--ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ. Трансплантация эмбрионов
 Скачать 72.62 Kb.
|
|
Извлечение эмбрионов из гениталий убитых животных — самый простой метод. На бойне (мясокомбинате) вынимают из убитых животных половые органы, доставляют их в лабораторию, где в зависимости от времени, прошедшего после осеменения, промывают описанным выше методом рога матки или яйцепровода. Вымывание эмбрионов из множества убитых животных бывает эффективным, если после убоя прошло не более 2—2,5 ч. Хирургические методы сложны, трудоемки, их можно использовать в отношении одного животного не более трех раз. Нехирургическое извлечение эмбрионов — наиболее приемлемый для практических условий (на животноводческих фермах) метод. Перед вымыванием эмбрионов донора желательно выдержать 12 ч на голодной диете. Животное фиксируют в станке, делают низкую эпидуральную анестезию, прямую кишку освобождают от фекалий. Определяют количество желтых тел в каждом яичнике. Хвост бинтуют, подвязывают к шее животного. Область наружных половых органов и промежность моют теплой водой с мылом, высушивают салфеткой и дезинфицируют 70%-м этиловым спиртом или аэрозолем «Септонекс». Оптимальным сроком нехирургического извлечения эмбриона являются седьмые-восьмые сутки после осеменения, когда он расположен в передней и средней части рога матки, а маточно-яйцепроводное соединение плотно закрыто. Под контролем руки в полиэтиленовой перчатке, находящейся в прямой кишке, двухходовый урологический катетер Фолли со вставленным металлическим стилетом вводят в цервикальный канал. Его направляют в один из рогов матки, продвигая до тех пор, пока баллон-манжетка не окажется за бифуркацией, а конец катетера достигнет верхушки рога. Стилет извлекают. В баллон-манжетку нагнетают 15—20 см3 воздуха для фиксации катетера и ограничения промывной полости. Затем к катетеру присоединяют шприц, открывают кран и под умеренным давлением вводят в рог матки порционно 20—60 мл физиологической жидкости (фосфатный буфер Дюль-бекко с добавлением 1%-й эмбриональной сыворотки, или бычий сывороточный альбумин (4 мг/мл), или среду ТСМ-199, а также 0,06 мг/мл сульфата дигидрострептомицина в 100 ЕД пенициллина), имеющего температуру 37,3—38°С. Рог матки осторожно массируют, чтобы отделить эмбрионы от его стенок. Кран переключают, промывную жидкость сливают в стерильный сосуд. Порционное вымывание повторяют 4—7 раз, общий расход физиологической среды на один рог составляет 200—500 мл. При вымывании учитывают объем раствора, полученного из матки, так как с его уменьшением снижается количество вымытых эмбрионов. Основную часть эмбрионов обнаруживают в первых трех смывах. По завершении процедуры катетер переводят в другой рог, откуда таким же способом извлекают эмбрионы. Французской фирмой ИМ В предложен трехканальный катетер с гибким телескопическим зондом с канюлей. Зонд хранят и транспортируют в разобранном виде в воздушной пароформалиновой камере (футляре из нержавеющей стали или пластмассы с таблетками пароформа). После работы зонд и гибкие трубки промывают дистиллированной водой, высушивают продуванием воздуха через гибкие соединительные трубки. В.П. Белевич (1986) сконструировал безманжетный одноканальный катетер, позволяющий извлекать около 75% эмбрионов у доноров. Ф.И. Осташко совместно с другими учеными предложил устройство для асептического получения эмбрионов, их поиска, оценки и хранения. Усовершенствованный способ вымывания эмбрионов у коров посредством замкнутой гидростатической системы и четырехходового крана описан И. X. Хабибулиным (1986). После окончания вымывания эмбрионов в полость матки вводят раствор антибиотиков. Через 4—5 сут корове-донору инъекцируют простагландин Ф-2 альфа с целью предотвращения очередной стадии возбуждения полового цикла. При использовании нехирургического метода извлекают 42—50% эмбрионов (свыше пяти полноценных эмбрионов на донора). Эмбрионов у овец извлекают только хирургическим способом под общим наркозом или с местной анестезией путем лапаротомии по белой линии живота. В зависимости от применяемого метода эмбрионы вымывают из яйцепровода (до 3-х сут) или из рога матки (с 3-х по 6-е сут). По данным Л. Роусона (1971), из яйцепровода можно вымывать практически все эмбрионы, а из рогов матки — до 90%. Эмбрионов у овец вымывают хирургическим методом, с лапаротомией, гистерэктомией, после убоя донора. При этом используют пуговчатую канюлю, пластиковый или стеклянный катетер с введением промывной жидкости через яйцепровод, маточно-трубное СОединение, верхушку рога матки и промыванием в направлении шейки матки. Производят вымывание и пересадку эмбрионов начиная со стадии неразделившейся зиготы и до стадии бластоцисты, т.