--ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ. Трансплантация эмбрионов

• Название: Трансплантация эмбрионов
• Дата: 13.05.2019
• Размер: 72.62 Kb.
• Имя файла: --ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ.docx
• Тип: Документы; #76905
• страница: 5 из 5

Биологически полноценные эмбрионы в оптимальных условиях культивирования сохраняют жизнеспособность 24—48 ч. В конце культивирования эмбрионы оценивают под микроскопом, жизнеспособные используют для пересадки.

На ранних стадиях развития эмбрионы можно хранить при невысоких плюсовых температурах, вызывающих обратное торможение метаболических процессов. Имеются сообщения о том, что температура 10°С позволяет продлять жизнеспособность эмбрионов до 5—6 сут. Наиболее чувствительны к охлаждению эмбрионы свиней, жизнеспособность которых резко снижается при 10—15°С. Чувствительны к охлаждению и эмбрионы крупного рогатого скота, особенно на стадии 8—16 бластомеров, хотя на стадии морулы и бластоцисты они хорошо переносят охлаждение.

Кратковременное хранение и культивирование эмбрионов (3—5 сут) в организме (яйцепроводах крольчих) при температуре тела позволяет совершать их межконтинентальные перевозки с последующей ретрансплантацией. Установлено, что пересаженные хирургическим путем в яйцепроводы крольчих эмбрионы овцы развиваются нормально до вылупления из прозрачной оболочки или имплантации. Полагают, что эмбрионы крупного рогатого скота на стадии восьми бластомеров и морулы можно также культивировать до 72—96 ч in vitro, а затем до 7 сут в перевязанных яйцепроводах крольчихи. Недостатком метода является повышенный риск травмирования в связи с увеличением числа вымывания и пересадок.

Криоконсервация (замораживание) эмбрионов. В 1953 г. О. Смит впервые заморозил эмбрионы кролика. В 1971 — 1972 гг. за рубежом были начаты целенаправленные опыты по замораживанию эмбрионов животных и человека (Р. Виттингем, Д. Вильмут, Л.Е.А. Роусон, Виледсен и др.). В СССР криоконсервация эмбрионов впервые осуществлена в 1979 г.

У крупного рогатого скота для замораживания наиболее пригодны 7—8-суточные эмбрионы отличного и хорошего качества, т.е. находящиеся на стадии бластоцисты (60—150 бластомеров, дифференцированных на эмбриобласт и трофобласт).Эмбрионы овец и коз замораживают на стадии морулы и бластоцисты на 5—8-е сут, эмбрионы свиней — на 4—5-е сут. Лучше переносят замораживание свежие эмбрионы.

Инструкцией по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (1987) предусмотрено проведение замораживания при помощи отечественного автоматического программного устройства УОП-1, который состоит из электронного блока, камеры и емкости с жидким азотом.

Отобранные эмбрионы насыщают криопротектором — глицерином или диметилсульфоксидом (ДМСО). Криопротектор вводят в состав среды во избежание кристаллизации воды. Применяемые технологии замораживания предусматривают последовательное перемещение эмбрионов в растворы криопротектора возрастающих концентраций (глицерина — 0,25; 0,50; 0,75; 1,0 М; ДМСО — 0,35; 0,50; 1,0 и 1,5 М), приготовленные на фосфатном буфере Дюльбекко с добавлением 20% сыворотки крови и пенициллина. В каждом растворе эмбрионы выдерживают 5—10, а в последнем — 15—20 мин. Эмбрионы отличного качества можно сразу поместить на 30 мин в 1,0 м раствор глицерина или 1,5 М раствор ДМСО.

В.А. Яблонский (1988) указывает: если в качестве криопротектора используют глицерин, то вначале помещают эмбрионы на 10 мин в 3,3%-й раствор глицерина, затем на 14 мин — в 6,6%-й и на 30 мин — в 20%-й. В середине срока выдержки эмбрионы промывают в течение 5 мин путем ряда всасываний в пастеровскую пипетку и выпусканий. Указанные манипуляции с эмбрионами проводят на помещенных в чашки Петри часовых стеклах.

