Учреждение образования полесский государственный университет в. Т. Чещевик молекулярные основы
 Скачать 1.26 Mb.
|
|
ТЕМА 5 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ГАМЕТОГЕНЕЗА 1. Общая характеристика гаметогенеза. 2. Сперматогенез. 3. Оогенез. Метафазный блок мейоза. 1. Общая характеристика гаметогенеза Гаметогенез – это процесс формирования половых клеток. Гаметы представляют собой высоко специализированные клетки, дифференциация которых связана с редукцией числа хромосом. Клетки половой линии обособляются на ранних этапах эмбрионального развития. Известны два способа спецификации клеток половой линии: эпигенетический (свойства половой клетки индуцируются внешними по отношению к клетке факторами) и преформационный (обусловленный материнскими детерминантами, унаследованными клеткой вместе с цитоплазмой ооцита). Клетки, потомки которых дают начало исключительно гаметам, называются первичными половыми клетками (ППК). ППК представляют собой диплоидные клетки, которые мигрируют от места своего возникновения до зачатка гонады. В период миграции ППК активно делятся, благодаря чему численность популяции ППК возрастает примерно от ста клеток до пяти тысяч. ППК, заселившие гонады, называют гониями. Гонии являются диплоидными и способны к митотическим делениям. Гонии мужских гонад называют сперматогониями, а женских – оогониями. В период созревания половые клетки теряют способность к митотическим делениям. Они вступают на путь превращения в гаплоидные клетки, претерпевая сложный процесс редукции числа хромосом в результате мейоза. Мейоз включает два последовательных деления, которые называются мейотическими, или делениями созревания. Половые клетки, вступившие на путь делений созревания, называют «цитами»: соответственно в мужских и женских гонадах различают сперматоциты и ооциты. До завершения первого деления созревания половые клетки называют первичными сперматоцитами (ооцитами). После первого деления созревания их называют – вторичными сперматоцитами (ооцитами). После завершения деления созревания вторичный ооцит называют зрелой яйцеклеткой. Вторичный сперматоцит в результате второго деления созревания образует гаплоидную сперматиду. В процессе Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 33 сперматогенеза различают особый период формирования, в течение которого сперматида преобразуется в зрелый сперматозоид. В процессе мейоза кроме редукции числа хромосом осуществляется рекомбинация генома половых клеток: случайное распределение родительских хромосом по дочерним клеткам и кроссинговер. Переключение с митотических делений, характерных для гоний, на мейоз находится под контролем многих генов, в частности, генов, контролирующих репликацию ДНК. 2. Сперматогенез Специализация мужских гамет направлена на максимальную компактизацию ядерных структур, развитие органелл движения и органелл, обеспечивающих встречу и соединение спермия с яйцеклеткой. Объем спермия определяется практически размерами ядра, несколькими митохондриями, центросомой и величиной жгутика. В процессе формирования сперматозоида объем его ядра резко уменьшается. Хроматин спермия конденсируется и плотно упаковывается вследствие замещения гистонов особыми высоко основными белками – протаминами и иными аргинин-богатыми белками. Жгутиковые сперматозоиды обычно имеют акросому. Акросома представляет секреторный пузырек, который формируется при участии аппарата Гольджи, и содержит разнообразные гидролитические ферменты. Митохондрии часто сливаются между собой и образуют крупную хондросферу, которая локализована в основании жгутика вокруг центриоли и генерирует энергию для движения жгутика. Центриоль, которая в период делений сперматогониев и сперматоцитов определяет формирование веретена, в ходе спермиогенеза преобразуется в базальное тельце жгутика. Основу жгутика составляет осевой комплекс (аксонема), состоящая из двух центральных одиночных микротрубочек, вокруг которых расположены девять дублетов микротрубочек. Сперматогенез подразделяется на следующие фазы: 1. фаза размножения, в течение которой образующиеся после деления стволовых клеток сперматогонии размножаются путем митотических делений. 2. фаза коммитации, в течение которой включаются генетические программы инициации сперматогенеза. 3. фаза созревания (охватывает премейотический синтез ДНК и два мейотических деления). 