е. через 1—5 сут после осеменения. Эмбрионов у кобыл-доноров вымывают как хирургическим, так и нехирургическим методом. Хирургическое получение эмбрионов осуществляется путем лапаротомии по белой линии. На ипсилате-ральный рог матки накладывают лигатуру и вводят катетер. С помощью спринцовки вводят в яйцепровод 30—50 мл среды, что позволяет вымыть 77% эмбрионов на 1—6-е сут после осеменения. Можно извлекать эмбрионы и на 7—8-е сут после овуляции нехирургическим путем, используя методы, применяемые в скотоводстве. Есть сообщения об использовании удлиненного катетера Фолли (Имель К. и др., 1981), причем промывание матки проводится раствором Крабса—Рингера, Пракера, Цюльбекко и др. Технология работы с эмбрионами. Сначала проводят поиск эмбрионов и оценку их качества. Собранную в стеклянный цилиндр промывную жидкость с эмбрионами накрывают алюминиевой фольгой, передают в стерильный бокс, где в термостате при 37°С в течение 30 мин отстаивают. Лучше отстаивать промывную жидкость в оснащенных краниками конических сосудах, делительных воронках или сосудах со специальными ситечками для эмбрионов. В боксе должна быть температура 25—28°С. Здесь ежедневно проводят влажную уборку, за 1—2 ч до работы с эмбрионами поверхность приборов, оборудования, стен протирают 70%-м спиртом; включают бактерицидные лампы. Персонал обязан работать в стерильных халатах, шапочках и сменой обуви, пользоваться чистыми, стерильными посудой и инструментами. Руки перед работой обрабатывают тампоном, смоченным 70%-м спиртом. Для избежания загрязнения промывной жидкости и эмбрионов согласно французской технологии все манипуляции с эмбрионами проводят под ламинарным потоком отфильтрованного воздуха в специальных шкафах, нисходящие потоки воздуха в которых препятствуют проникновению микрофлоры. При работе с эмбрионами используют различные среды, которые готовят заблаговременно (осмотическое давление растворов должно составлять 300 моем, pH 7,2—7,6). Наиболее распространенной из них является фосфатно-буферная среда Дюльбекко, в 1 л которой непосредственно перед применением добавляют 4 г бычьего альбумина (его можно заменить инактивированной в течение 20 мин при 56°С сывороткой крупного рогатого скота или овцы, которую добавляют из расчета 20% объема среды), 1,0 г глюкозы, 0,036 г пирувата натрия и 100 тыс. ЕД бензилпенициллинкалиевой соли. Эту же среду используют для кратковременного хранения эмбрионов. После отстаивания промывной жидкости с помощью сифона отсасывают ее верхний слой. Нижний слой — осадок (50—100 мл) осторожно разливают небольшими порциями (по 20—30 мл) в чашки Петри диаметром 100 мм или круглодонные чашки, дно которых для удобства расчерчено на квадраты размером 1 х 1 см, и исследуют под бинокулярной лупой или стереоскопическим микроскопом (МБС-9) при 15—25-кратном увеличении. Обнаруженные эмбрионы вылавливают микропипеткой и помещают в чашку Петри диаметром 40 мм с питательной средой (раствором Дюльбекко или средой ТСМ-199 с добавлением эмбриональной сыворотки). Поиск бывает затруднен из-за наличия включений (атипичных клеток, слизи, сгустков крови). С целью облегчения этого процесса в НИИ животноводства лесостепи и полесья УССР предложили после предварительного просмотра и извлечения эмбрионов проводить гомогенизацию осадочной жидкости, вращая ее в гомогенизаторе со скоростью 3—5 тыс. об/мин в течение 4—6 мин. Это позволяет существенно снизить оптическую плотность смывов и при повторном поиске обнаружить около 20% эмбрионов. После завершения поиска эмбрионов приступают к оценке их качества с использованием инвертированного микроскопа. При исследовании эмбрионов учитывают: соответствие стадии развития эмбриона его возрасту, форму эмбриона, состояние (целостность) прозрачной оболочки, равномерность дробления, число и величину бластомеров, состояние цитоплазмы, прозрачность перивителлино-вого пространства. Как было указано ранее, количество бластомеров в развивающемся эмбрионе удваивается примерно каждые 24 ч. Если, например, на 2-е сут их было 2, то на 3—4-е — 4—8 и т.