Вопросы Санитарнопоказательные микроорганизмы, представители
 Скачать 31.09 Kb.
|
|
Вопросы: 1.Санитарно-показательные микроорганизмы, представители 2. Показатели и микроорганизмы, наиболее часто определяемые в объектах окружающей среды и продуктах. 3.Общие принципы культивирования и идентификации бактерий 4.Классические методы идентификации бактерий: -морфологические и тинкториальные методы; -культуральные методы; - сахаролитические свойства микроорганизмов; - протеолитические свойства микроорганизмов; - липолитическая активность микроорганизмов; 5.Хромогенные питательные среды 6.Хроматографические методы идентификации 7.Иммунологическая диагностика Вопрос №1. Санитарно-показательные микроорганизмы, представители. Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ) – это представители нормальной микрофлоры, которые выделяются из организма человека и животных со всеми экскретами. Санитарно-показательные микроорганизмы являются индикаторами биологического загрязнения окружающей среды, в том числе – производственных помещений, объектов животноводства, поверхности овощных и плодовых культур, тары и т.п. Выделяют несколько групп микроорганизмов, обнаружение которых в объектах окружающей среды говорит о различных видах загрязнения. Но между группами СПМ нет четких границ, так как некоторые микроорганизмы являются показателями различных видов загрязнения. Группа А включает обитателей кишечника человека и животных. Они являются индикаторами фекального загрязнения. В нее входят бактерии группы кишечной палочки (БГКП), энтерококки, протеи, сальмонеллы, клостридии, термофилы, бактериофаги и др.; Группа В включает обитателей верхних дыхательных путей и носоглотки. Они являются индикаторами орального загрязнения. В нее входят стафилококки, а также зеленящие и гемолитические стрептококки, постоянно обитающие на слизистой оболочке верхних дыхательных путей и выделяющиеся в воздушную среду при разговоре, кашле, чиханье; Группа С включает микроорганизмы-сапрофиты, обитающие во внешней среде. Они являются индикаторами процессов самоочищения. В нее входят амонифицирующие, нитрифицирующие бактерии, некоторые спорообразующие бактерии, грибы, актиномицеты, сине-зеленые водоросли. Вопрос №2.Показатели и микроорганизмы, наиболее часто определяемые в объектах окружающей среды и продуктах. Характеристика основных групп СПМ . Бактерии группы кишечной палочки. Группа кишечных палочек относится к семейству Enterobacteriaceae и включает рода: Escheriehia, Citrobacter и Enterobacter. Бактерии, относящиеся к этим родам, очень сходны между собой по морфологическим и биологическим свойствам. К бактериям группы кишечных палочек относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при 37°С в течение 24-48 ч или сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при 37°С в течение 24 ч и не обладающие оксидазной активностью. На среде Эндо они растут в виде темно-красных колоний с металлическим блеском или без него либо в виде розовых колоний с темным центром. Термотолерантные колиформные бактерии обладают теми же характеристиками, но дополнительно сбраживают лактозу с образованием кислоты и газа при 44,5 °С через 24 ч. Обнаружение бактерий группы кишечных палочек следует рассматривать как показатель фекального загрязнения объекта исследования, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения. Санитарнопоказательное значение отдельных родов бактерий группы кишечных палочек неодинаково. Обнаружение бактерий рода Escherichia в пищевых продуктах, воде, почве, на оборудовании свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, что имеет большое санитарное и эпидемиологическое значение. Считают, что бактерии родов Citrobacter и Enterobacter являются показателями более давнего (несколько недель) фекального загрязнения и поэтому они имеют меньшее санитарнопоказательное значение по сравнению с бактериями рода Escherichia. Бактерии рода Enterococcus являются нормальными обитателями кишечника, но выделяются во внешнюю среду в меньших количествах, чем кишечные палочки. Энтерококки быстрее отмирают в воде и почве. Как правило, они не размножаются в этих объектах, что позволяет рассматривать их как показатель свежего фекального загрязнения. Присутствие энтерококков считают дополнительным показателем фекального загрязнения воды и других объектов. Однако их выделение требует более сложных при приготовлении сред и растут они медленнее. Бактерии рода Proteus обитают как в кишечнике человека и животных (P. mirabilis), так и в гниющих остатках (P. vulgaris). Присутствие протеев в объектах окружающей среды