Лабораторные работы по биохимии. Занятие Строение, свойства и функции белков
 Скачать 212.5 Kb.
|
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 14.ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА В МОЧЕ. Белок в нормальной моче находится в следовых количествах, которые не определяются обычными реакциями, применяемыми в клинической лаборатории. Появление белка в моче носит название протеинурия или часто альбуминурия, поскольку моча содержит в основном сывороточный альбумин и лишь частично сывороточный глобулин. Протеинурия может быть истинной или ложной. При истинной, или почечной, протеинурии белки сыворотки крови попадают в мочу через почки. Случайная, или ложная, протеинурия наблюдается при попадании в мочу слизи, крови, гноя не из почек, а из мочевыводящих путей. Белок появляется в моче при нефрите (т.е. воспалении сосудистых клубочков почек, когда увеличивается их проницаемость), в случае сердечной декомпенсации, при некоторых формах повышенного кровяного давления и иногда при беременности. Моча, содержащая белок, становится мутной. Для обнаружения белка в моче применяется реакция осаждения. Основными реакциями, наиболее часто применяемыми в клинических лабораториях для осаждения белка являются следующие: 1) проба с кипячением; 2) осаждение концентрированной азотной кислотой; 3) осаждение сульфосалициловой кислотой (самая чувствительная реакция на белок, положи- тельная в разведении белка 1:50000). Наряду с качественным определением белка в моче существует и количественное по методу Робертса-Стольникова-Брандберга, имеющее диагностическое и прогностическое значение. Оно дает возможность судить о результатах терапевтического воздействия. Данный метод количественного определения белка в моче широко применяется в клинике. Исследуемый материал: 1) Моча, содержащая белок; 2) Нормальная моча. Реактивы: 1) Уксусная кислота, 1%-ный раствор; 2) Концентрированная азотная кислота с хлоридом натрия. Оборудование: 1) Штатив с пробирками; 2) Пипетка (2 шт.); 3) Фильтры; 4) Колбочка; 5) Воронки. ХОД РАБОТЫ: Все реакции на открытие патологических составных частей мочи проделываются студентами одновременно и с нормальной мочой. Профильтрованную мочу (20 капель) нагревают до кипения в пробирке. Образовавшийся при этом осадок представляет собой белок или фосфаты. К горячему раствору добавляют по каплям (1-3) 1%-ный раствор уксусной кислоты. Если осадок зависит от фосфатов, он растворяется при подкислении мочи; если это белок, осадок свертывается и оседает на дно пробирки. Следует избегать избытка кислоты. При проведении пробы Геллера с концентрированной азотной кислотой надо работать осторожно. В пробирку наливают с помощью капельницы приблизительно около 1 мл концентрированной азотной кислоты (насасывать пипеткой кислоту нельзя) и затем осторожно наслаивают примерно равный объем профильтрованной мочи из пипетки по стенке пробирки так, чтобы жидкости не смешивались. Необходимо наслаивать мочу на HNO3, а не наоборот, так как азотная кислота имеет больший удельный вес. Указания к составлению отчета: В случае присутствия белка на границе жидкостей появляется мутное беловатое кольцо осадка белка. Отметить в тетрадях разницу результатов проведенных реакций с нормальной и патологической мочой. Записать в тетрадях технику качественного определения белка в моче, указать, что такое протеинурия и причины ее возникновения. Контрольные вопросы: 1. Какой белок является основным белком мочи? 2. На каких свойствах белка основан данный метод его определения? 