4. Фаза формирования спермия (образование гаплоидного сперматида). Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 34 Сперматогенез у высших позвоночных животных протекает в семенниках. Семенник позвоночных подразделен на два отдела: семенные канальцы и межканальцевое пространство (строма). В последнем находится обширная сеть кровеносных сосудов, клетки Лейдига, а также макрофаги, фибробласты, лимфоциты и тучные клетки. Семенные канальцы отделены от стромы ограничивающей мембраной, которая образована уплощенными клетками, расположенными в 2–3слоя. Эти клетки могут превращаться в клетки Лейдига, которые продуцируют тестостерон. Эпителий семенных канальцев имеет сложный состав и образован клетками двух типов: половыми (гоноциты) и соматическими клетками фолликулярного эпителия (клетки Сертоли). Клетки Сертоли обеспечивают дифференцирующиеся мужские половые клетки питанием; способствуют созданию необходимой для нормального сперматогенеза концентрации андрогенов; участвуют в перемещении половых клеток из базального отсека канальца в околополостной; участвуют в создании гематотестикулярного барьера. Функциональная активность семенника у позвоночных во многом обусловлена гормональной регуляцией со стороны гипоталамо-гипофизарной системы. Инициация сперматогенеза обусловлена секрецией лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулстимулирующего гормона (ФСГ), которые вырабатываются в передней доле гипофиза. Мишенями ФСГ являются в семенных канальцах – клетки Сертоли, а в строме – макрофаги. Действие ЛГ направлено на клетки Лейдига (активация синтеза тестостерона, наличие которого является непременным условием сперматогенеза). В обоих случаях происходит выработка паракринных факторов, поддерживающих активность клеток Лейдига. ФСГ стимулирует также аккумуляцию тестостерона в клетках Сертоли, создавая предпосылку нормального сперматогенеза. Для дифференциации клеток Сертоли необходимы также белки, продуцируемые клетками Лейдига. Показано, что эти белки служат лигандами, которые воспринимаются специфическими тирозинкиназными рецепторами клеток Сертоли. Гонадотропные гормоны гипофиза, взаимодействуя с рецепторами мембран, активируют G-белок и связанную с ним аденилатциклазу. Это, в конечном счете, индуцирует накопление цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) в клетках Сертоли, воспринимающих сигнал ФСГ, и в клетках Лейдига, взаимодействующих с ЛГ. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 35 3. Оогенез. Метафазный блок мейоза Процесс развития женских половых клеток сопряжен со сложными структурными и функциональными перестройками ядра, цитоплазмы и поверхностного аппарата клетки. В ходе оогенеза происходят: мейотические преобразования ядра; интенсивное накопление богатых энергией и пластических веществ; формирование механизмов, необходимых для оплодотворения и активации яйца, а также для блокировки полиспермии; выработка морфогенетически активных веществ, специфическая локализация которых в ооците во многом предопределяет характер развития и полярность зародыша после оплодотворения; формирование разнообразных яйцевых оболочек яйца, которые выполняют защитную функцию, а в период оплодотворения обеспечивают начальные этапы взаимодействия яйца со сперматозоидом. В результате оогенеза образуется яйцо (ооцит), окруженный системой оболочек. Яйцевые оболочки. В зависимости от способа образования различают первичные, вторичные и третичные яйцевые оболочки. Первичными оболочками называют оболочки, продуцируемые самими яйцеклетками (желточная оболочка); вторичными – оболочки, которые формируются за счет активности фолликулярных клеток яичника (хорион); третичными – структуры, которые образуются при участии желез половых протоков самки (белковые, пленчатые подскорлуповые, известковая оболочки яйца птиц). Пути формирования энергетических запасов ооцита. В раннем развитии различаются два типа источников энергии: внутренние (создаются в период оогенеза путем накопления в яйце энергетически богатых веществ - желток, липиды и др.) и внешние (паразитизм – развитие в тканях хозяина; живорождение – питание за счет материнского организма). Запас энергоемких структур и веществ в яйцеклетке определяется: временем достижения стадии, когда становится возможным активное питание и уровень организации животного (более сложная структурная организация животного требует большего времени для