свидетельствует об их загрязнении разлагающимися субстратами и крайне неблагополучном санитарном состоянии. Бактерии рода Clostridium. К санитарно-показательным клостридиям относят группу грамположительных, спорообразующих анаэробных палочек, редуцирующих сульфит (почернение среды Вильсона-Блера) при инкубации в условиях 45°С в течение 12—24 ч. Эта группа в основном представлена Cl. perfringens, которые встречаются в кишечнике большинства людей в значительно меньших количествах, чем кишечная палочка. Клостридии более, устойчивы, чем не образующие спор БГКП и энтерококки. Присутствие микроорганизмов рода Clostridium в различных объектах окружающей среды свидетельствует об их фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем. Определение санитарно-показательных клостридий рекомендуют проводить в почве и воде, а также при выборе новых источников водоснабжения. Термофильные бактерии представлены полиморфной группой преимущественно спорообразующих бактерий, способных размножаться при 50-70ºС (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus lactis и др.). Во внешней среде термофилы обнаруживают на субстратах, загрязненных навозом или компостом, так как в процессе гниения в этих субстратах создается оптимальная температура для роста этих микробов. Бактериофаги кишечных бактерий – эшерихий, шигелл и сальмонелл – постоянно обнаруживают там, где есть бактерии, к которым 11 они адаптированы. Однако колифаги выживают во внешней среде дольше (8- 9 мес.), чем соответствующие бактерии (4-5 мес.), а также способны адаптироваться к другим видам бактерий. Стафилококки (S. aureus), а также зеленящие и гемолитические стрептококки являются санитарно-показательными микроорганизмами загрязнения воздуха закрытых помещений. Источниками загрязнения патогенными стрептококками и стафилококками являются больные люди, страдающие хронической инфекцией, и здоровые люди – носители. Во внешней среде стрептококки сохраняют жизнеспособность в течение примерно тех же сроков, что и возбудители дифтерии, а стафилококки — даже дольше. Чем большее количество стрептококков обнаруживают в воздушной среде, тем вероятнее возможность заражения человека воздушно капельными инфекциями. Нарастание обсемененности воздуха S. aureus и частое его обнаружение свидетельствуют о санитарно-эпидемиологическом неблагополучии. В лечебных учреждениях вторичным источником обсеменения воздуха золотистым стафилококком могут быть загрязненные постельные принадлежности, белье, с которых эти микроорганизмы попадают в воздух. Наиболее полную картину воздушно-капельного загрязнения воздуха дает определение и стрептококков, и стафилококков. Однако ввиду того, что стрептококки довольно трудно культивировать, в лабораторной практике ограничиваются выделением S. aureus. Вопрос №3. Общие принципы культивирования и идентификации бактерий. Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов — риккетсий, хламидий, вирусов, а также простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах, которые должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма и факторы роста., т.е. быть полноценными. Выделение микроорганизмов из различных патологических материалов, полученных от больного человека, широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно исследовательской работе, а также при производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности. Большинство патогенных и условно-патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 1-2 суток. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша — в 2-4 суток, а микобактерии туберкулеза — в 3-4 недели. В клинической бактериологической диагностике идентификацию проводят только «чистых культур» бактерий, выделенных из исследуемого материала, полученного от больного. С этой целью используют свежеприготовленные, искусственные питательные среды, предварительно разлитые в чашки Петри. Выбор питательной среды для выделения чистой культуры возбудителей имеет важнейшее значение в бактериологической диагностике. Для первичного посева обычно применяют комплекс сред, включающий среды обогащения, элективные среды, среды с повышенной питательной ценностью для трудно культивируемых микроорганизмов и дифференциально-диагностические питательные среды. При идентификации культур проводят определение их родовой и видовой принадлежности, а при необходимости и внутривидовое типирование. Результат получают по совокупности данных: 1. морфологических, основанных на выявлении характерных особенностей ультраструктуры возбудителя и их тинкториальных свойств (чаще окраска по Граму); 2. кулътуральных, основанных