли (рис. 12.6) попадает в стерильный сосуд. Катетер Фолли Рис. 12.6. Катетер Фолли Хирургическое извлечение эмбрионов путем лапаротомии в области голодной ямки является наиболее простым и наименее трудоемким методом. Его можно проводить под местной анестезией. Корову-донора фиксируют в стоячем положении, по общепринятым хирургическим принципам подготавливают операционное поле. Премедикацию проводят путем внутимышечного введения 0,7 мл рампуна. Применяют паралюмбальную анестезию 2%-м раствором новокаина (по И.И. Магда) в сочетании с инфильтрационной анестезией по линии разреза брюшной полости. Последний начинают на уровне тазобедренного сустава, отступив от него вперед на 2 см (на расстоянии 8 см спереди линии коленного сустава между наружным бугром подвздошной кости и задним краем ребра, на 10 см ниже поперечно реберных отростков поясничных позвонков). Вымывание эмбрионов проводят так же, как описано выше. Закончив вымывание, матку возвращают на место, брюшную полость орошают физраствором, вводят в нее 1 млн ЕД пенициллина и стрептомицина, рану брюшной стенки припудривают порошком трициллина и зашивают с последующей обработкой раствором йода и наложением клеевой повязки. Через две недели швы снимают. Хирургический метод извлечения эмбрионов через разрез верхнего свода влагалища (трансвагинальный метод) применяется в тех случаях, когда вследствие анатомических особенностей строения шейки матки нельзя осуществлять нехирургическое извлечение эмбрионов. Такой метод пригоден лишь для одноразового использования донора. Животное фиксируют в станке и подсчитывают количество желтых тел в каждом яичнике. Перинеальную область моют мыльным раствором, дезинфицируют 70%-м спиртом. Премедикацию проводят путем внутимышечной инъекции 0,7 мл рампуна, 4 мл комбелена или 4 мл 0,1%-го атропина и эпидурального введения 5—10 мл 2%-го раствора новокаина между последним крестцовым и первым хвостовым позвонками. Через 10—15 мин отводят хвост в сторону, фиксируют его с помощью бинта; внутреннюю поверхность влагалища орошают 2%-м раствором диоцида. Тщательно моют руку мылом со щеткой, обрабатывают ее раствором нашатырного спирта и протирают 5%-м раствором йода. Берут в руку скальпель, зажимают его между сложенными конусом пальцами и вводят ее во влагалище. Делают с одной стороны шейки дорзальный разрез свода влагалища длиной 2—3 см. Извлекают из влагалища скальпель, через разрез вводят в брюшную полость сначала два пальца, затем поочередно остальные и всю руку. Специально подготовленной тупой иглой диаметром 1 — 2 мм прокалывают возле бифуркации рог матки, соединенный с яичником, содержащим желтые тела. Через образовавшееся отверстие вводят конец катетера с баллончиком для вымывания эмбрионов. Нагнетают в баллончик 7—10 см3 воздуха, с помощью шприца вливают в рог матки промывную жидкость температурой 37°С и отсасывают ее обратно. Продолжительность промывания — 25—30 мин; при этом удается собрать около 70% эмбрионов. Для трансвагинального извлечения эмбрионов также можно использовать специальный инструмент, состоящий из металлической канюли с двумя латеральными отверстиями, соединенной с латексным катетером Фолли. Надевают на средний палец кольцо инструмента и вводят руку через разрез влагалища в брюшную полость. Доходят до нижней трети рога матки, вставляют канюлю в его просвет и производят вымывание. Во время промывания вынимают палец из кольца, приподнимают верхушку рога и передавливают пальцами маточно-трубное соединение. Рана в стенке влагалища заживает примерно через 4 сут после операции. Животное фиксируют в станке. Делают продольный разрез свода влагалища и через него вводят осторожно кастрационные шприцы или эфеменатор. Захватывают рукой подлежащий удалению рог матки вместе с яйцепроводом, брыжейкой и яичником и вкладывают его в раскрытый прибор. Проверив правильность размещения удаляемого участка гениталий, легким нажатием руки закрывают эфе-минатор и быстро завинчивают барашковую часть гайки, отделяют ампутированную часть и удаляют ее из брюшной полости. Пережимают культю рога матки кровоостанавливающим пинцетом. Аналогично удаляют второй рог матки. Эфеменатор оставляют закрытым на 5 мин, затем вынимают вместе с ампутированными тканями. Вводят в брюшную полость через разрез влагалища смесь антибиотиков. Ампутированные ткани переносят в лабораторию, осматривают их, подсчитывают количество желтых тел и неовулировавших фолликулов, промывают со стороны яйцепровода в направлении открытого конца рога матки, собирая промывную жидкость в стерильные чашки Петри. На промывание одного рога расходуют 20—60 мл, яйцепровода — около 10 мл среды. |