д. На 4—7-е сут они достигают стадии морулы, 7—8-е — ранней бластоцисты, 8—9-е — бластоцисты, 9—10-е — поздней бластоцисты, 10— 11-е — эмбрион выходит из прозрачной оболочки. Вследствие некоторой растянутости суперовуляции и неодновременности оплодотворения яйцеклеток в промывной жидкости могут обнаруживаться эмбрионы разного возраста. Биологически полноценные эмбрионы (8-суточные) имеют четкую шарообразную (правильную сферическую) форму, диаметр 120—200 мкм, ясно выраженные трофобласт и эмбриобласт, одинаковый размер бластомеры с плотным межклеточным комплексом, обусловливающим компактность эмбриона. Неполноценными считают эмбрионы, содержащие бластомеры разных размеров с нечеткими клеточными мембранами и другими признаками дегенерации. В промывной жидкости могут также обнаруживаться неоплодот-воренные яйцеклетки в состоянии дегенерации, со сморщенной, неровной формы цитоплазмой, а также зародыши неправильной формы с нарушением целости прозрачной оболочки, ее разрывами, расслоениями, сжатием полости, неравномерным дроблением, нарушением связи клеток, грануляцией цитоплазмы. Резко отстающие от нормального развития эмбрионы с выраженными признаками асинхронности дробления бластомеров, их дегенерации не пригодны для трансплантации, тогда как эмбрионы с небольшими морфологическими изменениями считаются условно пригодными. Значительно большие изменения наблюдаются у сохраняемых в замороженном виде эмбрионов; замораживание и оттаивание накладывает специфический отпечаток на структуру эмбрионов, поэтому их оценка бывает затруднена. Не всегда удается точно определить полноценность 7—8-суточных эмбрионов вследствие их мно-гоклеточности. Дегенерация эмбрионов начинается еще на стадии морулы во время их продвижения по яйцепроводу, однако морфологически это проявляется на более поздних стадиях, когда они оказываются в роге матки. Греве (1980) предлагает оценивать эмбрионы по следующим показателям (рис. 12.7). Эмбрионы крупного рогатого скота Рис. 12.7. Эмбрионы крупного рогатого скота Жизнеспособные эмбрионы — это эмбрионы, стадия развития которых соответствует их возрасту, исчисляемому со дня охоты. Такие эмбрионы имеют сферическую форму без признаков лизиса, вздутия, вакуолизации или дегенерации отдельных бластомеров. Извлеченные на 6—8-е сут эмбрионы чаще всего находятся на стадии поздней морулы, бластоцисты в начальной или поздней стадии расширения бластоцелия и, что встречается реже, в стадии вылунив-шейся бластоцисты. Они являются наиболее подходящим для трансплантации синхронизированным реципиентам. Замедленные (ретардированные) эмбрионы — это эмбрионы, которые оказываются на более разных стадиях развития, чем ожидалось согласно их возрасту. Считают, что они отстали в развитии или получены от позже овулировавших фолликулов. При их трансплантации синхронизированным реципиентам они имеют меньше шансов на приживление и продолжение развития. Уродливые (дегенерированные) эмбрионы — это эмбрионы, характеризующиеся разорванными, вздутыми, или вакуолизирован-ными, бластомерами или лизированной цитоплазмой. Такие эмбрионы не используют при трансплантации. Неоплодотворенные яйцеклетки — гомогенные яйцеклетки без наличия бластомеров и перивителлинового пространства. Иногда обнаруживается одно полярное тельце. Райт (1984) классифицирует эмбрионы по морфологическим признакам на три класса: 1) нормальные; 2) с незначительными отклонениями; 3) с увеличенным количеством дегенерированных клеток. Элсден с другими учеными (1978) разделяет эмбрионы на четыре класса: плохие, средние, хорошие и отличные. В НИИ животноводства лесостепи и полесья Украины предложили 5-балльную систему оценки эмбрионов по морфологическим признакам; она предусматривает дифференцированный подход к оценке с учетом стадии развития эмбрионов (морул и бластоцист) (табл. 12.2, 12.3). Таблица 12.2 Шкала оценки морул (морула ранняя — МО 1, поздняя — МО 2) Морфологическая характеристика Оценка Баллов Условное обозна чение Округлая форма, прозрачная оболочка, перивителлиновое пространство прозрачное, бластомеры четкие, одинакового размера с наличием полигональной связи, зернистая цитоплазма равномерно заполняет оболочку Отличные 5 + + Наличие в перивителлиновом пространстве гранул и включений, бластомеры неодинакового размера, расположены асимметрично, немного сжаты Хорошие 4 + Морфологическая характеристика Оценка Баллов Условное обозна чение В перивителлиновом пространстве гранулы и включения, частичный зародыш, незначительное сжатие бластомеров, единичные разрушения клеток Удовлет вори тельные 3 + - Деформация прозрачной оболочки, частичные разрушения бластомеров, нарушение связи между ними, фрагментация цитоплазмы Условно годные 2 +-- Несоответствие стадии развития возрасту эмбрионов, дефекты прозрачной оболочки (трещины, сколы), распад бластомеров, их