на выделении чистой культуры микроорганизмов на плотной питательной среде, с изучением особенностей выросших колоний; 3. биохимической активности культур. В том числе: оксидазной и каталазной активности, способности ферментировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др.), образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий. Реже используются тесты ассимиляции азота, определение уреазной активности и активности отдельных специфических ферментов; 4. иммунологических, основанных на выявлении антигенов (АГ) возбудителя или антител (АТ) к ним. Идентификацию возбудителей по их антигенным свойствам проводят в реакциях ориентировочной агглютинации, ко-агглютинации, латексной агглютинации, преципитации или иммунофлюоресценции (прямой или непрямой). Антитела к возбудителю определяют в серологических реакциях: развернутой реакции агглютинации, непрямой агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммуноферментном и радиоиммунном методах и др.; 5. молекулярно-генетических, основанных на определении специфичных нуклеотидных последовательностей в цепи ДНК при помощи короткой эталонной цепи ДНК (праймера). С этой целью используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию и их модификации, метод генетических зондов, сэндвич-гибридизацию и др. Вопрос№4. Классические методы идентификации бактерий: Морфологические и тинкториальные методы Это классическое направление исследований. Позволяют выявить характерные морфологические структуры возбудителя непосредственно в клиническом материале, путем приготовления мазков окрашенных простыми или сложными методами. Ценность бактериоскопического метода состоит в простоте, доступности методик и быстроте получения результатов. Однако специфичность его в связи с близостью морфологии разных видов мала, а чувствительность ограничена -разрешающая способность метода составляет в среднем 100 000 клеток в мл. Наиболее распространенной методикой окраски является окраска по Граму, что позволяет судить о строении клеточной стенки микроорганизмов. Окраска по Нейссеру позволяет выявить специфические метахроматические включения волютина, по Цилю-Нильсону – кислотоустойчивые бактерии, по Ожешки- споры, по Бурри-Гинсу- капсулу. Фазово-контрастная и темнопольная микроскопия позволяют провести прижизненное изучение микроорганизмов, обнаружить их специфическую подвижность. Люминисцентная микроскопия используется как метод экспрессдиагностики в прямом и непрямом вариантах. Исследование носит ориентировочный характер. Культуральные методы Классический бактериологический метод остается «золотым стандартом» при диагностике большинства современных инфекций. Этот метод предполагает посев материала на плотные питательные среды с последующим выделением и идентификацией чистой культуры микроорганизма, определением чувствительности возбудителя к антибактериальным препаратам и бактериофагам. Основной недостаток классического метода- длительность исследования. Так, по быстрорастущим микробам результат может быть получен не ранее, чем через 2-3 суток после посева на плотную среду. Рост микроскопических грибов регистрируется существенно позже от 5-7 дней и до 21 дня. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и с суженной диафрагмой. Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции. Величина колонии определяется ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более). Форма колонии бывает правильная — круглая, неправильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев. Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Консистенцию колонии, определяющую ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей. Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды микробов дают колонии 12 различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др. Для идентификации выделяемых культур по биохимическим свойствам в состав сред обычно вводят дифференцирующие субстраты и соответствующие индикаторы. В классическом варианте это углеводы (лактоза, сорбит, сахароза и т. д.), мочевина пли другие субстраты, при расщеплении которых микробными ферментами образуются вещества, изменяющие рН или окислительно-восстановительный потенциал среды. В результате появления продуктов ферментации индикатор окрашивает, например, колонии микробов и среду вокруг, помогая отличить их от бесцветных (неокрашенных) колоний микробов, не ферментирующих данный субстрат. Дифференциация при таком подходе осложняется тем, что сахаролитические и протеолитические ферменты Рост лактозо- положительных бактерий на среде Эндо микроорганизмов весьма многообразны и универсальны (часто встречаются у представителен разных видов). Это обусловливает относительно невысокие дифференцирующие свойства традиционных сред. Для более четкой дифференциации культур у них желательно определять родо- и/или видоспецифические ферменты. Сахаролитические свойства микроорганизмов Различные виды и даже разновидности микробов относятся поразному к одним и тем же сахарам. Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, «пестрый ряд» — дифференциально - диагностические среды. Среду Гисса выпускают полужидкой с индикатором BP (смесь водного голубого и розоловой кислоты). В качестве углеводов используют пентозы (арабинозу, ксилозу, рамнозу), гексозы (глюкозу, левулезу, маннозу, галактозу), дисахариды (мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, целлобиозу, мелибиозу), трисахариды (раффинозу, мелицитозу), полисахариды (инулин, декстрин, растворимый крахмал, гликоген), высокоатомные спирты (глицерин, эритрит, адонит, арабит, маннит, дульцит, сорбит, инозит), глюкозиды (салицин, эскулин, кониферин, арбутин). Исследуемую культуру засевают уколом петли в столбик среды, и инкубируют в термостате при 37°С сутки или более в зависимости от идентифицируемого вида. По изменению цвета индикатора после посева судят об образовании кислых продуктов; заполнение поплавка газом или разрыв агара указывает на образование газа из углевода. Если культура не ферментирует углевод, цвет индикатора не изменяется и образования газа не наблюдается. Протеолитические свойства микроорганизмов Среды, содержащие белок и выявляющие способность микробов расщеплять белки: мясо-пептонная желатина «столбиком», свернутая лошадиная или бычья сыворотка, молоко, мясо-пептонный бульон. Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. При посеве бактерий проколом в мясо-пептонную желатину, «столбиком» в случае расщепления белка наблюдают разжижение среды. При посеве на среду со свернутой сывороткой расщепление белка определяют по разжижению среды и образованию углублений на ее поверхности. Расщепление микробом молока выявляется просветлением или растворением первоначально свернувшегося молока. В посевах в пептонную воду определяют продукты расщепления аминокислот после инкубирования в течение 2—3 суток при 37 °С путем постановки реакций на аммиак, индол, сероводород и др. Метод Мореля. В питательную среду (МПБ + 0,01% триптофана) сеют исследуемую культуру. В пробирку подвешивают индикаторную бумажку, смоченную щавелевой кислотой, так, чтобы бумага не касалась среды. Инкубируют 24 часа при 37°С. При образовании индола нижняя часть бумаги окрашивается в красный цвет. При образовании сероводорода нижняя часть бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца, окрашивается в черный цвет в результате образования сернистого свинца. У анаэробов протеолитическая активность приводит к образованию масляной и уксусной кислот и NH3 или глутаминовой кислоты и СО2. Липолитическая активность микроорганизмов Липиды подвергаются гидролитическому разложению под действием липаз. В среду добавляют водный раствор твина соответствующей концентрации (твин 80, 40 или 20). Среду разливают в чашки Петри. Когда агар застывает, на поверхность агаровой пластинки высевают штрихом или уколом исследуемый микроорганизм. Засеянные чашки Петри выдерживают при соответствующей температуре необходимое для роста микроорганизма время. На наличие липазы указывает образование вокруг штриха или 18 колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из твина. Примерами липолитической активности является тест на лецитовителлазную активность бактерий. Обнаружение свободных жирных кислот, ароматических соединений (диацетил, ацетоин), гемолитической активности (фосфолипазы бактерий), обнаружение арахидоновой кислоты и др. Среды, выявляющие способность микробов усваивать вещества, которые не усваиваются другими микробами, например, среда с лимоннокислым натрием (цитратный агар Симонса). Классические пробирочные тесты для исследования биохимической активности микроорганизмов сохраняют свое значение и в настоящее время. Биохимические тесты надежны, но трудоемки и А- отрицательный тест В- положительный тест требуют больших временных затрат. Их применение позволяет проводить верификацию анализа как в референтных, больших, так и в небольших лабораториях, причем круг идентифицируемых микроорганизмов довольно широк. Особое значение имеют верификационные исследования с применением пробирочных тестов при внедрении и в период эксплуатации других тест-систем для идентификации, при анализе деятельности лабораторий и отдельных