3. Что такое проба Геллера? О чем свидетельствует увеличение количества белка в моче? Лабораторная работа №15. Определение содержания -липопротеидов низкой плотности. Большинство липидов находится в крови не в свободном состоянии, а в составе белково-липидных комплексов: хиломикроны, - липопротеиды и - липопротеиды. Липопротеиды можно разделить различными методами: электрофореза, тонкослойной хроматографии, ультрацентрифугирования в солевых растворах различной плотности. При ультрацентрифугировании выделяются хиломикроны и липопротеиды разной плотности: высокой (ЛВП - -липопротеиды), низкой (ЛНП - -липопротеиды) и очень низкой (ЛОНП - пре--липопротеиды) и др. Печень играет очень важную роль в обмене липопротеидов. Здесь осуществляются их катаболизм, синтез ЛОНП, осуществляющих транспорт триацилглицеролов и холестерола из печени в другие ткани. Нормальным считают содержание в плазме крови: ЛВП - более 40 мг%, ЛНП - менее 180 мг%, ЛОНП - менее 40 мг%. Фракции липопротеидов отличаются по количеству белка, относительной молекулярной массе липопротеидов и процентному содержанию отдельных липидных компонентов. Так, -липопротеиды, содержащие большое количество белка (50-60%), имеют и более высокую относительную плотность (1,063-1,21), тогда как -липопротеиды и пре--липопротеиды содержат меньше белка и значительное количество липидов - до 95% от всей относительной молекулярной массы и низкую относительную плотность (1,01-1,063). Увеличение -липопротеидов наблюдается при атеросклерозе, механической желтухе, острых гепатитах, хронических заболеваниях печени, диабете, гликогеновой болезни, ксантоматозе и ожирении. Уменьшение -липопротеидной фракции описано при 2-плазмоцитоме. ПРИНЦИП МЕТОДА: В основу метода положена способность -липопротеидов (ЛПНП) осаждаться в присутствии хлорида кальция и гепарина; при этом изменяется мутность раствора. По степени помутнения раствора и судят о концентрации -липопротеидов в сыворотке крови. Считают, что гепарин способен образовывать с -липопротеидами комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок. РЕАКТИВЫ, ОБОРУДОВАНИЕ И ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: Хлорид кальция (CaCl2) 0,27%-ный раствор (готовят из безводного реактива). Гепарин, 1%-ный раствор (готовят ex tempore) ,1 мл его должен содержать 1000 ЕД (лучше кристаллический). Фотоэлектроколориметр. Микропипетка ёмкостью 0,2 мл. Сыворотка крови. ХОД РАБОТЫ. В пробирку вносят 4 мл 0,27%-ного раствора CaCl2 и 0,4 мл сыворотки крови и перемешивают. Определяют оптическую плотность раствора (Е1) против 0,27%-ного раствора CaCl2 по левому барабану в кюветах на 5 мм, при красном светофильтре (630 нм). Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют микропипеткой 0,08 мл 1%-ного раствора гепарина, перемешивают и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е2) в тех же условиях: Х = (Е2 - Е1) 1000 Расчет. Вычисляют разность оптической плотности и умножают её на 1000 - коэффициент эмпирический, предложен Ледвиной, так как построение калибровочной кривой сопряжено с рядом трудностей. Ответ выражают в г/л. В норме содержание -липопротеидов составляет 3 - 4,5 г/л (300 - 450 мг/%). Содержание -липопротеидов колеблется в зависимости от возраста и пола. Примечание. Сыворотку крови, содержащую гепарин, для данного анализа использовать нельзя. Контрольные вопросы: Что такое липопротеиды? Какие функции выполняют липопротеиды? На чем основан метод определения липопротеидов? При каких патологических состояниях наблюдается нарушение нормальной концентрации липопротеидов крови? ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 16. Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОБЩИХ ЛИПИДОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ». Для определения липидов сыворотку предварительно гидролизуют концентрированной серной кислотой. Продукты распада липидов образуют с фосфорнованилиновым реактивом окрашенное соединение, интенсивность окраски которого определяют колориметрически. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: сыворотка крови. РЕАКТИВЫ: 1) Концентрированная серная кислота. 2) Фосфорнованилиновая смесь (4 части фосфорной кислоты и 1 часть 0,6%-ного раствора ванилина). ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Сухие пробирки. 2) Пипетки. 