сильное сжатие Непри годные 1 Таблица 12.3 Шкала оценки бластоцист (бластоциста ранняя — БЛ 1, поздняя — БЛ 2) Морфологическая характеристика Оценка Баллов Условные обозна чения Округлая форма, прозрачная оболочка имеет одинаковую толщину на всем протяжении, перивителлиновое пространство узкое, прозрачное, четкая дифференция клеток трофобласта и эмбриобласта, хорошо различима бластоцель Отличные 5 + + Зона пелюпида утончена, полость бластоцисты большая, занимает все перивителлиновое пространство, имеет гладкую поверхность, четкую дифференциацию клеток, бластоцель не выражена, в перивителлиновом пространстве гранулы, включения, клетки трофобласта сжаты незначительно Хорошие 4 + Перивителлиновое пространство увеличено, имеет включения, гранулы, бластополость не выражена, нет дифференциации между клетками трофобласта и эмбриобласта Удовлет вори тельные 3 + - Морфологическая характеристика Оценка Баллов Условные обозна чения Дефект прозрачной оболочки (трещины, сколы), наличие гранул, клеточных фрагментов в перивителлиновом пространстве, частичное разрушение клеток, сжатие бластополости Условно годные 2 +-- Значительный дефект прозрачной оболочки, распад бластомеров, их рыхлое соединение Непри годные I - - - Иногда неопытные специалисты могут перепутать компактную морулу (6—7-е сут развития) с неоплодотворенной яйцеклеткой. Главным отличием эмбриона от яйцеклетки является наличие бластомеров, истончение прозрачной оболочки до 25 мк и несколько увеличенный диаметр морулы. Использование эмбрионов отличного и хорошего качества дает двукратное увеличение их приживления. В сомнительных случаях можно поставить вымытые клетки в небольшом количестве питательной среды на 30—40 мин (или 12—24 ч) в термостат на диагностическое культивирование при температуре 37°С. Эмбрионы неудовлетворительного качества бракуют. Предложены и другие методы оценки жизнеспособности эмбрионов — с использованием функциональных проб, специальных красителей, культивирования in vitro и in vivo (в яйцепроводах крольчихи), микрометрии, электронной микроскопии и др. Хранение эмбрионов. От извлечения эмбрионов до пересадки их реципиентам проходит 2—3 ч; в течение этого времени после оценки необходимо сохранять жизнеспособность эмбрионов. Для этого их промывают в фосфатном буфере Дюльбекко с добавлением антибиотиков, засасывают в микропайеты вместе с небольшим количеством среды и хранят при комнатной температуре или поместив в 0,5 мл среды на часовое стекло. Биологически полноценные эмбрионы переносят в стерильную чашку Петри, дно которой покрыто влажной фильтровальной бумагой, и ставят в термостат (температура 37°С). Необходимость сохранения жизнеспособности эмбрионов в течение более продолжительного времени возникает при отсутствии достаточного количества подходящих реципиентов, сомнительном качестве вымытых эмбрионов, небходимости создания банка эмбри- онов с целью осуществления долгосрочных программ, для обмена генофондом между странами и континентами на коммерческой основе. Предложено несколько способов хранения эмбрионов: 1) кратковременное вне организма; 2) кратковременное в организме; 3) долговременное в сжиженых газах (криоконсервация). Кратковременное хранение и культивирование эмбрионов. При разработке способа кратковременного хранения эмбрионов учитывали опыт культивирования клеток и тканей. Кратковременное хранение эмбрионов вне организма осуществляют так. Их помещают в ампулы или полихлорвиниловые пайеты для осеменения в среде Дюльбекко, Хэма-10, В2-Менезо, модифицированном растворе Тироде или Кребс-Рингера. Наиболее подходящей средой оказалась среда ТСМ-199 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки или сыворотки крови оленя. Среда должна быть обогащена углекислым газом. Засасывают эмбрионы со средой в пайеты таким образом, чтобы по краям образовались воздушные пространства длиной 1 — 1,5 см. Концы пайеты закрывают стальными шариками или полиэтиленовыми трубками и инкубируют при 37°С в термостате. Биологически полноценные эмбрионы можно культивировать при 37°С под слоем вазелинового масла: пастеровской пипеткой эмбрионы переносят в стерильную пробирку, содержащую 0,5—1 мл среды, наслаивают стерильное вазелиновое масло, накрывают тонкой фольгой и ставят в термостат. Можно также перенести эмбрионы в 0,2 мл среды на часовое стеклышко, накрыть слоем (25 капель) вазелинового масла, поставить в чашку Петри, находящуюся на эксикаторе, через который пропускают влажную газовую смесь (90% азота, 5% кислорода и 5% углекислого газа). |