рнк. Виды РНК. Транскрипция, регуляция. Процессинг.. Виды рнк, структура и функции. Транскрипция, регуляция. Процессинг
 Скачать 1.99 Mb.
|
Виды РНК, структура и функции. Транскрипция, регуляция. ПроцессингКаф. Теоретической биохимии с курсом клинической биохимии ВолгГМУ Центральная догма молекулярной биологииТранскрипция мРНК Ген (ДНК) В каждом типе клеток экспрессируется свой набор генов Трансляция Белок РНК-полимераза Транскрипция - это синтез всех видов РНК (мРНК, рРНК, tРНК) на матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой.Синтез РНК РНК-полимеразой
молекулы РНК спарена с матрицей ЦИСТРОН –последовательность нуклеотидов, кодирующих один продукт (мРНК , рРНК или tРНК) ГЕН – единица транскрипции эукариот ОПЕРОН – единица транскрипции прокариот ПРОМОТОР - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как посадочная площадка и старт синтеза РНК ТЕРМИНАТОР - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как финиш транскрипции ЭКЗОН – транскрибируемый и транслируемый участок гена эукариот ИНТРОН – транскрибируемый, но не транслируемый участок гена эукариот ЭНХАНСЕРЫ – последовательности нуклеотидов ДНК, которые усиливают транскрипцию САЙЛЕНСОРЫ - последовательности нуклеотидов ДНК, которые ослабляют транскрипцию РНК считывается с одной цепи ДНК5' 3' 3' 5' Противоположная цепь называется кодирующей некодирующая цепь кодирующая цепь ATGCTAT TAGCTGT 5’ AUGCUAU TACGATA UAGCUGU ATCGACA Считываемая цепь ДНК называется матричной или некодирующей. РНК РНК Принципы транскрипции:
Для каждого гена одна из цепей ДНК кодирующая. Разные гены могут считываться с противоположных цепей ДНК5' 3' 3' 5' ген 1 ген 3 ген 4 ген 2 ген 5 ген 6 Стадии транскрипцииИНИЦИАЦИЯ Промотор ЭЛОНГАЦИЯ ТЕРМИНАЦИЯ Терминатор
фосфодиэфирных связей
Транскрипция у прокариотОпределение: оперон - единица транскрипции у прокариотПринцип объединения цистронов в оперон: закодированные в них белки принимают участие в одном типе биохимических реакций. Структура оперона: В начале каждого оперона находится промотор. В конце - терминатор. Перед терминатором располагаются структурные гены, или цистроны. Между промотором и цистронами может находиться оператор. Оператор – особая последовательность нуклеотидов, узнаваемая белком –регулятором. У оператора диспетчерская функция - он разрешает или запрещает синтез РНКПромоторы отличаются и по первичной, и по вторичной структуре.TATA последовательность Прибнова Структура промотора для РНК-полимеразы E.coli ( 70) У большинства из них имеется общее свойство: ' У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же ферментом. Субъединичный состав РНК-полимеразы Е.coli (2)′ - holo-фермент (полный фермент). Без -фактора это core-фермент (2)′. Две субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы. ′ - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот. В - субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте. (сигма) - фактор - сменный фактор специфичности.
