Вопрос 1 Клеточная теория история и современное состояние. Значение клеточной теории для биологии и медицины
 Скачать 256.62 Kb.
|
|
Вопрос 47 Транскриптон. Генная регуляция эукариот. Вопрос 48 Позитивный и негативный конроль.Индукция и репрессия. Репрессия (repression)-Один из двух альтернативных (наряду с индукцией) механизмов регуляции действия генов, заключающийся в подавлении транскрипции или трансляции путем связывания белка-репрессора (кодируемого геном-регулятором) с оператором в ДНК либо специфическим участком мРНК. Кратко:В зависимости от характера взаимодействия оператора и регуляторного белка различают два типа регуляции активности генов в опероне: негативную и позитивную. При негативной, или отрицательной, регуляции связывание регуляторного белка с оператором репрессирует работу оперона, а при позитивной -наоборот, активирует его . В свою очередь негативной и позитивной могут быть как индукция, так и репрессия. В случае негативной индукции индуктор делает регуляторный белок неспособным связываться с оператором, и при этом структурные гены транскрибируются как, например, в лактозном опероне. При негативной же репрессии регуляторный белок приобретает свойства репрессора после взаимодействия с корепрессором. Таким корепрессором в триптофановом опероне служит накопленный в клетке триптофан, взаимодействие его с регуляторный белком приводит к подавлению транскрипции. При позитивной, или положительной, индукции под влиянием индуктора регуляторный белок (апоиндуктор) связывается с оператором и помогает РНК-полимеразе начать транскрипцию. В случае же позитивной репрессии корепрессор инактивирует апоиндуктор и тем самым способствует прекращению транскрипции. сли кому надо 52 вопрос Подробно:Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию для синтеза специфических белков. Эта теория, доказанная в опытах на бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках механизм регуляции синтеза белка вероятно более сложный. У бактерий доказана индукция ферментов (т. е. синтез ферментов de novo) при добавлении в питательную среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование которых катализируется этими же ферментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых ферментов. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления — индукция и репрессия — взаимосвязаны. Согласно теории Жакоба и Моно в биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере три типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано выше, служит матрицей для биосинтеза белка. Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена или структурных генов, регулируемых им. «Считывание» генетического кода, т. е. формирование мРНК, начинается с промотора— участка ДНК, являющегося точкой инициации для синтеза мРНК, и далее распространяется последовательно вдоль оператора и струк¬турных генов. Координированный одним оператором одиночный ген или группа структурных генов образует оперон. В свою очередь деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Поскольку структурные гены и ген-регулятор находятся в разных участках цепи ДНК, связь между ними, как предполагают Ф. Жакоб и Ж. Моно, осуществляется при помощи вещества-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка, т.е. функция гена-регулятора состоит, в том, чтобы через белок-репрессор прекращать деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфически связываться с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. Когда такой индуктор соединяется с репрессором, последний теряет способность связываться с геном-оператором, который таким образом выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Этот процесс аналогичен взаимоотношениям аллостерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет способность связываться со своим субстратом. Вопрос 49 Физические карты.Виды.Способы построения.Разрешающая способность. Физическая карта – графическое представление порядка следования физических маркеров (фрагментов молекулы ДНК), расстояние между которыми определяется в парах нуклеотидов. Разрешение – от 2Мб до 100 кб. База- 1 пара нуклеотидов. В 60-е годы цитогенетики использовали методы окрашивания хромосом для выявления так называемых бэндов (поперечных полосок) на хромосомах. В 70-х годах научились разрезать ДНК на участки ферментами, узнающими коротенькие отрезки, в которых информация записана в виде палиндромов (перевертышей), читаемых одинаково в обоих направлениях: с начала до конца и с конца до начала. Эти ферменты были названы рестрикционными. С их помощью построили так называемые рестрикционные физические карты. Виды физических карт: 1) Рестрикционная карта – вид физической карты, на которой указан порядок следования и расстояния между сайтами расщепления ДНК рестриктазами (обычно участок узнавания рестриктазы 4-6 п.н.). Маркерами этой карты являются рестрикционные фрагменты/сайты рестрикции.Различают 2 стратегии построения: 1)стратегия «Сверху вниз» - ДНК расщепляется рестриктазами, затем для каждого из фрагмнтов ДНК строится рестрикционная карта.2)стратегия «снизу вверх» - расщепление на мелкие фрагменты, которые после идентификации объединяются в контиги(клонотека последовательностей), по которым составляются рестрикционные карты. Для построения рестрикционной карты используют гибридизацию по методу Е. Саузерна. 1. Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты. 2. Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине. 3. В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану. 4. В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК. 5. Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий. 6. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран). 7. Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной. 8. После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путем авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания). 2) Химические карты – расположение по длине хромосомы А-Т и Г-Ц пар неклеотидных оснований, которые выявляются с помощью химического анализа. 3)Секвенсовые карты. Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод "терминаторов" Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи»(метод терминирующих аналогов трифосфатов), был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. Более мощный и более технологичный, этот способ, несколько модифицированный, применяется до сих пор. В основе метода тоже лежало ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов. Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту : метод химической деградации В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. Препарат меченной ДНК разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилирование адениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента. Вопрос 50 Методы ДНК-диагностики ДНК-диагностика - это группа методов, которые основаны на выявлении ДНК возбудителя в забранном у пациента материале. Методы ДНК-диагностики включают в себя такие методы, как ПЦР (полимеразная цепная реакция) и ЛЦР (лигазная цепная реакция). Для исследования методом ПЦР может быть забран практически любой материал. На анализ берут по особой методике соскоб из мочеиспускательного канала, влагалища и шейки матки. Также материалом для ПЦР могут служить кровь, моча, мокрота и т. п. В ходе различных манипуляций, ДНК инфекции (если она присутствует в забранном материале) многократно удваивается, пока количество ДНК не станет равным 10 8 — 10 12 штук. Это количество ДНК становится заметным для оборудования, которое проводит диагностику. Таким образом, ПЦР позволяет обнаружить даже одного возбудителя, даже часть возбудителя в пробирке: если хоть один кусочек ДНК вредоносной инфекции есть, он будет «размножен». Разновидности методов ДНК-диагностики. В гуманной медицине используют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики. При прямой диагностике обнаруживают мутации клонированного гена, когда известна его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательность полноразмерной комплементарной ДНК. Используя прямые методы ДНК-диагностики обнаруживают мутации, изменяющие длину разрезанных фрагментов ДНК, которые выявляют электрофарезом на каком-то из указанных выше геле. Если мутации известны, то их выявляют с помощью ферментов-рестриктаз, которые распознают строго определённые нуклеиновые последовательности. Использование ферментов бактериального происхождения – рестриктаз позволяет разрезать двойную нить ДНК в определённых последовательностях из 4-8 нуклеотидов. Разрезанные участки мутантной ДНК, отличающиеся по длине от нормальных участков. Разница в размерах мутагенных и нормальных участков ДНК выявляется методом электрофареза на агарозном или полиакриламидном геле. Для выявления точечных мутаций используют аллельспецифическую полимеразную цепную реакцию, позволяющую многократно увеличивать уникальную последовательность ДНК с последующим выявлением мутации. Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в тех случаях, когда при наследственных заболеваниях ген не клонирован или заболевания сопровождается повреждением различных генов, либо молекулярная организация гена не позволяет использовать прямые методы. Косвенная ДНК-диагностика в основном сводится к анализу полиморфных генетических маркеров. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах (по составу нуклеотодов, числу нуклеотидных поворотов). На основании изменчивости состава маркеровых участков ДНК дифференцируют материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни (маркер и ген близко располагаются друг к другу). При проведении косвенных методов ДНК-диагностики исследованных болезней осуществляют те же этапы подготовительных операций, что и при осуществлении прямых методов ДНК-диагностики. Методами ДНК-диагностики широко пользуются в зоотехнической практике. Вопрос 51 Генотерапия — совокупность генноинженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний. Это новая и бурно развивающаяся область, ориентированная на исправление дефектов, вызванных мутациями (изменениями) в структуре ДНК, или придания клеткам новых функций. Ретровирусные векторные системы. Ретровирусы относятся к группе вирусов, РНК-геном которых в инфицированных клетках конвертируется в ДНК. Геном ретровирусов включает три структурных гена, обозначенные как gag, pol и env, фланки- рованых элементами, названными длинными терминальными повторами (LTR, viral long terminal repeat). В LTR содержатся регуляторные элементы, выполняющие важные функции в жизненном цикле ретровируса. Эти повторы необходимы для интеграции ДНК копии генома вируса с геномом хозяина. Они определяют, где начало и где конец вирусного генома. LTR также служат энхансер-промоторными последовательностями, т.