своего развития и больших запасов энергии и пластических веществ). Метафазный блок мейоза и его регуляция в ходе созревания ооцитов. Метафазный блок клеточных циклов ооцита и зиготы обусловлен белковым цитоплазматическим CSF-фактором. Данный фактор присутствует в цитоплазме зрелого ооцита и исчезает при активации яйца. Выделяют первичную и вторичную форму CSF-фактора. В цитозоле Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 36 неоплодотворенных яиц содержится первичный (нестабильный) CSF-фактор, который чувствителен к ионам кальция. Вторичный (стабильный) CSF- фактор нечувствителен к ионам кальция. Именно первичный CSF-фактор ответственен за метафазный блок мейоза неоплодотворенных яиц. Активация данного фактора ионами кальция (10 -5 М) при оплодотворении снимает метафазный блок. Эффект CSF-фактора реализуется путем стимуляции продукции и ингибирования деградации белкового MPF-фактора, продукция которого происходит под действием прогестерона и который вызывает переход клетки из интерфазы в метафазу. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 37 ТЕМА 6 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА 1. Оплодотворение и его биологические значение. 2. Детерминация пола у Drosofila melanogaster. 3. Детерминация пола у Mammalia. 1. Оплодотворение и его биологические значение Оплодотворение представляет собой процесс слияния двух половых клеток (гамет) друг с другом, в результате чего возникает новая особь, получающая генетический материал от обоих родителей. Оплодотворение осуществляет две функции: половую (комбинирование генов двух родителей) и репродуктивную (создание нового организма). При оплодотворении происходят четыре основных события: 1) Контакт спермия с яйцом и их взаимное узнавание. Это этап качественного контроля – спермий и яйцо должны принадлежать к одному биологическому виду. 2) Регуляция проникновения спермия в яйцо. Это этап количественного контроля – один спермий оплодотворяет одно яйцо, все остальные спермии должны быть элиминированы. 3) Слияние генетического материала спермия и яйца. 4) Активация метаболизма яйца для его вступления на путь развития. В оплодотворении важное значение имеют факторы активации сперматозоидов. Аттрактанты (сперакт, резакт). Аттрактанты обуславливают хемотаксис спермиев в направлении зрелого ооцита. Сперакт – это пептид из 10 аминокислотных остатков, резакт – пептид, состоящий из 14 аминокислотных остатков. Данные аттрактанты являются эффективными в низких концентрациях и видоспецифичны. Спермии двигаются по градиенту концентрации данных аттрактантов. Акросомная реакция спермия. Протекает при контакте спермия и яйца и связана с разрывом акросомного пузырька по механизму экзоцитоза с высвобождением протеолитических ферментов, которые прокладывают путь через студенистую оболочку к поверхности яйца. Инициация акросомной реакции происходит под воздействием сульфатированных полисахаридов Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 38 студенистой оболочки, которые вызывают поступление ионов кальция и натрия в головку спермия и слияние акросомного пузырька с цитоплазматической мембраной спермия. При контакте спермия с желточной оболочкой происходит видоспецифическое узнавание с участием белка акросомы bindin. Белок bindin имеет молекулярную массу 30,5 кДа и активируется после протекания акросомной реакции. Взаимодействие биндина с яйцом осуществляется с помощью специфических рецепторов на желточной оболочке и является видоспецифичным. У млекопитающих важным процессом является также капацитация. Капацитация – это приобретение спермиями оплодотворяющей способности, которая происходит в результате контакта спермием с жидким содержимым яйцеводов или матки. Процесс капацитации связан с изменением структуры липидов клеточной мембраны спермия. В частности, происходит снижение содержания холестерина, что способствует дестабилизации акросомного пузырька спермия и приводит к акросомной реакции. При капацитации происходит удаление с поверхности спермия особых веществ, которые, оставаясь на поверхности, препятствуют оплодотворению. Рецепторы Zp3 прозрачной оболочки в связывании сперматозоидов. Рецептор Zp3 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 83 кДа, локализованный в прозрачной оболочке яйца. Данный рецептор необходим для прикрепления спермия к прозрачной оболочке яйца и инициации акросомной реакции