После насыщения среды с эмбрионами криопротектором ее переносят (по 1—4 эмбриона с 0,3—0,4 мл среды с криопротектором) в пробирки, ампулы или пайеты, их герметизируют (пробирки закрывают фольгой, ампулы запаивают, пайету закрывают с обоих концов пластиковыми пробками) и замораживают одно- или двухэтажным методом, медленно или быстро, поместив в программный замораживатель. В пайеты эмбрионы помещают в следующей последовательности: среда—воздух—среда и эмбрион—воздух—среда.

Медленное замораживание эмбрионов проводят так. Охлаждают эмбрионы с 20 до 6—7°С со скоростью ГС/мин. После достижения заданной температуры (за 4—5°С до начала льдообразования) для предотвращения осмотических изменений вызывают искусственную кристаллизацию среды. Это обеспечивается посредством введения в раствор зерен льда, кристаллина йодистого серебра или какого-либо переохлажденного предмета (например, охлажденным в жидком азоте пинцетом или пипеткой с намерзшей на конце каплей среды, проколов фольгу, быстро прикасаются к поверхности жидкости либо стенке пробирки или ампулы в зоне верхнего края столбика среды). Дальнейшее охлаждение ведут со скоростью 0,3°С/мин от -35 до -36°С, после чего быстро погружают в жидкий азот.

Медленно замороженные эмбрионы перед использованием подвергают оттаиванию на спиртовой бане — в стеклянной цилиндрической колбе температурой -50°С, в которую помещают пробирки или ампулы с эмбрионами. Оттаивание проводят при комнатной температуре со скоростью 4°С/мин до -10°С, после чего эмбрионы переносят на 5 мин на водяную баню температурой 20°С. Наконец эмбрионы переносят в среду, используемую для удаления криопротектора.

Технология быстрого замораживания эмбрионов, предложенная во Франции, основана на использовании среды (фосфатный буфер Дюльбекко + сыворотка крови), содержащей глицерин и сахарозу. Она заключается в следующем. В пайету последовательно засасывают 0,5 М раствора сахарозы, воздух, 1,0 М раствор глицерина с эмбрионом, воздух, 0,5 М раствора сахарозы. Охлаждают эмбрионы с 20°С до -7°С со скоростью ГС/мин, стимулируют искусственную кристаллизацию, после чего их охлаждают со скоростью 0,3°С/мин от -35 до -36°С, а затем со скоростью 0,1 °С/мин до -60°С и переносят в жидкий азот.

Оттаивают быстро замороженные эмбрионы (перед использованием) на водяной бане температурой 37°С в течение 30 с со скоростью 3°С/мин или в течение 10—12 с. Для этого пайету (пробирку, ампулу) быстро извлекают из канистры, погруженной в жидкий азот, и опускают в водяной термостат.

Оттаявшие эмбрионы вместе со средой переносят из пробирки или ампулы на часовое стекло для морфологической оценки. При нормальном качестве эмбрионов их отмывают от грицерина или ДМСО, последовательнно помещая в заранее приготовленные растворы криопротектора убывающей концентрации. На заключительном этапе их трижды промывают в среде без глицерина и выдерживают в ней 10—20 мин. По окончании промывания эмбрионы вновь оценивают на жизнеспособность, признанные годными заправляют в инструмент для пересадки.

Пайету после оттаивания 3—4 раза встряхивают для удаления пузырьков воздуха и смешивания ее содержимого, после чего оставляют на 15 мин в вертикальном положении. Подлупой сквозь стенку пайеты отыскивают эмбрион и оценивают его жизнеспособность.

В НИИ животноводства лесостепи и полесья УССР предложена следующая технология консервации: свежевымытые на стадии мо-рулы эмбрионы переносят на 10 мин в 0,5 М раствор ДМСО на среде ФБС, затем на 20 мин в такую же среду с 1,3 М ДМСО, после этого по 3—4 зародыша переносят в пробирку, содержащую 0,5 мл ФБС и 1 М ДМСО. Пробирку герметизируют и помещают в аппарат для охлаждения и замораживания. Для большего удобства эмбрионы можно помещать в специальные мини-пайеты, в которые сначала набирают '/4 объема среды с зародышем, затем пузырек воздуха и '/4 объема среды ФБС. После этого пайету герметизируют и переносят в аппарат для замораживания.

