Примеры заданий по биотехнологии. Учебнометодический комплекс для студентов специальности 131 01 0102 Биология (научнопедагогическая деятельность)
 Скачать 6.85 Mb.
|
|
1 Биореакторы. Биореактор - изолированная система (например, ферментатор), в которую вместе с другими материалами вводят биологические агенты и в результате протекающей реакции происходит их размножение или образование других веществ. Биореакторы, как правило, оборудуются устройствами для регулирования, контроля, добавления и извлечения материалов. Основное требование к биореакторам любого типа сводится к обеспечению оптимальных условий роста продуцента или накоплению синтезируемого им продукта. Для достижения указанных целей необходимо разрабатывать технологию, призванную оптимизировать процесс, а именно: использовать подходящий источник энергии, набор питательных веществ должен соответствовать питательным потребностям организма-продуцента, из ростовой среды должны быть удалены соединения, ингибирующие его жизнедеятельность, должна быть подобрана соответствующая посевная доза и, наконец, обеспечены все остальные требуемые физико-химические условия. Экономически рентабельные процессы в своей основе весьма сходны, независимо от избранного продуцента, используемой среды и образуемого продукта. Фактически один и тот же биореактор (с небольши-ми изменениями) может быть использован для производства ферментов, антибиотиков, ор- ганических кислот или одноклеточного белка. Биотехнологические процессы отличаются от процессов химического синтеза и могут быть двух типов: периодическими и непрерывными. Специфика биотехнологических процессов состоит в том, что в них участвуют живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из клеток ферменты и их комплексы. Это оказывает довольно существенное влияние на процессы массообмена (обмена веществ между различными фазами - перенос кислорода из газообразной фазы в жидкую) и теплообмена (перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами). Поэтому одним из важнейших механизмов биореакторов является система перемешивания, обеспечивающая однородность условий в аппарате. Другим существенным различием между биотехнологическими и химическими процессами является необходимость создания аэробных или анаэробных условий, требуемых для культивирования соответствующего организма. Поэтому в определенных случаях необходимо подавать кислород и удалять образующиеся газообразные продукты иного рода, в первую очередь двуокись углерода (СО 2 ). Системы аэрациизачастую бывают очень сложной конструкции, поскольку они должны обеспечить баланс между 184 расходом О 2 и его поступлением в нужных количествах, учитывая тот факт, что потребность в кислороде не одинакова на различных стадиях культивирования. Крайне важным является обеспечение должного уровня теплообмена в биореакторах, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность объектов зависит в значительной степени от колебаний температуры. Еще одной серьезной проблемой при культивировании в биореакторах является пенообразование, связанное с необходимостью аэрирования содержимого, в котором постоянно присутствуют поверхностно-активные вещества (ПАВ). Это заставляет интенсивно разрабатывать эффективные системы пеногашения. Специфическим элементом биореактора является система, обеспечивающая стерильность процесса. Стерилизация осуществляется на разных этапах процесса, как до его начала, так и при осуществлении и после окончания. Таким образом, процессам стерилизации в биотехнологическом производстве отводится важное место. В последнее время в биотехнологию внедряется принцип дифференцирования режимов культивирования: разные этапы одного и того же процесса осуществляются при различных условиях - температура, рН, аэрация и т. п. Естественно, это создает новые (дополнительные) требования при конструировании реакторов. Таким образом, в соответствии с основными принципами реализации биотехнологических процессов современные биореакторы должны обладать следующими системами: • эффективного перемешивания и гомогенизации среды выращивания; • обеспечения свободной и быстрой диффузии газообразных компонентов системы (аэрирование в первую очередь); • теплообмена, обеспечивающего поддержание оптимальной температуры внутри реактора и ее контролируемые изменения; • пеногашения; • стерилизации сред, воздуха и самой аппаратуры; • контроля и регулировки процесса и его отдельных этапов. При разработке новых биотехнологических процессов сначала прибегают к периодическому культивированию. Периодическое культивирование включает несколько этапов: стерилизацию сред и оборудования, загрузку биореактора питательной средой, внесение посевного материала, выращивание культуры, отделение и очистку готового продукта. После окончания последнего этапа производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу. 185 При этом типе культивирования рост клеточной популяции подразделяется на несколько фаз (Рис. 1): 1) После введения инокулята обычно наблюдают индукционный период (лаг-фаза) (1),в течение которого не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образования каких-либо продуктов. В этот период перестраивается метаболизм клетки, синтезируются ферменты, специфичные к использованию новых субстратов, активируется биосинтез белка. 2) Индукционный период сменяется фазой экспоненциального роста (2),в течение которой быстро накапливаются биомасса и продукты разных реакций. Эта фаза достаточно строго описывается экспоненциальной кривой. 3) В замкнутой системе экспоненциальная фаза роста не может развиваться неограниченно. Как правило, она переходит в фазу линейного роста (3),характеризующуюся равномерным во времени линейным ростом культуры. В этой фазе уже имеет место отклонение точек в сторону меньших значений количества клеток или продуктов, что служит экспериментальным критерием перехода культуры в ли- нейную фазу роста. 