спермия в месте прикрепления. Важную роль в прикреплении спермия к яйцу играют также молекулы фермента гликозилтрансферазы, которые находятся на поверхности спермия и обеспечивают прикрепления спермия к яйцу, на поверхности которого в прозрачной оболочке находятся молекулы N-ацетилглюкозамина, связывающиеся с активным центром гликозилтрансферазы. Механизмы предотвращения полиспермии у различных организмов. Полиспермия у большинства животных приводит к гибельным последствиям. Существует два механизма препятствования полиспермии: быстрый и медленный. Быстрый блок полиспермии. Действует около минуты. Достигается путем изменения электрического потенциала цитоплазматической мембраны яйца. В течение 0,1 с после прикрепления первого спермия мембрана деполяризуется и мембранный потенциал принимает положительные значения, что обусловлено поступлением в клетку ионов натрия. Открывание натриевых каналов в яйце индуцируется специальным белком, Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 39 высвобождаемым при прикреплении спермия к яйцу. Данный блок полиспермии отсутствует у млекопитающих. Медленный блок полиспермии. Начинается приблизительно спустя минуту после прикрепления спермия к яйцу и осуществляется посредством кортикальной реакции. В кортикальном слое яйца содержится большое количество гранул диаметром около 1 мкм. После контакта спермия с яйцом данные гранулы сливаются с цитоплазматической мембраной и выделяют свое содержимое в область между мембраной и желточной оболочкой. Белки, которые связывали желточную оболочку с поверхностью яйца, растворяются высвободившимися протеолитическими ферментами, а выделенные мукополисахариды создают осмотический градиент, который привлекает воду в пространство между плазматической мембраной и желточной оболочкой. В результате желточная оболочка отделяется от поверхности яйца, образуя оболочку оплодотворения. Воздействие протеаз приводит к изменению свойств биндиновых рецепторов и их отделению вместе с прикрепленными спермиями. Пероксидаза, высвобождаемая гранулами, вызывает затвердевание оболочки путем образования поперечных связей между остатками тирозина соответствующих белков. Кроме того, выделяется белок гиалин из кортикальных гранул, который образует сплошной слой вокруг яйца. Важную роль в кортикальной реакции играют ионы кальция. Слияние мужского и женского пронуклеусов. У млекопитающих процесс сближения пронуклеусов осуществляется на протяжении 12 часов. При деконденсации ядра спермия происходит также разрушение его ядерной оболочки и затем воссоздается заново путем слияния мембранных пузырьков. Пока ядро ооцита завершает второе мейотическое деление, мужской пронуклеус увеличивается в размерах. Затем оба пронуклеуса перемещаются навстречу друг другу, реплицируя ДНК в процессе миграции. Когда пронуклеусы приходят в контакт, их ядерные оболочки разрушаются. Происходит конденсация хроматина с образованием видимых хромосом, которые располагаются на общем митотическом веретене первого деления дробления. У млекопитающих истинное диплоидное ядро появляется лишь у двухклеточного зародыша. При активации метаболизма оплодотворенного яйца выделяют ранние и поздние реакции. Ранние реакции начинаются при возрастании концентрации ионов кальция и к ним относятся: увеличение потребления яйцом кислорода, активация фермента НАД + -киназы. К поздним реакциям относятся возобновление синтеза ДНК и стимуляция белкового синтеза. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 40 Условиями возобновления синтеза ДНК и стимуляция белкового синтеза в зародыше являются повышение рН и уровня кальция в яйце. Важным триггером высвобождения ионов кальция является иннозитол- 1,4,5-трифосфат, уровень которого сразу же возрастает после оплодотворения яйца. Ферментом, ответственным за синтез ИТФ, является фосфолипаза С. Данный фермент входит в состав цитоплазматической мембраны и расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат на диацилглицерол и ИТФ. Диацилглицерол, в свою очередь, активирует протеинкиназу С, которая активирует Na + /H + -переносчик, осуществляющий обмен ионов натрия на ионы водорода. Активация фосфолипазы С осуществляется с помощью G-белка, который активируется присоединением спермия к своему рецептору. 