Замораживание проводят по следующей программе: с 22—25 до 6°С охлаждают со скоростью ГС/мин, искусственно возбуждают кристаллизацию среды, замораживают с -6 до -40°С со скоростью 0,3°С/мин, а с -40 до -60°С — со скоростью 0, ГС/мин, после чего переносят пробирки с охлажденными до -60°С эмбрионами в жидкий азот.

В ряде стран разработаны свои технологии замораживания и оттаивания эмбрионов — двухступенчатые, одноступенчатые, в соломинках, пайетах, содержащих одновременно две среды — для замораживания (жидкость Дюльбекко с 10%-м глицерином и находящимся в ней эмбрионом) и среды для оттаивания (жидкость Дюльбекко, содержащая 20% фетальной сыворотки или 4 г/л бычьего альбумина и 0,5 М раствор сахарозы). После оттаивания среды смешивают, выдерживают пайету 10—20 мин при комнатной температуре и пересаживают эмбрион рецепиенту.

Всю работу по приготовлению среды и замораживанию эмбрионов проводят с соблюдением требований асептики.

Замороженные эмбрионы хранят в заправленном жидким азотом сосуде Дьюара (например, марки «Харьков 34Б»), в котором их размещают в специальных канистрах.

После замораживания и оттаивания жизнеспособность сохраняет 44—63% эмбрионов.

Синхронизация стадии возбуждения полового цикла (охоты). Для

пересадки свежеполученных эмбрионов необходимо обеспечить проявление охоты у доноров и реципиентов. Сущность синхронизации сводится к применению отдельных приемов или гормональных средств для регулирования половой функции у реципиентов и доноров, чтобы вызвать у них одновременно стадию полового возбуждения в заранее намеченное время.

В больших стадах ежедневно бывает достаточное количество животных в состоянии охоты. Однако трудно предвидеть у скольких самок и когда она наступит. Поэтому в практических условиях чаще всего прибегают к искусственной стимуляции стадии возбуждения полового цикла и ее синхронизации у реципиентов. С этой целью чаще всего используют гормональные методы, в основе которых лежит стимулирование либо пролонгирование функции желтого тела или, наоборот, угнетение его функции.

В первом случае применяют инъекции прогестерона или различные методы введения его синтетических аналогов — прогеста-генов (хлормадинона ацетата, или КАП, медроксипрогестерона, или МПА, меленгестрол ацетата, или МГА, мегестрол ацетата, амола, диамола 1С1-79939, 1С1-80996 и др.), которые блокируют гонадотропную функцию гипофиза, не нарушая синтез ФСГ и Л Г, поддерживая существование желтого тела и высокий уровень прогестерона в крови. Фолликулы при этом созревают только до второй стадии, наступление же течки, охоты, общей реакции и овуляции тормозится. Прекращение введения животным прогестерона или проге-стагенов сопровождается интенсивным выделением гипофизарных гормонов и появлением у самок стадии возбуждения полового цикла.

Однако время наступления стадии возбуждения полового цикла у животных широко варьирует — от 2 до 6 сут, оплодотворяемость яйцеклеток снижается. Поэтому синхронизация половой функции указанным методом имеет ограниченное значение в технологии трансплантации эмбрионов. Ее вытеснила синхронизация половой цикличности с помощью простагландинов группы Ф2 и его синтетических аналогов — простина (США), клопростенола, эструмата (Великобритания), эстрофана (Чехословакия), энзапроста (Венгрия) и др., которые, обладая выраженным лютеолитическим и утерото-ническим действием, вызывают морфологическую и функциональную регрессию желтого тела и контролируют таким образом продолжительность полового цикла.

Разработано несколько схем синхронизации стадии возбуждения полового цикла (охоты) у коров (телок). Одна из них предусматривает две инъекции эстрофана с интервалом 11 сут. Повторно

эстрофан вводят на 2-е сут после инъекции донору ГСЖК или на 3-й сут после начала обработки ФСГ-П. При использовании любой из схем проводят витаминизацию реципиента: инъецируют внутримышечно тривитамин или тривит в дозе 15 мл на 1 -е, 10— 12-е и 21 — 23-е сут.