специалистов (в ходе лицензирования и сертификации). Вопрос№5. "Хромогенные" питательные среды В последнее время широко используют "хромогенные" питательные среды, позволяющие уже на первом этапе микробиологического исследования, через 24 часов получить видовое название возбудителей. Такие хромогенные питательные среды разработаны, как для бактериальных культур, так и микроскопических грибов. Это дифференциальные среды нового поколения, принцип действия которых основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микроорганизмов. К таким ферментам относятся, например, /J-D-глюкуронидаза Escherichia coli или /S-D-глюкозидаза энтерококков. Для обнаружения уникального фермента и, соответственно, идентификации микроорганизма, в состав среды вводят хромогенный субстрат вещество, при расщеплении которого этим ферментом образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате микробный рост окрашивается в определенный цвет или приобретает способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении. Поскольку хромогенный субстрат или их смесь вводятся в состав сред (в том числе селективных) для первичного посева, то результат выделение чистой культуры и ее идентификация может быть получен уже в течение первых суток исследования. Иногда при этом требуется проведение быстрых подтверждающих тестов (например, капельный тест на индол с реактивом Ковача для Е coli). Компания HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия) в числе немногих производителей высококачественных хромогенных сред для микробиологических исследований и абсолютный лидер по ассортименту поставляемых сред этой серии. Хромогенные среды компании HiMedia предназначены для быстрого (в течение 24 ч) обнаружения в исследуемом материала целого ряда микроорганизмов, имеющих большое значение для клинической и санитарной микробиологии: Е. coli и другие колиформные бактерии, сальмонеллы и энтерогеморрагические эшерихии (Е. coli O157:H7), энтерококки и Staphylococcus aureus, клостридии и синегнойная палочка, а также Candida albicuns и другие актуальные грибы и бактерии. Ускоренная диагностика кандидозов. Культивирование Candida spp, и прямая идентификация, оценка их чувствительности к антимикотическим химиопрепаратам (48 часов). хромогенной среде. Так, колонии C.albicans (60-80% культур), всегда окрашены в синий цвет, колонии других видов кандид бесцветны. Их дальнейшая идентификация проводится с помощью "Фунгискрина" («Fongiscreen» Санофи Пастер, Франция), который четко идентифицирует 4 вида грибов, которые наиболее часто выявляются в клинической практике. Спектр определяемой микрофлоры может быть расширен, при сочетании данного теста и визуальной оценки морфологии микроорганизмов, т.е. таких признаков как наличие капсул, спор, окраска колоний. Хромогенная реакция на изучении энзиматического профиля, протекает в течение нескольких часов. Принцип действия. Хромогенные среды включают хромогенные (флюорогенные) субстраты для выявления специфических ферментативных активностей микроорганизмов, характерных для группы (например, колиформы) или отдельного вида (например, E.coli) микроорганизмов. Исследуемый микроорганизм содержит фермент, который метаболизирует бесцветный хромогенный субстрат, образуя окрашенный продукт реакции. Хромогенная среда контрастно изменяет свой цвет (или флюоресцирует) при обнаружении исследуемого микроорганизма. Нет необходимости в проведении пересевов и постановке дальнейших биохимических тестов для идентификации микроорганизмов. - Rambach Agar – хромогенный агар Рамбах для обнаружения и идентификации сальмонелл. Специфичность агара 99%, чувствительность 97-99%. - Chromocult Listeria Selective Agar (Ottaviani, Agosti) - хромогенный агар Оттавиани-Агости для обнаружения и идентификации Listeria monocytogenes. - Chromocult Coliform Agar (CCA) – хромогенный агар для одновременного обнаружения и подсчета колиформных бактерий и E.coli в термически обработанных продуктах и питьевой воде. - Chromocult Coliform Agar ES (CCA ES) – хромогенный агар усиленной селективности для одновременного обнаружения и подсчета колиформных бактерий и E.coli в сырье, сырых продуктах, воде открытых водоемов. - Fluorocult LMX – хромогенная среда для одновременного обнаружения колиформных бактерий и E.coli в продуктах, сырье и смывах. - Readycult Coliforms 100 – готовая к использованию стерильная, взвешенная хромогенная среда в гранулированном виде для одновременного обнаружения колиформных бактерий и E.coli в 100 мл воды. Вопрос№6. Хроматографические методы идентификации По агрегатному состоянию фаз хроматографию