|
|
Электрофорез. электрофорез. Время миграции tм (migration time, tm)
Время миграции tм (migration time, tm)— время, необходимое компоненту для прохождения им эффективной длины капилляра (Lэфф, Leff) от зоны ввода пробы (начала капилляра) до зоны детектирования.
Электроосмотический поток ЭОП (electroosmotic flow, EOF)— течение жидкости в капилляре под действием приложенного электрического поля. Время, необходимое жидкости для преодоления эффективной длины капилляра вследствие возникающего ЭОП, называют временем ЭОП (tэоп, teof) и экспериментально определяют из электрофореграммы (electropherogram) по времени миграции нейтрального компонента — маркера ЭОП.
Подвижность ЭОП μэоп (electroosmotic mobility, μeof) — представляет собой отношение скорости ЭОП к напряженности электрического поля. Скорость ЭОП (electroosmotic velocity, veof) положительна при направлении движения жидкости от входного участка капилляра к детектору и отрицательна при обратном направлении. Скорость ЭОП вычисляют как: vэоп = Lэфф/tэоп. Напряженность электрического поля представляет собой отношение приложенной разности потенциалов (U) к общей длине капилляра (Lобщ, Ltot). Таким образом, подвижность ЭОП вычисляют из экспериментальных данных: μэоп = LобщхLэфф/tэопхU. Традиционно при расчете подвижностей длину капилляра выражают в сантиметрах, время миграции в секундах, а разность потенциалов в вольтах.
Электрофоретическая подвижность частицы μэф (electrophoretic mobility, μep) — по аналогии с предыдущей величиной представляет собой отношение электрофоретической скорости частицы к напряженности электрического поля и может быть вычислена: μэф = LобщхLэфф/tмхU. В отличие от μэоп электрофоретическую подвижность частицы нельзя определить непосредственно из электрофореграммы, поскольку время миграции частицы tм в этом случае представляет собой сумму времен миграции собственно частицы и мар- кера ЭОП. Из эксперимента можно найти так называемую общую подвижность, которая выражается (при положительной скорости ЭОП): μобщ = μэоп+μэф. Зная из эксперимента μобщ и μэоп можно легко рассчитать μэф.
Капиллярный электрофорез КЭ (Capillary Electrophoresis, CE) — метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различиях в электрофоретических подвижностях заряженных частиц как в водных, так и в неводных буферных электролитах. Буферные растворы (ведущие электролиты, рабочие буферы, background electrolyte, run buffer) могут содержать добавки (например, макроциклы, органические растворители, полимеры и др.), которые способны взаимодействовать с анализируемыми частицами и изменять их электрофоретическую подвижность.
В основе капиллярного электрофореза лежат электрокинетические явления — электромиграция ионов и других заряженных частиц и электроосмос. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого сорта заряженных частиц.
высокая эффективность разделения (сотни тысяч теоретических тарелок), недоступная ВЭЖХ и связанная с плоским профилем ЭОП,
малый объем анализируемой пробы и буферов (не более 1–2 мл в день), при этом практически не требуется применение высокочистых, дорогостоящих органических растворителей,
отсутствие колонки, сорбента, проблем с его старением и, значит, заменой колонки,
простая и недорогая аппаратура,
экспрессность и низкая себестоимость единичного анализа.
Движение заряженных коллоидных частиц под действием внешнего электрического поля носит название электрофореза.
Метод КЭ основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (2 нл) вводят в кварцевый капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером — электролитом. После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей, в первую очередь, от заряда и массы (точнее, величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой; качественной характеристикой вещества является время миграции, а количественной — высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества.
Диссоциация силанольных групп вызывает на границе раздела кварц-водный раствор электролита образование двойного электрического слоя (ДЭС), рис. 1а. Первую его обкладку составляют неподвижные отрицательно заряженные силанольные группы. Вторую обкладку двойного слоя составляют положительно заряженные катионы, существующие в растворе. Диэлектриком, разделяющим обкладки этого конденсатора, являются молекулы воды, гидратирующие как силанольные группы, так и катионы.