За животными-донорами ведут наблюдение для обнаружения признаков течки и полового возбужения, их три раза проверяют на наличие охоты. Реципиента закрепляют за донором в случае полного совпадения у них сроков начала охоты. В день пересадки эмбрионов ректальной пальпацией яичников доноров и реципиентов убеждаются в наличии функционально активного желтого тела.

Синхронизацию охоты у овец и коз в настоящее время проводят:

1) с помощью прогестагенов в виде подкожных имплантантов или влагалищных лессариев (мелкопористых полиуретановых губок, пропитанных прогестагеном);

2) посредством двукратной инъекции простагландинов группы Ф2 с 9—10-суточным интервалом;

3) используя формирование групп реципиентов из числа овец, проявивших охоту в тот же день, что и доноры.

Синхронизацию охоты у свиноматок осуществяют путем аппликации прогестагенов после отъема поросят или введения гонадотропинов лактирующим маткам. При этом молодым свиноматкам вводят 900—1800 мг ГСЖК, а через 2 сут 500 ИЕ ХЧГ; циклирующим свиноматкам вводят гормональные препараты по одной из следующих схем:

• ГСЖК на 16-е сут и ХГЧ на 19-е сут цикла;

• металлибур на 20-е сут, ГСЖК на 21-е сут и ХГЧ на 23-е сут;

• прогестин тренболон с 19-х по 21-е сут, ГСЖК через 6 ч после

последней дачи прогестагена и через 78 ч — ХЧГ;

• с 14-х по 20-е сут оксольвен, через 24 ч сурфогон (400 МЕ ГСЖК,

200 ИЕ ХГЧ) и через 70 ч после последнего введения гестагена —

ХГЧ.

Старым свиноматкам вводят ГСЖК в день отъема поросят или через 1 сут и через 2—3-є сут — ХГЧ. Можно начинать стимуляцию и на 18-е сут после отъема поросят.

Охоту у кобыл синхронизируют путем индивидуальной дачи с кормом прогестагена альтреногеста в дозе 0,044 мг/кг ж.м. в течение 15 сут или применения аналога простагландина флупростенола (эквимат) в дозе 25 М/кг с 14-суточным интервалом. Для стимуляции овуляции кобылам дополнительно вводят 2000—3000 ИЕ ХГЧ.

Пресадка (трансплантация) эмбрионов. До середины 1970-х гг. пересадку эмбрионов проводили в основном хирургическим методом, затем постелено стали переходить на нехирургический. Каждый из них имеет положительные и отрицательные стороны.

Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота. Хирургический метод пересадки эмбрионов является полостной операцией, проводить которую следует в операционной, оборудованной универсальным фиксационным станком или операционным столом. Доступ к матке обеспечивается с помощью лапаротомии по белой линии живота под общим наркозом на лежащем в спинном положении животном или в области подвхдоха (голодной ямки) под местной анестезией. Подготовка животного к операции и операционный доступ к матке такие же, как при вымывании матки. Пересадка эмбрионов через разрез брюшной стенки в области правой или левой голодной ямки значительно проще и менее трудоемка.

В качестве инструмента для пересадки эмбрионов можно использовать модифицированную пастеровскую пипетку с воронкообразным расширением на конце капилляра и герметической резиновой насадкой на противоположном конце. В пипетку сначала набирают столбик среды Дюльбекко (1,5—2 см), затем такой же столбик воздуха, после чего засасывают эмбрион со средой и опять столбик воздуха и столбик среды. На пипетку надевают стерильный полиэтиленовый чехол или накрывают ее стерильной салфеткой и сохраняют в боксе в горизонтальном положении до пересадки.

