Работа. Устройство светового микроскопа и правила работы с ним
 Скачать 1.01 Mb.
|
|
Лабораторная работа 2. Тема: Устройство светового микроскопа и правила работы с ним. Материалы и оборудование: микроскоп PRIMO STAR (CARL ZEISS, Германия); комплект цитологических микропрепаратов. 1. Устройство микроскопа. Цель работы: Изучить устройство светового микроскопа. Микроскоп - это оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза. Что такое разрешающая способность? Представьте себе, что невооруженным глазом человек может различить две очень близко лежащие линии или точки лишь в том случае, если расстояние между ними будет не менее 0,10 мм (100 мкм). Если же это расстояние будет меньше, то две линии или точки сольются в одну. Таким образом, разрешающая способность человеческого глаза равна 100 мкм. Поэтому, чем больше разрешающая способность объектива, тем больше подробностей строения наблюдаемого объекта можно выявить. Для объектива (х8) разрешающая способность равна 1,68 мкм, для объектива (х40) – 0,52 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм. Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение. Различают полезноеи бесполезное увеличения. Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения. Например, если изображение, полученное с помощью микроскопа (полезное!), увеличить еще во много раз, спроецировав его на экран, то новые, более тонкие детали строения при этом не выявятся, а лишь соответственно увеличатся размеры имеющихся структур. В учебных лабораториях обычно используют световые микроскопы, на которых микропрепараты рассматриваются с использованием искусственного света. В микроскопе выделяют две системы: оптическуюи механическую (рис.1). К оптической системеотносят - объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель). Объектив (1) -одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта.Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. Качество объектива определяет его разрешающая способность. Объектив требует очень бережного обращения, особенно это касается объективов с большим увеличением, т.к. у них рабочее расстояние, т.е. расстояние от покровного стекла до фронтальной линзы, измеряется десятыми долями миллиметра. Например, рабочее расстояние для объектива (х40) составляет 0,6 мм. Окуляр(2) устроен намного проще объектива. Он состоит из 2-3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами. Окуляры не выявляют новых деталей строения, и в этом отношении их увеличение бесполезно. Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом. Для определения общего увеличения микроскопаследует умножить увеличениеобъектива на увеличение окуляра. Например, если окуляр дает 10-кратное увеличение, а объектив — 20-кратное, то общее увеличение 10x20 = 200 раз. Осветительное устройство (3) состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света. Зеркалослужит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало. Электроосветительустанавливается под конденсором в гнездо подставки. Конденсор (4) состоит из 2-3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта (5) соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект. Ирисовая диафрагма (6) расположена между осветителем и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света. Кольцо с матовым стекломили светофильтром(7)уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости. Механическая системамикроскопа состоит из штатива и подставки (основания), тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика. Штатив и подставка (8)- это основание микроскопа. Тубусодержатель (9) – держит тубус и револьвер. Тубус (10) - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять. Револьвер (11) предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера. Винт грубой наводки (макровинт) (12) используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении. Винт тонкой навидки (микровинт) (13) используют для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении. Предметный столик (14) предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора.   Рисунок 1. Основные части микроскопа. 2. Правила работы с микроскопом Цель работы: Научиться проводить фокусировку изображения на малом и большом (100х) увеличении микроскопа. При работе с микроскопом необходимо соблюдать операции в следующем порядке: 1. Работать с микроскопом следует сидя. 2. Микроскоп осмотреть, вытереть от пыли мягкой салфеткой объективы, окуляр, зеркало или электроосветитель. 3. Микроскоп установить перед собой, на расстоянии 2-3 см от края стола. Во время работы его не сдвигать. 4. Включить в сеть. 5. Поворотной ручной включить освещение нужной интенсивности. 6. Положить микропрепарат на предметный столик так, чтобы изучаемый объект находился под объективом. 7. Работу с микроскопом всегда начинать с малого увеличения. Опустить объектив 10х - в рабочее положение, т.е. примерно на расстояние 1 см от предметного стекла. 8. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока расстояние между нижней линзой объектива и микропрепаратом не станет 4-5 мм. Контролируя расстояние между препаратом и объективом вращать винт грубой наводки, плавно поднимая объектив до положения, при котором хорошо будет видно изображение объекта. Нельзя смотреть в окуляр и опускать объектив. Фронтальная линза может раздавить предметное или покровное стекло, и на ней появятся царапины!!! 