Положительная часть ДЭС, в свою очередь, делится на две части: первую (или неподвижную), непосредственно примыкающую к поверхности кварца, и вторую (или диффузную), располагающуюся на некотором удалении от поверхности. В неподвижной части количество положительных зарядов меньше, чем отрицательных зарядов на поверхности кварца из-за увеличения размеров катионов вследствие гидратации. В результате в диффузной части ДЭС образуется некоторая избыточная концентрация катионов. Между этими двумя слоями проходит т. н. граница скольжения — при наложении вдоль капилляра электрического поля неподвижная часть остается на месте, в то время как диффузная часть начинает мигрировать к катоду, увлекая за собой в силу межмолекулярного сцепления всю массу жидкости в капилляре. Возникает электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. Скорость ЭОП в сильной степени зависит от рН раствора: в сильнокислых растворах ЭОП отсутствует, в слабокислых — его скорость незначительна, а при переходе в нейтральную и щелочную область рН скорость ЭОП возрастает до максимально возможной. С другой стороны, эта величина зависит от концентрации электролита в ведущем буфере: чем она больше, тем выше становится доля катионов в неподвижной части ДЭС, а толщина диффузной части уменьшается и, соответственно, уменьшается скорость электроосмотического потока.
Уникальное свойство ЭОП заключается в плоском профиле потока (в отличие от параболического в ВЭЖХ), который при движении зон компонентов внутри капилляра практически не вызывает их уширения (рис. 2). Благодаря этому метод КЭ характеризуется высочайшей эффективностью (
сотни тысяч теоретических тарелок).
Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток (рис. 3). Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионы появляются первыми и тем раньше, чем больше их электрофоретическая подвижность.
Если время нахождения пробы в капилляре (которое можно регулировать изменением напряжения, величины рН и концентрации ведущего электролита) достаточно, чтобы проявились различия в подвижности ионов, то на выходе капилляра вблизи катода можно наблюдать зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы.
Ведущий электролит (его называют также рабочим буферным раствором) должен иметь такую концентрацию, при которой электрическое сопротивление раствора в капилляре будет достаточно велико. Это требование связано с тем, что при прохождении электрического тока в проводнике выделяется тепло. Если ток достаточно велик, то жидкость в капилляре может даже закипеть.
Пусть полная длина капилляра равна 60 см, эффективная длина (т. е. длина от входа до окна детектора) — 50 см, рабочее напряжение, поданное на электроды, равно 25 кВ, сила тока в капилляре составляет 100 мкА. Сила тока в капилляре зависит от его длины и диаметра, а также от концентрации электролита в растворе. Для капилляра с внутренним диаметром 75 мкм сила тока 100 мкА при напряжении 25 кВ достигается при концентрации соли в электролите 0,03–0,04 моль/л.
Этот формальный расчет показывает, насколько серьёзна проблема охлаждения капилляра в КЭ. В действительности выделяющаяся теплота расходуется не только на нагревание раствора, но также на нагрев кварцевых стенок и полиимидной оболочки. Нужно также учесть, что теплоёмкость кварца в
6 раз меньше, чем водного раствора, а теплопроводность плавленого кварца в 16 раз больше, чем у воды. Все эти обстоятельства способствуют эффективному отводу тепла во внешнюю среду, однако, если не принять специальных мер, жидкость в капилляре очень скоро закипит. Поэтому в приборах для КЭ всегда присутствуют либо системы охлаждения капилляра энергичным воздушным обдувом, либо системы жидкостного охлаждения.
В том же случае, когда электропроводность раствора пробы больше, чем электропроводность ведущего электролита, падение напряжения на участке, занятом пробой, резко уменьшается. В результате скорость электромиграции компонентов пробы уменьшается, они медленнее достигают границы зоны, а при переходе в ведущий электролит скорость их движения увеличивается. Происходит размазывание пиков, они накладываются друг на друга, эффективность разделения резко ухудшается.
использовать такие составы буферных ведущих электролитов, в которых на электродах происходит разложение воды (одним из самых распространенных буферов для КЭ является раствор буры). На катоде происходит восстановление ионов водорода, выделение на поверхности катода молекулярного водорода и образование в прика- тодном пространстве гидроксильных ионов. На аноде — окисление гидроксильных ионов, выделение на поверхности анода молекулярного кислорода и образование в прианодном пространстве ионов водорода.
Самым простым вариантом КЭ является капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ). Компоненты сложной смеси движутся в среде электролита с разными скоростями, образуя дискретные зоны. Отличительная особенность КЗЭ состоит в том, что он пригоден для разделения только ионогенных компонентов пробы, тогда как нейтральные соединения, не обладающие собственной электрофоретической подвижностью, движутся со скоростью ЭОП и выходят в зоне нейтральных компонентов, зоне маркера ЭОП.
Если скорость миграции аниона превышает скорость ЭОП, то такой анион рано или поздно выйдет из капилляра в прианодное пространство (это нежелательно, т. к. некоторые анионы, например хлорид, попадая в рабочий буферный раствор, будут, разряжаясь на аноде, вызывать коррозию платинового электрода). Если же скорость электромиграции аниона меньше скорости ЭОП, то такой анион может быть зарегистрирован на той же электрофореграмме после выхода системного пика. В этом варианте КЗЭ с положительной полярностью могут определяться катионные компоненты проб и большинство органических анионов.