4) Фаза линейного роста может смениться весьма непродолжительным периодом, в течение которого скорость роста культуры снижается до нуля. Это фаза замедления роста(4). 5) В некоторых случаях рост культуры может переходить в достаточно устойчивую и продолжительную стационарную фазу (5).В этих условиях культура развивается в режиме постоянства общего числа клеток. Режим характеризуется достаточно высокими скоростями отмирания клеток. При этом скорость прироста биомассы полностью компенсируется скоростью гибели и лизиса клеток. 6) Если система полностью истощается по субстрату или накопление ингибирующих рост продуктов является значительным, то скорость прироста биомассы становится равной нулю, происходят существенные физиологические изменения клеток и, как правило, наблюдается фаза отмирания культуры (6). Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспо- ненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так называемые первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (антибиотики, пигменты и т. п. - так называемые вторичные Рис. 1. Типичная кинетическая кривая роста популяции микроорганизмов: 1- индукционный период; 2- фаза экспоненциального роста; 3 - фаза линейного роста; 4 - фаза замедления роста; 5 - стационарная фаза; 6 - фаза отмирания культуры. 186 метаболиты). Довольно широко в биотехнологии используется периодическое культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесения питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивирования в аппарат через определенные интервалы добавляют питательные вещества либо порциями, либо непрерывно "по каплям". Существует также отъемно-доливочное культивирование, когда часть содержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное количество питательной среды. Такой прием обеспечивает регулярное "омолаживание" культуры и задерживает ее переход в фазу отмирания. Этот прием иногда называется полунепрерывным культивированием. Модификацией периодического культивирования является культивирование с диализом, при котором питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность. Помимо этого, диализ удаляет из культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса концентрированную биомассу. В непрерывных процессах культивирования клетки постоянно поддерживаются в экспоненциальной фазе роста. С этой целью в биореактор подается свежая питательная среда и обеспечивается отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов (как уже отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный режимы непрерывного культивирования. При хемостатном режиме культивирования саморегулируемая система возникает в силу следующих причин: если первоначальное поступление свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток, то в результате разбавления культуры снижается концентрация веществ, ограничивающих ростовые процессы и скорость роста культуры повышается; увеличивающаяся популяция начинает активнее "выедать" субстрат, что в свою очередь приводит к торможению роста культуры. Конечным итогом этих процессов является (после серии затухающих колебаний) установление равновесия между скоростью роста культуры и ее разбавлением. Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, называют хемостатом. Его конструкция 187 предусматривает наличие: 1) приспособления для подачи питательной среды; 2) устройства, обеспечивающего отток культуральной жидкости вместе с клетками, и 3) системы, контролирующей концентрацию элементов питательной среды и управляющей скоростью подачи питательной среды. Последнее является наиболее важным и наиболее сложно осуществимым устройством. Турбидостатный режим культивирования базируется на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространенным методом ее определения является измерение светорассеивания с помощью фотоэлементов. Повышение концентрации клеток и соответственно оптической плотности автоматически ускоряет проток жидкости и наоборот. По своей конструкции турбидостаты отличаются от хемостатов лишь системами контроля скорости протока. Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малым протоком, когда концентрация клеток изменяется незначительно с изменением скорости протока, что облегчает саморегулировку системы. Турбидостаты используются в процессах, характеризующихся высокой скоростью разбавления при быстром и резком изменении концентрации биомассы. 2 Конструкция биореакторов. Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно придерживаться следующей генеральной линии: 1. Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранение требуемой микрофлоры. 2. Объем культивируемой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не было утечки или испарения содержимого. 3. Уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней аэрирования культуры аэробных орга- низмов. 4. Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны постоянно контролироваться. 5. Культура при выращивании должна хорошо перемешиваться. К материалам, используемым при конструировании сложных биореакторов, предъявляются определенные требования: а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающимися в биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения металлами даже в следовых количествах; 188 б) материалы должны быть нетоксичными, чтобы даже при самой малой растворимости они не ингибировали рост культуры; в) компоненты и материалы биореактора должны выдерживать повторную стерилизацию паром под давлением; г) перемешивающая система биореактора и места поступления и выхода материалов и продуктов должны быть легко доступными и достаточно прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механических воздействиях; д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой, так что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть прозрачными. Для оптимизации биотехнологических процессов требуется постоянный и тщательный контроль за изменяющейся картиной ферментации, что обеспечивается наличием в биореакторах соответствующих датчиков, позволяющих осуществлять