3) Водяная баня. 4) ФЭК. 5) Кюветы с толщиной слоя 0,5 см. ХОД РАБОТЫ Для гидролиза 0,1 мл (2 капли) сыворотки смешивают с 5 мл серной кислоты (конц.), перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Одновременно готовят контрольный раствор: в пробирке тщательно смешивают 0,1 мл (2 капли) дистиллированной воды и 5 мл конц. серной кислоты и оставляют стоять при комнатной температуре. После окончания гидролиза колбу с гидролизатом охлаждают до комнатной температуры, отбирают 0,2 мл (4 капли) и добавляют 3 мл фосфорнованилиновой смеси, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 – 15 мин. Таким же образом смешивают с фосфорнованилиновой смесью контрольный раствор. Интенсивность окрашивания измеряют на ФЭК, длина волны 540 нм. Количественное содержание липидов рассчитывают по формуле: С липидов = 38,5 (Д пробы – Д контроля) Результаты заносят в рабочую тетрадь. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 17. Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ СИАЛОВЫХ КИСЛОТ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ ГЕССА». Метод Гесса колориметрический, основан на цветной реакции, получаемой при нагревании сиаловой кислоты (ацетилнейраминовой) с уксусно-сернокислотным реактивом. Интенсивность буровато-розового окрашивания зависит от концентрации сиаловых кислот. Исследования сиаловых кислот в крови имеет важное диагностическое значение, особенно при ревматизме, туберкулезе и раке легких, злокачественных опухолях костной ткани, когда содержание их увеличивается. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: Сыворотка крови. РЕАКТИВЫ: 1) Трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор. 2) Уксусно-сернокислотный реактив (95 частей ледяной уксусной кислоты и 5 частей концентрированной серной кислоты). ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Водяная баня. 2) Фотоэлектроколориметр. 3) Центрифуга, центрифужные пробирки. ХОД РАБОТЫ. К 1 мл сыворотке крови в центрифужной пробирке добавляют 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и встряхивают (при этом образуется осадок). Затем центрифужную пробирку помещают в кипящую водяную баню на 5 минут и охлаждают. Это приводит к освобождению связей N-ацетилнейраминовой кислоты с белковой частью молекулы гликопротеидов. Центрифугируют при 3000 оборотах в минуту 10 минут. После центрифугирования к 0,4 мл (8 капель) надосадочной жидкости добавляют 5 мл уксусно-кислотного реактива и повторно нагревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут. При этом появляется буровато-розовое окрашивание. После охлаждения колориметрируют в фотоэлектроколориметре в кювете 10 мм с зеленым (540) светофильтром по правому барабану. Полученную величину экстинции умножают на 1000. Результат определения выражают в величинах экстинции. В норме величина её (ФЭК) колеблется от 100 до 195, что соответствует содержанию сиаловых кислот от 50 до 79 мг %. Метод прост и быстр, более специфичен, чем дифениламиновый, но малочувствителен. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №18. Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРЕКИСИ ЛИПИДОВ В ТЕСТЕ С ТИОБАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТОЙ». При высокой температуре в кислой среде малоновый диальдегид (МДА) реагирует с 2 тиобарбитуровой кислотой (ТБК), образуя окрашенный триметиновый комплекс, содержащий 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК, с максимумом поглощения при 535 нм. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: Сыворотка крови. РЕАКТИВЫ: 1) Ортофосфорная кислота (1%-ый раствор). 2) 2-тиобарбитуровая кислота (0,6%-ный раствор). 3) Железо сернокислое FeSO4 • 7 H2O (1 мкмоль в пробе). 4) Бутиловый спирт (бутанол-1, н-бутиловый спирт). ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Пробирки центрифужные. 