36500 дальтон 150000 дальтон ′ 155000 дальтон 70000 дальтон Этапы транскрипции Инициацияa. Узнавание и прочное связывание Как только произошло узнавание (позиция 1), РНК-полимераза перемещается в позицию 2. В каталитическом центре инициации транскрипции, находящемся в -субъединице, оказывается +1-ый нуклеотид оперона. Переход из позиции 1 в позицию 2 возможен, если на операторе нет белка-репрессора Транскрипция у прокариот : Инициация транскрипцииНаправление транскрипции Старт транскрипции Промотор Первый нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфатаb. Инициация заключается в образовании первой фосфодиэфирной связи между пурин-трифосфатом (АТФ или ГТФ) и следующим нуклеотидом. После инициации - фактор покидает фермент. ЭлонгацияЭлонгация - последовательное наращивание цепи РНК (или продолжение транскрипции). Скорость элонгации 40-50 нукл./сек. ТерминацияСпецифическая терминация бывает - независимой и - зависимой. В терминаторе присутствует палиндром, поэтому в синтезируемой РНК формируется шпилька. Шпилька меняет конформацию РНК-полимеразы и фермент теряет сродство к ДНК. -независимая терминация Терминация
четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью. РНК-полимераза замедляет ход, - фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента - и синтез РНК прекращается. -зависимая терминация Инициация (1-3)элонгация (4-5) Терминация (6-7) Регуляция транскрипции у прокариот
(Лактозный оперон) (Мальтозный оперон) (Триптофановый оперон) лигандом выключает оперон (Рибофлавиновый оперон) Транскрипция у прокариот : Регуляция транскрипцииРепрессия Активация Лактозный оперон E. сoli
Ре гу ля то р н ый у ч ас то к Стр у кту р н ые ге н ы Lac I: Ген-регу лятор Кодирует Lac -репрессо р p Lac: Промотор O: Оператор Lac Z: Ген кодирует - галактозидазу -галактозидаза расщепл яет лактозу с образованием глюкозы и галактозы . Галактоза превращ ается в глюкозу с участием продуктов генов галактозног о оперона. Lac Y: Ген кодирует галактозидпермеазу Транспорт лактозы в клетку Lac A: Ген кодирует галактозидтранса цетилазу (ацетилирует галактозу) ТИПЫ ОПЕРОНОВ
Индуцибельные – начальный субстрат стимулирует работу оперона и запускает реакции своего метаболизма (прямая положительная связь) Репрессибельные – регулятором служит конечный продукт, который «выключает» оперон и тормозятся реакции, ведущие к его синтезу (отрицательная обратная связь) lac-оперон (индуцибельный оперон). Обычно - выключенСхема негативной индукции оператор lac-оперонlac-оперонlac-оперон схема Жакоба и Моно (1961 год)ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ Lac-operonaВлияние глюкозы на работу Lac-оперонаГлюкоза препятствует активации lac-оперона, даже в присутствии лактозы в среде выращивания. Механизм: Влияние на связывание РНК-полимеразы с промотором. CAP (CRP) белок, белковый активатор катаболизмаВ присутствии САР-белка изменяется структура промотора и резко увеличивается его сродство к РНК-полимеразе Усиление транскрипции В отсутствии САР-белка, РНК –полимераза очень плохо связывается с промотором Транскрипция идет медленно (вяло) Существует позитивная регуляция работы lac-оперона (дополнительная индукция lac-оперона)Необходимые условия: наличие САР-белка и цАМФ
ферментом аденилатциклазой. Фосфодиэстераза превращает цАМФ в АМФ. Глюкоза активирует второй и инактивирует первый фермент. САР·цАМФ, активирующий посадку РНК-полимеразы на промотор. В присутствии лактозы lac-оперон включается и работает. Если же в клетке есть еще и глюкоза (более экономичный источник энергии), то нет цАМФ - и активатор не образуется, lac-оперон работает "вяло", без дополнительной индукции. Lac-оперонЛактоза - Глюкоза + - - + - + + Триптофановый оперон E. сoliСхема негативной репрессии
цистронов, которые кодируют ферменты последовательной цепи реакций синтеза триптофана. В норме оперон включен. Белок - репрессор неактивен (в форме апо- репрессора), он не способен связываться с оператором. триптофана. N+1-ая молекула взаимодействует с апорепрессором. Он меняет конформацию, садится на оператор и синтез РНК прекращается. Транскрипция у эукариотЕдиницей транскрипции у эукариот является отдельный ген, а не оперон, как у прокариот. Существуют специализированные ядерные РНК-полимеразы:
амонитину - токсину бледной поганки - пептиду включающему D-аминокислоты: polI - устойчива, polII - ингибируется при концентрации 10-8М, polIII - при 10- 6М амонитина. РНК-полимеразы I,II,III кодируются в ядре. РНК-полимеразы хлоропластов и митохондрий. Кодируются в ядре.
большинством генов. способна накрыть всю эту область. базальными факторами транскрипции Базальные факторы транскрипции - белки, необходимые для инициации транскрипции.
Основные факторы транскрипции РНК полимеразы II человека
-50 -30 -10 +10 +30 TATAAA D A TAAA TA D B A D TATAAA Pol II F A B TATAAA Pol II D F Инициация ИнициацияA E B Pol II TADTAAA F H Локальное плавление ДНК A TATAAA D Pol II РНК A E B Pol II Инициация Фосфорилирование С-концевого домена РНК полимеразы II TADTAAA F H Инициация Для любого гена, кодирующего белок, есть энхансерыос
может быть удален на расстояние несколько тысяч п.о.