е. они контролируют экспрессию генов вируса. Большой геном ретровирусов облегчает генетические манипуляции. После инфицирования клетки-мишени копия ретровирусной ДНК интегрируется с ее геномом строго определенным образом. Практически все инфицированные клетки способны экс- прессировать гены, привнесенные вирусом. Мощные транскрипционные энхансеры существенно повышают уровень экспрессии генов, клонированных в клетках различных типов. С их помощью можно переместить до 8 т.п.о., что в большинстве случаев более чем достаточно для синтеза крупномолекулярных белков. Весьма удобным для исследователя является то обстоятельство, что ретровирусные векторы можно размножать, достигая их высокой концентрации в небольшом объёме - более 109 вирусных частиц/см3. В опытах по инфицированию ретровирусами мозга, печени, мышц, глаз или клеток панкреатических островков грызунов показана устойчивая экспрессия трансгенов в течение более 6 мес. [9]. Ранние этапы жизненного цикла ретровирусов и векторов на их основе показаны на рис. 1. Векторы на основе ретровирусов с самого начала их разработки предназначались для введения через неповрежденные клетки за счет механизмов слияния, обеспечиваемых поверхностными белками оболочки вируса. Чувствительность дыхательного эпителия к ретровирусным инфекциям подразумевает возможность ингаляционного пути введения в организм человека векторных конструкций на основе ретровирусов. Вопрос 52 Изменчивость – универсальное свойство живого изменять свои признаки под действием среды. Различают изменчивость наследственную и ненаследственную. Под наследственной изменчивостью понимают способность к изменениям самого генетического материала, а под ненаследственной - способность организмов реагировать на условия окружающей среды, изменяться в пределах нормы реакции, заданной генотипом. Наследственную изменчивость в свою очередь подразделяют на комбинативную и мутационную. Комбинативная изменчивость представляет собой результат перекомбинации генов и перекомбинации хромосом, несущих различные аллели, и выражается в появлении разнообразия организмов - потомков, получивших новые комбинации дискретных единиц генетического материала, уже существовавших у родительских форм. Мутационная изменчивость — изменчивость, вызванная действием на организм мутагенов, вследствие чего возникают мутации. Принято также выделять онтогенетическую изменчивость. Онтогенетическая изменчивость - это реализация нормы реакции организма во времени, в ходе его индивидуального развития. По этому критерию она относится к ненаследственной изменчивости. Существует ряд факторов, несомненно указывающих и на изменения самого генетического материала в ходе онтогенеза, что приближает онтогенетическую изменчивость к наследственной. Ген, имеющийся в генотипе в необходимом для проявления количестве (1 аллель для доминантных признаков и 2 аллеля для рецессивных) может проявляться в виде признака в разной степени у разных организмов (экспрессивность) или вообще не проявляться (пенетрантность). Причины: 1) модификационная изменчивость (воздействие условий окружающей среды) 2) комбинативная изменчивость (воздействие других генов генотипа). Экспрессивность – степень фенотипического проявления аллеля. Например, аллели групп крови АВ0 у человека имеют постоянную экспрессивность (всегда проявляются на 100%), а аллели, определяющие окраску глаз, – изменчивую экспрессивность. Рецессивная мутация, уменьшающая число фасеток глаза у дрозофилы, у разных особей по разному уменьшает число фасеток вплоть до полного их отсутствия. Пенетрантность – вероятность фенотипического проявления признака при наличии соответствующего гена. Например, пенетрантность врожденного вывиха бедра у человека составляет 25%, т.е. болезнью страдает только 1/4 рецессивных гомозигот. Медико-генетическое значение пенетрантности: здоровый человек, у которого один из родителей страдает заболеванием с неполной пенетрантностью, может иметь непроявляющийся мутантный ген и передать его детям. Норма реакции. Предел проявления модификационной изменчивости организма при неизменном генотипе — норма реакции. Норма реакции обусловлена генотипом и различается у разных особей данного вида. Фактически норма реакции — спектр возможных уровней экспрессии генов, из которого выбирается уровень экспрессии, наиболее подходящий для данных условий окружающей среды. Норма реакции имеет пределы или границы для каждого биологического вида (нижний и верхний) — например, усиленное кормление приведет к увеличению массы животного, однако она будет находиться в пределах нормы реакции, характерной для данного вида или породы. Норма реакции генетически детерминирована и наследуется. Для разных признаков пределы нормы реакции сильно различаются. Например, широкие пределы нормы реакции имеют величина удоя, продуктивность злаков и многие другие количественные признаки), узкие пределы — интенсивность окраски большинства животных и многие другие качественные признаки. Тем не менее, для некоторых количественных признаков характерна узкая норма реакции (жирность молока, число пальцев на ногах у морских свинок), а для некоторых качественных признаков — широкая (например, сезонные изменения окраски у многих видов животных северных широт). Кроме того, граница между количественными и качественными признаками иногда весьма условна. Классификация изменчивости. Комбинативная изменчивость представояет собой изменения генотипа потомков в результате перекомбинации родительских генов. Механизмы комбинативной изменчивости: 1) независимое расхождение хромосом в анафазу І мейоза. 2) Кроссенговер 3) Случайное слияние гамет 4) Случайный подбор родительских пар |