9. Если изображение не появилось, то надо повторить все операции пунктов 7,8. 10. Для изучения объекта при большом увеличении, сначала нужно поставить выбранный участок в центр поля зрения микроскопа при малом увеличении. 11. Поменять объектив на 40х. При работе с использованием объектива 100х - нанести на препарат каплю иммерсионного масла. 12. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока объектив не коснется иммерсии. 13. При помощи микровинта добиться хорошего изображения объекта. 14. По окончании работы с большим увеличением, установить малое увеличение, поднять объектив, снять с рабочего столика препарат, протереть чистой салфеткой все части микроскопа, накрыть его полиэтиленовым пакетом и убрать с рабочего стола. 3. Координатные предметные столики. Назначение. Устройство. Правила использования. Цель: Научиться пользоваться координатным предметным столиком микроскопа и определять местоположение объекта на микропрепарате по нониусу. Исследование объектов на биологическом микроскопе неизбежно связано с перемещением препарата по плоскости столика в различных направлениях и на разные расстояния в зависимости от характера исследования и величины препарата. На общей сравнительно большой площади препарата очень трудно отыскать чрезвычайно маленькие участки препарата, вызывающие интерес исследователя. Для облегчения этой задачи исследователю необходимо замерить и записать координаты расположения интересующих его участков. С помощью этих координат можно легко вторично установить нужный участок в поле зрения микроскопа. Одним из удобных и простых приспособлений для перемещения препарата на столике в двух взаимно-перпендикулярных направлениях с определением координат (Х и У) расположения объектов является координатный предметный столик (рис. 2а) с препаратоводителем (рис. 2b) и шкалой нониуса (рис.2c).  Координатное перемещение осуществляют с помощью сдвоенной (коаксикальной) рукоятки (рис.3) вручную или от электропривода (сканирующие столики под управлением компьютерной программы).  Рисунок 3. Коаксикальная (сдвоенная) рукоятка предметного столика для перемещения изображения в вертикальном и горизонтальном направлениях. Диапазон перемещения препарата: - в продольном направлении (по координате «Х») - 80 мм, - в поперечном направлении (по координате «У») - 50 мм. На рисунке 4 нониус (нижняя шкала) показывает значение 7 целых и 6 десятых деления основной (верхней) шкалы. Целая часть обычно определяется по показаниям нулевого деления нониуса, а дробная часть определяется по номеру того деления нониуса, которое точно совпадает с делением основной шкалы (обведено красным пунктиром).  Рисунок 4. Координатная шкала. Координаты микрообъекта на препарате состоят из двух цифр, которые записываются через косую черту - значение по оси Х / значение по оси У (рис. 5). Например: 7,6/10,8.  Рисунок 5. Определение координат микрообъекта.4. Определение линейной меры микрообъекта с помощью координатного столика, препаратоводителя и шкалы нониуса. Цель : Научиться определять размер объекта по шкале нониуса. В лабораторных микроскопах, оснащенных координатным столиком, предусмотрена возможность определения линейных размеров (длины/ширины) микрообъектов с помощью шкалы нониуса. Допустимы точные измерения от 0,1мм и приблизительные – до 0.05 мм. С этой целью в окулярные тубусы микроскопа должны быть установлены окуляры с перекрестием либо с указателем (поинтер). Аккуратно поворачивая винты координатного перемещения образца (коаксикальной рукоятки), добиваются совпадения точки измеряемого объекта, принимая ее за исходную точку отсчета, с перекрестием. При этом фиксируется показание шкалы нониуса. Далее перемещением препаратоводителя по оси Х или по оси У (продольным либо поперечным перемещением) передвигаются к конечной точке отсчета, после чего устанавливают и фиксируют новые показания шкалы. Подсчитав разность установленных показаний, находят соответствующие линейные размеры исследуемого объекта. 5. Измерение ширины и длины объекта с помощью окуляра-микрометра и объекта-микрометра.Зачастую перед лаборантом также стоит задача установить линейные размеры отдельных микроэлементов и частиц исследуемого препарата. Для выполнения подобной задачи микроскоп необходимо оснастить специальным окуляром со шкалой или сеткой – окуляром-микрометром (рис.6), и калибровочной линейкой-слайдом – объектом-микрометром (рис.7). С помощью данных аксессуаров можно определить длину и ширину объекта в микрометрах (микронах). *Заметка 1. Независимо от того, используется монокулярный, бинокулярный или тринокулярный микроскоп, для выполнения микрометрических измерений необходим лишь один микрометрический окуляр. Т.е. в случае бино- или тринонасадки, нет необходимости в установке еще одного микрометрического окуляра во второй окулярный тубус. Более того, это было бы даже серьезной ошибкой, так как не позволило бы лаборанту видеть единую цельную картинку шкалы. Окуляр-микрометр представляет собой специальный окуляр, в котором в плоскости полевой диафрагмы окуляра (в плоскости промежуточного изображения) установлено дополнительное стеклышко с разметкой – шкалой для выполнения микрометрических измерений, вычисления длины и ширины частиц, величины зерна, глубины слоя (азотирования, цементации), размера микродефектов.  