витков спирали (20 п.н.), которые могут находиться перед, за и даже внутри гена. Таким образом, М1+М2+М3+М4 - один энхансер, но он состоит из 4-х модулей. Все 4 модуля узнаются своими белками, а они, сидя на ДНК, взаимодействуют друг с другом. Если в клетке присутствуют все соответствующие белки, то участку ДНК придается определенная конформация и начинается синтез mРНК. Определение: сайленсеры - последовательности ДНК, ослабляющие транскрипцию при взаимодействии с белками. Уровень транскрипции определяется суммой воздействия всех белков- регуляторовПроцессинг первичных транскриптовПроцессинг РНК – стуктурное и химическое созревание вновь синтезированных молекул РНК.РНК транскрипция процессингДНК пре-РНКрепликация, рекомбинация и репарацияДНКтрансляция белок свертыва- ние, сборка, процессинг Все рибосомные гены млекопитающих, кроме генов 5S рибосомной РНК, сближены (т.е располагаются один за другим) и образуя несколько кластеров.
белками, формируя большие и малые субъединицы рибосом, которые затем выходят в цитоплазму. Созревание транспортных РНКФормирование акцепторной петли. Появление минорных нуклеотидов. Остатки уридина восстанавливается (с образованием дигидроуридина), изомеризуются (псевдоуридина, метилируются (метилуридин). Некоторые остатки аденозина дезаминируются (превращаясь в инозин) и т.д. Установление антикодона в «правильное» положение химическая модификация мРНК-предшественника (гяРНК) и укорочением его размеров exon 1 intron 1 exon 2 7-метил гуанозин (сар) cap cap poly(A) cap 1. Кэпирование 5’-конца 2. Полиаденилирование 3’-области Транспорт зрелой мРНК в цитоплазму 5 ’ 3 ’ 5 ’ 3 ’ 3. Сплайсинг экзонов 5 ’ 3 ’ poly(A) Значение кэпирования
Значение полиаденилирования
(определяет время жизни мРНК) Процессинг мРНК у эукариот из пре-мРНК (гяРНК) Удаление интронов и сплайсинг экзонов Каталитический процесс удаления интронов и объединение экзонов называется сплайсингом. Число удаляемых интронов варьирует от 1 (актин дрожжей) до 50 (проколлаген млекопитающих).
ядре распадается. Сплайсинг проходит в специальной внутриядерной многокомпонентной структуре – сплайсосоме (десятки белков и 6 типов малых ядерных РНК, обеспечивающие сплайсинг).Белки мя РНК U1(165) U2(189) U3 (123) U4(145) U5(118) U6(108) 22 kDa 33 kDa 68 kDa
16 kDa 28 kDa Сплайсинг пре-мРНК в сплайсеосомеАльтернативный сплайсингАльтернативный сплайсинг- это образование разных мРНК из одной и той же пре-мРНК, синтезированной с одного гена. Это достигается благодаря комбинированию порядка и количества экзонов. С одного и того же гена синтезируются разные белки. Это явление тканеспецифично и зависит от стадии клеточного цикла. Тропомиозин, белок, участвующий в мышечном сокращении. В разных клетках с гена тропомиозина синтезируются разные белки (изоформы) Альтернативный сплайсинг Регуляция экспрессии генов путем альтернативного сплайсинга
белка, специфичных для различных конкретных тканей Пересмотр понятия «один ген – один белок» Ген – последовательность ДНК, которая транскри- бируется, как определенная единица и кодирует набор близкородственных полипептидных цепей (изоформ белка) Нарушение сплайсинга:
сплайсинг 12-го и 13-го экзонов гена Phe- гидроксилазы Редактирование РНК (editing)
Некоторые типы редактирования РНК (editing)(аполипопротеин В) - В ядре клеток кишечника присутствует специальный фермент цитозиндезаминаза, превращающий C в U: ЗРЕЛАЯ МОЛЕКУЛА мРНК ЭУКАРИОТИнгибиторы транскрипции Альфа-аманитин – пептидный токсин ядовитых грибов (бледной поганки), связывает РНК –Pol II у эукариот и блокирует синтез мРНК. Актиномицин D – антибиотик, прочно связывается с ГЦ-богатыми участками ДНК и блокирует движение РНК-Pol. Рифамицины – антибиотики, связывающиеся только с β-субъединицей бактериальной РНК-Pol и препятствует транскрипции (лечение туберкулеза) Дополнительные слайды |