Повышение селективности может быть достигнуто за счет изменения рН ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок: поверхностно-активных веществ, макроциклов, органических растворителей и т. д.
Различают общую (Lобщ) и эффективную (Lэфф) длину капилляра: в первом случае речь идет о полной длине капилляра от входного до выходного конца, а во втором — об участке от входного конца до зоны детектирования (рис. 5).
Важной характеристикой капилляра является состояние его концов, особенно в зоне ввода пробы: торцевой срез должен быть выполнен строго под углом 90° к боковым стенкам капилляра. В противном случае можно наблюдать пики с «хвостами» или невоспроизводимый ввод пробы.
Различают три способа ввода пробы:
гидродинамический,
электрокинетический,
гидростатический.
Ввод пробы давлением (гидродинамический, пневматический) обеспечивается со- зданием разницы давлений между сосудом для пробы и выходным концом капилляра, при этом давление либо повышается в сосуде для пробы, либо снижается на конце капилляра. Первый вариант наиболее распространен в коммерческих системах КЭ, в том числе в приборах «Капель». Объем вводимой пробы зависит только от разницы давлений и времени ввода пробы
Электрокинетический ввод пробы. При этом способе ввод пробы осуществляется путем подачи высокого напряжения на электроды, когда на входе установлена пробирка с раствором пробы, а на выходе — с рабочим буфером. За счет возникающего при этом ЭОП компоненты пробы перемещаются в капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от величины приложенного напряжения, времени, в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы. Особенностью этого ввода пробы является то, что компоненты с большей подвижностью будут концентрироваться в капилляре по сравнению с малоподвижными ионами, которые в случае недостаточного времени ввода, вообще могут не попасть в капилляр. Т. е. по сравнению с гидродинамическим способом ввода мы имеем в большей или меньшей степени дифференциацию состава пробы в капилляре и в исходном растворе. Это означает, что электрокинетический способ ввода пробы подразумевает только однократный ввод образца из одной пробирки. Этот способ ввода пробы наименее воспроизводим.
Гидростатический ввод пробы. В этом способе для ввода пробы используют разницу в высоте между буферным сосудом и сосудом для проб. Гидростатическое давление способно создать поток жидкости в капилляре («сифонный» эффект) и, следовательно, ввести пробу в капилляр. Вводимое количество пробы зависит от разницы в высоте (обычно 5–10 см), времени (5–45 с.) и гидродинамических свойств раствора электролита и пробы (вязкость, плотность).
Основными принципами детектирования в КЭ являются:
фотометрическое в УФ-видимой области спектра (прямое и косвенное),
флуориметрическое (прямое и косвенное),
масс-спектрометрическое,
кондуктометрическое,
амперометрическое (прямое и косвенное),
радиометрическое,
рефрактометрическое.
Детекторы с фиксированной длиной волны: источники света с линейчатым спектром (ртутная лампа (254 нм), кадмиевая лампа (229 нм) и цинковая лампа (214 нм). Это наиболее простые и недорогие системы; в приборах «Капель-103, -104» фотомет- рический детектор работает на длине волны 254 нм (строго 253,7 нм), поэтому отклик детектора будет наблюдаться только в том случае, если определяемый компонент имеет заметное поглощение на указанной длине волны.
Детекторы с изменяемой длиной волны: источниками света служат дейтериевые и вольфрамовые лампы (рабочий диапазон длин волн 190–350 нм и 340–850 нм, соответственно). Необходимая спектральная селекция достигается применением монохроматоров или узкополосных светофильтров.
Детекторы на диодной матрице (ДМД). В таких детекторах световой поток, прошедший через капилляр, разлагается в спектр с помощью высококачественного светосильного монохроматора, а матрица фотодиодов постоянно регистрирует сигналы в ультрафиолетовой и видимой частях спектра (УФ-В-детекторы), обеспечивая запись в режиме сканирования.
Для записи электрофоретических данных можно использовать:
самописец (аналоговый сигнал),
принтер (через LPT- или USB-порт, встроенный в прибор),
компьютер (через АЦП или встроенный в прибор RS 232 или USB-порт).
Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью. Эффективность N, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграммы
Основными причинами, приводящими к снижению N, являются:
величина зоны вводимой пробы, определяемая длительностью ввода: в идеале она должна быть как можно меньше, однако, достижение низких пределов обнаружения требует увеличения объема пробы или ее концентрирования;
температурный градиент, при наложении электрического поля в капилляре, заполненном буфером, протекает электрический ток, величина которого зависит от удельной проводимости буфера и диаметра капилляра. Отвод тепла происходит через стенки капилляра, что приводит к возникновению в буфере радиального температурного градиента. Разница в температуре между серединой и стенками капилляра возрастает пропорционально квадрату диаметра капилляра. Температура в центре капилляра может быть на 10 °С выше, чем на внутренней стенке. Возникающий вследствие этого градиент вязкости приводит к тому, что вещество у стенки перемещается медленнее, чем в центре, что влечет за собой уширение полос и снижение эффективности;
адсорбция на стенках капилляра; взаимодействие веществ со стенками капилляра, ведущее к искажению формы пиков (появление «хвостов»);
различия в электропроводности пробы и ведущего электролита: уширение пика, обусловленное электрофоретическими эффектами, пропорционально проводимости (и, таким образом, ионной силе) раствора образца относительно буфера. В случае высокой концентрации пробы сила электрического поля (и, следовательно, линейные скорости) в зоне образца много ниже, чем в ведущем электролите. Благодаря этому происходит разбавление образца (дестэкинг) — уширение. Обратная ситуация в соотношении проводимостей (стэкинг), наоборот, приводит к формированию узких пиков на электрофореграмме;
наличие гидродинамического потока из-за различия в уровне жидкостей (незначительная разность между уровнями буферов во входном и выходном сосудах приводит к возникновению гидродинамического потока с параболическим профилем; чем больше диаметр капилляра, тем значительней это сказывается на эффективности разделения).
Основным способом детектирования в капиллярном электрофорезе является фотометрический, чувствительность которого не всегда достаточна, поскольку:
детектирование происходит в слое малой толщины (что обусловлено внутренним диаметром капилляра);
вводят очень малые объемы пробы.
Подходы к увеличению чувствительности можно разделить на 3 категории:
стратегия концентрирования образца;
увеличение длины оптического пути;
использование высокочувствительных селективных детекторов.
Стекинг-проводимость образца выше, чем у электролита
Чувствительность метода КЭ с УФ-детектированием может быть повышена за счет увеличения длины оптического пути при использовании капилляров с расширенным световым путем. Предложено несколько способов: зону детектирования выполняют в форме пузырька (bubble cell), используют капилляры Z-формы (Z-shapped capillaries). Увеличение внутреннего диаметра капилляра в зоне детектирования позволяет вырасти сигналу в 3–5 раз, применение Z-ячейки позволяет увеличить чувствительность в 20–40 раз. Увеличению чувствительности определения способствует также снижение уровня шума детектора.
В пробу, для которой затруднена идентификация анализируемого вещества, вносят это вещество и проводят повторный анализ. Если на электрофореграмме появляется новый пик, это означает, что анализируемый компонент ранее в пробе отсутствовал. Если же один из бывших пиков увеличился по высоте (площади), то можно утверждать, что это и есть анализируемый компонент.
Известно, что и площадь и высота пика определяются величиной введенной в капилляр пробы. В то же время площадь пика зависит от ЭОП и электрофоретической подвижности иона, которые влияют на его скорость. Чем медленнее движется ион по капилляру, тем шире в конечном итоге пик и больше его площадь.
Если проба слишком разбавлена:
1. выбирают более чувствительный детектор,
2. концентрируют пробу,
3. используют электрокинетический ввод пробы.
Если проба имеет высокий солевой фон:
1. проводят обессоливание пробы,
2. увеличивают концентрацию буфера.
Еще раз напомним основные преимущества капиллярного электрофореза, реализованные в системах КЭ «Капель»:
за один анализ одновременно определяется несколько компонентов пробы,
в кварцевом капилляре достигаются рекордные эффективности разделения — сотни тысяч теоретических тарелок,
благодаря многообразию вариантов метода КЭ разделяются ионные, нейтральные, гидрофильные, гидрофобные, хиральные компоненты, от наночастиц до макромолекул,
для проведения одного анализа требуется чрезвычайно малый расход реактивов (микролитры),
дозируется минимальный объем анализируемого образца,
достигаются высокие скорости анализа,
для большинства объектов используется простая подготовка пробы — в основном фильтрование и дегазирование,
в приборах с жидкостным охлаждением капилляра улучшается воспроизводимость результатов измерений,
с использованием автоматического режима повышается точность анализа, снижается его трудоемкость и роль человеческого фактора, увеличивается производительность,
обеспечивается надежная работа капилляра с экономичными водными буферами,
реализуется возможность задания и/или изменения условий в ходе анализа,
достигается рекордно низкая себестоимость анализа. |
|
|
Скачать 31.49 Kb.