Открыв доступ к внутренним органам, рог матки, прилегающий к яичнику с функционирующим желтым телом, подтягивают к разрезу, делают прокол стенки концом капиллярной трубки (или тупой иглой диаметром 1 — 1,5 см, или молочным катетером с последующим введением в отверстие капилляра пипетки) примерно в 5 см от маточно-трубочного соединения и выдавливают содержимое пипетки в просвет рога матки, на его слизистую оболочку. При этом нельзя касаться стенок матки; надо избегать повреждения сосудов и кровотечения.

При необходимости так же переносят второй эмбрион в другой рог матки. Закончив пересадку, проверяют, заняла ли матка исходное положение, и вводят в брюшную полость 250 мл физраствора с антибиотиками (до 500 тыс. ЕД пенициллина и стрептомицина в 50 мл раствора новокаина). Накладывают трехэтажный шов и клеевую повязку, оставляют реципиента под наблюдением в течение двух недель.

После хирургической трансплантации 52—90% (в среднем около 60%) коров становится стельными. Учитывая высокую эффективность хирургической пересадки эмбрионов, во многих центрах США, Канады, Австралии пользуются преимущественно этим методом. Следует, однако, иметь в виду, что нанесенные животному травмы вследствие резекции мыщц, невозможность многоразового использования животного, сложности самой операции сдерживают широкое распространение хирургического метода.

М.И. Прокофьев, В.Я. Ярных (1986) предложили способ и прибор для пересадки эмбрионов через прокол стенки таза на фоне низкой эпидуральной анестезии. Прокол рога и введение эмбриона контролируют рукой через прямую кишку.

Суги (1965) сконструировал инструмент, с помощью которого можно вводить эмбрионы в матку через отверстие в своде влагалища, минуя цервикальный канал.

Желание упростить технику пересадки эмбрионов привело к разработке нехирургического метода, предусматривающего перенос эмбриона в рог матки через цервикальный канад, т.е. по принципу искусственного осеменения. Первые опыты по нехирургической пересадке эмбрионов были проведены в начале 1960-х гг. Предложено несколько модификаций нехирургического метода пересадки эмбрионов. Трансплантацию эмбрионов реципиентам проводят на 7— 8-е сут после окончания охоты.

При разработке технологии нехирургической пересадки эмбрионов учитывали следующие особенности. Во-первых, ко времени пересадки цервикальный канал у реципиента плотно закрыт, чувствительность рецепторов повышена, в связи с этим в ответ на механическое раскрытие цервикального канала активизируется сократительная функция миометрия, что может привести к выбросу эмбриона. Во-вторых, в лютеиновую фазу полового цикла эндометрий отличается повышенной чувствительностью к микробному фактору. В-третьих, возможны повреждение кровеносных сосудов и попадание в полость рогов матки крови, которая обладает эмбриотокси-ческим действием.

Перед пересадкой эмбриона реципиента фиксируют в станке, хвост бинтуют и подвязывают к шее животного, область наружных половых органов и промежность моют теплой водой с мылом, дезинфицируют 2%-м раствором диоцида или 70%-м этиловым спиртом, делают низкую сакральную эпидуральную анестезию 2%-м раствором новокаина (5 мл), а сильновозбудимым животным также вводят миорелаксант комбелен (0,5 мл). Для блокирования рецепторов матки и предотвращения отторжения эмбриона предложено применять внутримышечно препарат ханегиф.

Применяемые в настоящее время инструменты состоят в основном из металлического катетера, длинной капиллярной трубки, в передней части которой имеется приставка для помещения эмбриона в минимальный объем среды. Вводят катетер в рог матки под постоянным контролем руки через прямую кишку (как при цервикальном осеменении с ректальной фиксацией шейки матки) и выдавливают зародыш из приставки на слизистую оболочку матки.

Нехирургическую пересадку эмбрионов можно проводить при помощи модифицированного металлического катетера Кассу (рис. 12.8), состоящего из трубки, толкателя и навинчивающегося наконечника. Прибор стерилизуют кипячением в течение 30 мин, дают ему высохнуть и до начала эмбриопересадки выдерживают в настольной бактерицидной камере с включенной лампой. Благодаря определенной гибкости инструмент позволяет вводить эмбрионы в среднюю часть рога матки. Рэсбек модифицировал инструмент, благодаря чему его можно вводить в любой участок рога матки.