Занятие № 2. Получение и обработка патологического материала.. Занятие Получение и обработка патологического материала
 Скачать 16.11 Kb.
|
|
Занятие № 2. Получение и обработка патологического материала. Цель занятия: ознакомиться с правилами взятия и транспортировки патологического материала в лабораторию. В лабораторной диагностике вирусных болезней точность диагноза прежде всего зависит от правильности взятия патологического материала, его транспортировки, качества приготовления и техники исследования вируссодержащего материала, которые имеют свои особенности. Материал для исследований от заболевших, павших или вынужденно убитых животных следует брать как можно быстрее после появления четких признаков болезни или не позднее 2--3 ч после клинической смерти или убоя. Это связано с тем, что сразу после заболевания или в первые 1-2 дня значительно ослабевает барьерная роль· кишечника, что, наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов, способствует диссеминации кишечной флоры. Кроме того, по мере продолжения и даже углубления инфекционного процесса количество вируса может уменьшаться в результате воздействия защитных механизмов организма. При взятии материала. для выделения вируса следует исходить из патогенеза изучаемой инфекции (входные ворота, пути распространения вируса в организме, места его размножения и пути выделения). Так, при респираторных инфекциях для выделения вирусов берут носоглоточные смывы, мазки из носа и глотки, соскобы трахеи и кусочки легкого трупов; ПРИ энтеровирусных - кал; при нейротропных кусочки головного или спинного мозга; при дермотропных инфекциях - свежие поражения кожи и т. д., то есть отбирают тот материал, в котором предполагается наибольшая концентрация вируса. Материалом для выделения вируса могут служить различные экскреты и секреты, кусочки органов, кровь, лимфа и пр. Кровь берут из яремной вены, у свиней - из кончика хвоста или уха. Лучше кровь у свиней брать из венозного сплетения глаз. При этом пользуются шприцем «Рекорд» (на 20 мл) и иглой NQ 12-30. которую вводят по внутреннему углу костной орбиты (скос иглы к костной орбите) к противоположному уху до упора, затем оттягивают на 1-1,5 см, и набирают кровь. Для выделения вируса может быть использована либо цельная дефибринированная, либо «лаковая» кровь (смесь крови с дистиллированной водой в отношении 1: 1), либо отдельные элементы крови (эритроциты, лейкоциты, плазма, сыворотка). Для обнаружения противовирусных антител кровь берут у одного и того же животного дважды с интервалом в 2-3 недели (для получения парных сывороток в объеме не менее 5,0 мл каждой). Смывы со слизистой оболочки носа, глаз, с задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц берут стерильными ватными тампонами и погружают их в пенициллиновые флаконы или пробирки, содержащие 3-5 мл соответствующей жидкости. Наиболее часто для этого используют раствор Хенкса или среды для культур клеток (Г ЛА, 199, Игла) с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500 ЕД, нистатин по 20 ЕД на 1 мл среды) и белковым стабилизатором, например 0,5%-ным раствором желатина или 0,51%-ным раствором альбумина бычьей сыворотки. Присутствие стабилизаторов - необходимо для предотвращения быстрой инактивации некоторых вирусов (например, парагриппа). При взятии материала из носоглотки можно пользоваться прибором, сконструированным Томасом и Стоком. Он состоит из трубки диаметром 9 мм и 30 см длиной, внутри которой помещается вторая тонкая трубка с нержавеющим стержнем, оканчивающимся нейлоновой щеткой (диаметр 9 мм). Прибор вводят глубоко в носовые ходы (хоаны)" или в горло через носовой ход, выдвигая щеточку, а затем вновь задвигая ее в трубку, перед тем как вынуть прибор из органа. Щеточку тщательно отмывают от слизи и клеток в 2 мл жидкости. Слюну имеет смысл брать при наличии признаков поражения ротовой полости или слюнных желез. Вытекающую изо рта слюну можно собрать прямо в пробирку. Если ее выделяется мало или она не вытекает, необходимо пропитать слюной стерильный тампон из ваты на палочке, а затем поместить в пробирку с небольшим количеством физиологического раствора и закрыть резиновой проб кой. Для усиления слюноотделения животному можно ввести пилокарпин из расчета 0,02-0,05 г на 1 кг массы. Мочу собирают при помощи катетера в стерильную посуду. Фекалии берут из прямой кишки при помощи шпателя или палочки и помещают в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон. Везикулярную жидкость можно собрать шприцем или пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинцетом. Спинномозговую жидкость используют редко. Ее берут асептично, путем обычной пункции. Применение антибиотиков эффективно лишь при условии незначительного бактериального загрязнения проб. Однако при значительных посмертных изменениях тканей, если даже при помощи антибиотиков удается затормозить рост бактерий, нельзя нейтрализовать продукты их метаболизма и токсические субстанции поврежденной ткани. Такой материал непригоден для проведения исследований ни на животных, ни тем более на куриных эмбрионах и культурах клеток. В качестве патматериала берут кусочки органов (размером в несколько кубических сантиметров и массой 1 0-20 г), которые: Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в фосфатный буфер или раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со· стерильным кварцевым песком. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса. Полученную суспензию центрифугируют при 1500-3000 об/мин 15-30 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры, либо пропуская через бактериальные фильтры, либо обрабатывая антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, тетрациклин, кристалломицин и т. д.). Экспозиция суспензии с антибиотиками не менее 30-60 мин при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус 20-70˚С. Контрольные вопросы: 1. Каковы общие правила взятия патматериала? 2. Консервирование патологического материала. |