разделяют на газовую и жидкостную. Газовая хроматография включает газожидкостную и газотвердофазную; жидкостная – жидкостно-жидкостную и жидкостно-твердофазную. Первое слово в названии метода характеризует агрегатное состояние подвижной фазы, второе – неподвижной. Указанные хроматографические методы дают возможность проводить качественный и количественный анализы лекарственных средств, изучать их физико-химические свойства, осуществлять контроль и автоматическое регулирование технологических процессов. Позволяют обнаружить составные части клеточной стенки возбудителей в исследуемом материале. но и специфичные для данной группы микроорганизмов метаболиты. Вопрос№7. Иммунологическая диагностика Определение антигенов возбудителей часто является единственным методом экспресс- диагностики. Основан на обнаружении антигенов возбудителя в крови или иных биологических жидкостях, т. е. частиц возбудителя. Широко используются различные реакции агглютинации, преципитации и их модификации, а также РИФ (прямой или непрямой варианты). Реакция агглютинации на стекле. Агглютинация зависят от АГ строения бактериальной клетки (микроорганизма). Корпускулярные частицы (бактерии, клетки) находящиеся во взвешенном состоянии в присутствии АТ склеиваются между собой. Ставится с чистой культурой возбудителя и диагностическими агглютинирующими сыворотками. Позволяет идентифицировать возбудителя по его антигенным свойствам. Н- агглютинация сопровождается образованием крупных хлопьев и проявляется быстро. О- агглютинация сопровождается образованием мелких зерен и проявляется медленно. Реакция Ко-агглютинации. Белок А стафилококков имеет сродство к Fc- фрагменту иммуноглобулинов. Бактерии, обработанные иммунной сывороткой, неспецифически адсорбируют АТ. Антитела диагностикума взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба. Реакция агглютинации латекса. Для постановки используют частицы латекса (полистерола)с адсорбированными на их поверхности АТ (антительный диагностикум). При положительной реакции наблюдают образование фестончатого осадка- «розетки агглютинации». При отрицательном результате- образование «пуговки». Реакция иммунофлюоресценции. Прямая: АГ микроорганизмов при взаимодействии с АТ диагностической сыворотки, меченной флюорохромами дают свечение в УФ - лучах люминисцентного микроскопа. Непрямая: Ставится два этапа. Введена как система индикации дополнительно антиглобулиновая сыворотка (к иммуноглобулинам кролика), меченная флюорохромом. Положительной считается интенсивность свечения (+++, ++++) Иммунохроматографический анализ (ИХА). Диагностика основана на современных технологиях получения моноклональных и поликлональных антител к специфическим антигенам. ИХА обладает относительно невысокой чувствительностью из-за неактивной метки 104 –108КОЕ/мл, но при этом крайне прост в исполнении, а учет результата осуществляется визуально и не требует наличия сложных дорогих приборов и высокой квалификации исполнителя. Особенно удобен в условиях поликлинического приема. Образец (цельная кровь, сыворотка, плазма, мочи, экстракт мазков или фекалий), нанесенный на подложку, движется по мембране и доходит до зон, где находятся специфически связывающиеся агенты (антитела или антигены). Здесь происходит специфическое связывание тестируемого белка (антигена), находящегося в образце со специфическими антителами к нему. При наличии тестируемого белка в пробе на мембране появляются одна или две четко окрашенные полосы, свидетельствующие о негативном или позитивном результате теста (конкретная информация - в инструкциях к каждому тесту). Для визуализации комплексов «антиген-антитело» используются конъюгированные красители на основе коллоидного золота. Преимущества использования иммунохроматографических тестполосок: 1. Простота и удобство — позволяет получить результат (анализ и первичное представление о причине заболевания) без оборудования и специальных навыков. 2. Надежность — достоверность тестов достигает 100%, при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль. 3. Анонимность — что особенно важно при выявлении заболеваний, передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также выявлении фактов употребления наркотических веществ. 4. Независимость — не требует предварительной медицинской консультации и рецепта врача. Качество моноклональных антител зависит от способов их получения, очистки и фиксации на носителе. Так же достоверность результата зависит от концентрации антигена в биоматериале, а концентрация антигена в свою очередь зависит от стадии заболевания и количества биоматериала. |