избирательный анализ определенных параметров ферментационного процесса. Неотъемлемой частью большинства ферментаций является та или иная степень компьютеризации. Важным классификационным принципом биореакторов различного типа являются системы перемешивания. По способу перемешивания и аэрации биореакторы подразделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием. Наиболее распространенные конструкции в современной микробиологической промышленности - аппараты с механическим перемешиванием (рис.2.). Такие реакторы имеют механическую мешалку с центральным валом и лопастями (лопатками), число которых обычно равно 6, реже 8. Лопасти могут быть прямыми или изогнутыми, часто их располагают в несколько ярусов, что обеспечивает более эффективное перемешивание больших объемов жидкости. В систему входят также отражательные перегородки - узкие металлические пластинки, прикрепленные к внутренним стенкам биореактора. Они предотвращают возникновение водоворо- тов и обеспечивают вихревое движение жидкости, равномерно распределяемое но всему объему реактора. Аэрация может осуществляться также путем барботажа - подачи воздуха снизу через горизонтальную трубку с отверстиями, иногда аэрирование достигается применением специальных вибраторов, которые обеспечивают высокую степень асептики, малый расход энергии и относительно слабо травмируют клетки. В аппаратах с пневматическим перемешиваниеммешалка отсутствует, и перемешивание жидкости осуществляется пузырьками 189 газа. Естественно, что скорость массообмена в них намного ниже, чем в Рис. 2. Схема устройства биореактора с механическим перемешиванием 1- Крышка люка. 2 - Мешалка. 3 - Крыльчатка. 4 - Отражательная перегородка. 5 - Выход воздуха. 6-7 - Окно для наблюдения. 8-12 - Стерильные соединения. 13 - Ввод пробы. 14 - Муфта для рН электрода. 15 - Карман для термометра. 16 - Сливной кран (для ферментеров емкостью более 2000 литров). 17 - Двойная рубашка. 18-19 - Сочленения для пара и охлаждающей воды. 20 - Слив. ферментерах с механическим перемешиванием. Классическим аппаратом такого типа является эрлифтный реактор (air lift - подъем воздуха). Биореакторы с пневматическим перемешиванием характеризуются более мягким (плавным) перемешиванием содер- жимого и получили распространение при выращивании клеток животных и растений. Биореакторы циркуляционного типа оснащены насосами и эжекторами, создающими направленный ток жидкости по замкнутому контуру (кругу). Жидкость увлекает за собой пузырьки газа и тем самым культуральная среда одновременно с перемешиванием может насыщаться либо атмосферным кислородом, либо (с использованием специальных устройств и эжекторов) газом иного типа. Эти биореакторы отличаются простотой конструкции и надежностью в эксплуатации. В последнее время разрабатываются новые способы аэрации. На- пример, воздух может подаваться через специальные 16 190 полипропиленовые мембраны. Это позволяет избегать пенообразования, и очень хорошо зарекомендовало себя при выращивании клеток эукариотических организмов, в частности при промышленном получении интерферона. Теплообмен в биореакторах осуществляется с помощью труб с охлаждающим или нагревающим агентом, которые оплетают аппарат и образуют так называемую рубашку реактора. Иногда эта система труб располагается непосредственно в полости ферментера. Нагревающими агентами в промышленных биореакторах служат горячая вода или пар, в лабораторных ферментерах чаще используется электрический подогрев. Система пеногашения биореактора – это средство борьбы с избыточным пенообразованием. Существуют химические, механические, акустические и другие виды пеногашения. Наиболее часто применяют химические и механические способы. К химическим средствам пеногашения относятся поверхностно активные вещества, которые, внедряясь в стенки пузырей, становятся центрами их неустойчивости. Эффективными пеногаситслями служат растительные масла и животные жиры. Недостатком этих пеногасителей является то, что при их утилизации микробными клетками сами по себе способствуют пенообразованию. Механические пеногасители представляют собой различные устройства, сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны, располагающиеся в верхней части реактора. Более сложными приспособлениями являются сепараторы пены, которые одновременно служат для сбора биомассы, содержащейся в пенном слое. Устройства и режим стерилизации определяется конструкцией биореактора, вспомогательного оборудования, используемых питательных сред и т. п. Наибольшее значение имеют термический метод стерилизации оборудования и сред и фильтрационный способ, применяемый для удаления микроорганизмов из подаваемого в ферментеры воздуха или другого газа. Технология производственного процесса отрабатывается поэтапно: в лабораторных, пилотных (опытно-промышленных) и промышленных установках. Чаще встречаются аппараты с объемами ферменторной камеры: 0,5-100 л (лабораторные), 100-5000 л (лабораторно-промышленные) и 5000-1 000 000 л и более (промышленные). На каждом этапе увеличения масштаба фер- ментации решаются конкретные задачи отработки (налаживания) производства и его оптимизации. 191 Спомощью лабораторных биореакторов решаются следующие задачи: 1) кинетические - определение скорости роста клеток, эффектив- ности утилизации субстратов и образования целевого продукта; 2) некоторые массообменные - расчет коэффициентов массопередачи, скорость поступления в среду О 2 и других газов, скорость освобождения от газообразных продуктов, образующихся при культивировании продуцентов (в первую очередь СО 2 ); 3) определение коэффициентов реакций, связывающих утилизируемые субстраты и О 2 с получаемыми целевым и побочными продуктами. Лабораторно-промышленные установки используют для поиска наиболее целесообразных технологий и в общих чертах моделирования промышленного процесса. Поэтому на данном этапе стараются применять тот тип аппарата, который предполагается использовать в промышленном масштабе. |