Рисунок 6. Окуляр-микрометр аппарат для определения размеров микроскоп, объектов. Представляет собой круглую стекляннуюпластинку со шкалой длиной 5 мм, разделенную на 50 делений (цена одного деления равна 10 мкм). Дляизмерения объекта нужно сделать следующее: 1) на диафрагму окуляра помещают О.-м. делениями вниз; 2) верхнюю линзу окуляра ввинчивают так, чтобы получилось хорошее изображение шкалы; 3) объект-микрометр(см.) располагают на столике микроскопа; 4) наблюдая в микроскоп, совмещают начальнуючерту шкал обоих микрометров; 5) находят совпадение линий на обеих шкалах и определяют цену деленияО.-м. - сколько делений О.-м. приходится на одно деление объект-микрометра (при данной оптике и длинетубуса); 6) измеряют объект, умножая число делений О.-м. на его цену. Если объектив или окуляр меняют, необходимо вновь рассчитать цену деления О.-м. по объект-микрометру. Цена деления самого окуляра-микрометра составляет 0,1мм. При наблюдении же в микроскоп цена деления зависит от конкретной комбинации окуляра и объектива, а также от длины тубуса микроскопа. Так, в идеальных условиях при выборе 100х объектива мы бы получили цену деления 0,001мм (1 микрометр). Методом интерполяции нетрудно было бы получить, что: 100х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,001мм=1мкм 40х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,0025мм 20х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,005мм 10х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,01мм 4х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,025мм Однако же, при производстве объективов принято считать допустимую погрешность увеличения в пределах 2-2.5%. Так, 100х объектив по факту может оказаться 97.5х или 102.5х. Но лаборанту не будет это известно до тех пор, пока не будет выполнена калибровка. По этой причине лаборанты вынуждены самостоятельно выполнять калибровку окуляра-микрометра для каждого объектива с помощью такого аксессуара, как объект-микрометр. И так как каждый объектив может иметь определенную погрешность увеличения, то ни о какой интерполяции на практике не может быть и речи. Объект-микрометр представляет собой специальное предметное стекло (пластину) со шкалой. В большинстве случаев, шкала выполнена в виде линейки длиной 1мм, разделенной на десятые и сотые доли. Цена деления такой линейки равна 0.01мм. Но встречаются и модели с ценой 0.1мм, а также есть необычные калибровочные слайды со специальными оригинальными сетками, окружностями, перекрестиями и т.п.  Рисунок 7. Объект-микрометр - предметное стекло с микрометрической сеткой (калибровочная линейка), предназначенное для калибровки микроскопа либо цифровой камеры для микроскопа при вычислении линейных размеров объекта, исследуемого под микроскопом. Итак, разместив объект-микрометр на предметном столике микроскопа, можно легко и просто выполнить калибровку окуляра-микрометра. Настроив резкость (фокус) при заданном объективе в микроскопе четко видны две сетки: сетка окуляра-микрометра и сетка объекта-микрометра. Поворачивая окуляр-микрометр в окулярном тубусе, и перемещая калибровочный слайд в плоскости предметного столика с помощью препаратоводителя, необходимо добиться того, чтобы штрихи-деления сеток окуляра и калибровочной линейки находились параллельно друг другу (рис.8).   Рисунок 8. Штрихи-деления сеток окуляра (окуляр-микрометр) и калибровочной линейки (объект-микрометр). Определив, сколько делений шкалы объекта-микрометра укладывается в шкале окуляра-микрометра для объективов большого и среднего увеличения, или, наоборот, для объективов малого увеличения, можно вычислить и непосредственно цену деления окуляра-микрометра по совершенно несложной математической формуле: Цок= N*Цоб/K,где Цок - цена деления окуляра-микрометра, Цоб – цена деления объектива-микрометра, N – число делений объектива-микрометра, K – число делений окуляра-микрометра. Если лаборант все время работает за одним микроскопом, то ему вполне достаточно единожды выполнить подобную поверку-калибровку для каждого объектива, запротоколировать у себя полученные данные и использовать их в дальнейшем. *Заметка 2. Учтите, что в случае, если микроскоп оснащен специальными объективами с механизмом коррекции на толщину покровного стекла, то все сравнительные микроскопические измерения следует выполнять при одинаковой настройке такого корректирующего устройства. *Заметка 3. Кстати, определять линейные размеры микроэлементов образца также можно и с помощью специальной цифровой камеры для микроскопа и соответствующего программного обеспечения. Объект-микрометр также используется для калибровки цифровой камеры для каждого объектива отдельно согласно инструкции к камере. Задание для самоподготовки. Изучить теоретический материал изложенный в данных МУ. Подготовить ответы на следующие вопросы: Что такое микроскоп? Что такое «разрешающая способность»? Что такое «полезное» и «бесполезное» увеличения микроскопа? Основные части оптической системы микроскопа, их функции. Основные части механической системы микроскопа, их функции. Как определить «общее увеличение микроскопа»? Что такое окуляр-микрометр и объект-микрометр? Их назначение. Оформить протокол лабораторной работы. |