2. Детерминация пола у Drosofila melanogaster У дрозофилы детерминация пола обусловлена равновесием между женскими генами на Х-хромосоме и мужскими генами на аутосомах. Если в диплоидной клетке находится всего лишь одна Х-хромосома, то возникает самец. Если в диплоидной клетке содержатся две Х-хромосомы, то развивается самка. Дрозофилы с генотипом Х0 – являются стерильными самцами. Y-хромосома не влияет на детерминацию пола, обеспечивая лишь фертильность самцов. Выделяют следующие гены детерминации пола у дрозофил: Sxl, tra, tra-2, Dsx. Активация генов Sxl, tra имеет важное значение для формирования фенотипа самок. Мутации этих генов трансформируют особей c генотипом ХХ в самцов. Ген Dsx имеет важное значение для половой дифференцировки обоих полов. Гомозиготные рецессивные аллели dsx превращают мух ХХ и ХY в интерсексов, т.е. имеющих промежуточный между мужским и женским фенотип. Первый этап детерминации пола у дрозофил связан с прочтением информации о соотношении Х:А (Х-хромосом и аутосом). Высокие значения данного соотношения приводят к активации гена Sxl, включающего феминизацию. При низких значениях Х:А Sxl остается неактивным. После активации данного гена он сохраняет свою активность вне зависимости от дальнейшего соотношения Х:А. В свою очередь, ген Sxl регулирует детерминацию соматического пола путем контроля процессинга транскрипта гена tra. Для самцов и самок наблюдается альтернативный сплайсинг этого гена. Продукт гена tra действует совместно с геном tra-2, способствуя созданию женского фенотипа. Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 41 Ген tra-2 способен связываться с геном Dsx только в присутствии белка гена tra. Ген Dsx активен у самцов и самок, первичный его мРНК транскрипт подвергается секс-специфическому процессингу. Если активен только ген tra -2, то сплайсинг идет только по мужскому фенотипу. Этот транскрипт продуцирует белок, ингибирующий гены, ответственные за женские признаки клеток. Если активен ген tra, то образуется транскрипт Dsx специфический для самок, продукт которого ингибирует гены, ответственные за мужские признаки. 3. Детерминация пола у Mammalia Первичная детерминация пола у млекопитающих является строго хромосомной и не зависит от окружающих условий. Y-хромосома служит решающим наследственным фактором, который определяет пол у млекопитающих. Важную роль в регуляции пола млекопитающих в эмбриогенезе играют гены SRY и SOX-9. Ген SRY локализован в детерминирующей пол области Y-хромосомы и содержит консервативную последовательность нуклеотидов, которая кодирует образование транскрипционного белкового фактора (Tdf), содержащий участок в 79 аминокислот (HMG-домен), который обеспечивает специфическое связывание данного белка с ДНК и вызывает характерное изгибание молекулы ДНК под углом 70-80 0 . Ген SRY относится к семейству генов SOX, для которого характерна тканеспецифическая экспрессия в раннем эмбриогенезе (в половом гребне). Данный белок определяет дифференцировку прогонады в семенник вследствие регуляции экспрессии антимюллеровского гормона, который оказывает влияние на экспрессию стероидогенного фактора-1 (SF-1), который является глобальным регулятором генов для всех ферментов, связанных с синтезом стероидов. Мутации в области этой последовательности приводят к инверсии пола. Ген SOX-9 также содержит HMG-бокс, его экспрессия происходит в клетках полового гребня вслед за экспрессией Sry только у организмов с генотипом XY. Вторичная детерминация пола – это развитие женского или мужского фенотипов, обусловленное гормонами, которые вырабатываются яичниками или семенниками. Женская и мужская детерминация пола включает два временных компонента: первый реализуется в период органогенеза, второй – в юношеский период. Формирование мужского фенотипа связано с Молекулярные основы онтогенеза Полесский государственный университет Страница 42 секрецией тестикулярных гормонов, обуславливающих развитие вольфова канала и атрофию мюллерова канала. Первым из таких гормнов является антимюллеровский гормон, который секретируется клетками Сертоли и вызывает дегенерацию мюллеровых каналов. Второй гормон представляет собой тестостерон, продуцируемый клетками Лейдига. Данный гормон обуславливает дифференцировку вольфова канала в придаток семенника, семявыносящий канал и семенные пузырьки. Формирование женского фенотипа происходит в результате секреции эстрогена яичниками плода, который приводит к дифференцировке мюллерова канала в матку, яйцеводы и шейку матки. |