2) Прибор для отсасывания верхней фазы 1 шт. ХОД РАБОТЫ. К 0,3 мл (6 капель) сыворотки приливают 3 мл 1%-ного раствора ортофосфорной кислоты, добавляют 1 мл 0,6%-ного раствора ТБК и 0,1 мл (2 капли) раствора сернокислого железа. Перемешивают. Пробирки закрывают пробкой, ставят в кипящую водяную баню на 1 час. Затем пробирки охлаждают в холодной воде, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Измеряют оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм (Еоп) против бутанола. Расчет содержания продуктов (МДА), реагирующих с ТБК, проводят по формуле: Еоп 106 4 мл А = —————————————————— = Еоп 85,47 мкмоль/л, 1,56 105 (л/моль см) 1 см 0,3 мл где А – содержание МДА в мкмоль/л; 4 мл – объём бутанольной фазы; 0,3 мл – объём сыворотки; 1,56 105 л/моль см – коэффициент молярной экстинции МДА; 1 см – толщина слоя кюветы; 106 - коэффициент перевода моль в мкмоль. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 19. Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (МЕТОД МОЙДИНА И ЗАКА)». Метод основан на способности органических соединений – комплексонов – взаимодействовать с ионами кальция. В качестве комплексона используется трилон Б (ЭДТА). Трилоном Б титруют ионы кальция, предварительно связанные с индикатором – мурексидом. Момент полного связывания кальция с трилоном Б определяется по изменению цвета мурексида (в комплексе с ионами кальция мурексид красно-оранжевого цвета, свободный от кальция мурексид окрашивается в сине-фиолетовый цвет). Комплекс кальция с трилоном Б более прочен, чем комплекс с мурексидом. Зная концентрацию и объем раствора трилона Б, пошедшего на титрование, находят содержание кальция. Нормальное содержание кальция в сыворотке крови 9-11 мг/дл (2,25-2,64 ммоль/л). Состояние гипокальциемии наблюдается при авитаминозе Д (рахите), у беременных, при недостаточной функции паращитовидной железы, заболеваниях почек, при отравлениях фторидами. Гиперкальциемия встречается реже (гиперпаратиреодизм, опухоли, деструктивные процессы в костной ткани, лейкозы). ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: сыворотка крови. РЕАКТИВЫ: 1) NaOH, 30%-ный раствор. 2) Трилон Б, 0,05 моль/л раствор. 3) Индикатор (смесь мурексида с хлоридом натрия в соотношении 1:100). ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Колбы вместимостью 100 мл. 2) Цилиндры мерные вместимостью 100 мл. 3) Пробирки. 4) Бюретки. ХОД РАБОТЫ. Готовят раствор мурексида для всей группы студентов. Для этого в колбу вносят 1 мл раствора NaOH и 100 мл воды, перемешивают. В полученный раствор добавляют смесь мурексида до появления ярко-фиолетовой окраски. Микробюретку заполняют раствором трилона Б. В две широкие пробирки (опытная и контрольная) наливают по 5 мл раствора мурексида. В опытную пробирку вносят по 0,2 мл (4 капли) исследуемой сыворотки крови (раствор становится розовым). Титруют (без промедления!) из микробюретки раствором трилона Б до исчезновения розовой окраски и восстановления фиолетового цвета (сравнить с окраской контроля, титрование лучше делать при дневном освещении). РАСЧЕТ: Исходя из того, что 1 мл 0,05 моль/л раствора трилона Б эквивалентен 0,06 мг Са, рассчитывают содержание кальция в сыворотке крови (в мг/дл): Х = В х 0,06 х 100 х 5, где В – объем трилона Б, пошедший на титрование опытной пробы, мл. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 20. Тема: «КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА АДРЕНАЛИН И ФОЛЛИКУЛИН». МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ: раствор адреналина (1:1000). РЕАКТИВЫ: 1) 1%-ный раствор FeCl3. 2) 10%-ный раствор NaOH. 3) 10%-ный раствор KIO3. 4) 10%-ный раствор уксусной кислоты. ОБОРУДОВАНИЕ: штатив с пробирками, пипетки. ХОД РАБОТЫ. I. РЕАКЦИЯ С FeCl3. В пробирку вносят 3 капли раствора адреналина и 1 каплю 1% раствора FeCl3. Появляется изумрудно-зеленое окрашивание, которое затем при прибавлении 1 капли раствора NaOH приобретает вишнево-красный цвет. Реакция обусловлена тем, что пирокатехиновое ядро образует с ионами Fe+³ соединения типа фенолятов. II. РЕАКЦИЯ НА АДРЕНAЛИН. В пробирку вносят 2-3 капли раствора адреналина, 2 капли раствора KIO3 и 2 капли раствора уксусной кислоты. Перемешивают и слегка нагревают. Жидкость окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена тем, что при взаимодействии адреналина с диазореактивом образуется азокраситель. Качественная реакция на фолликулин (эстрон) проводится с H2SO4 (конц.) и обусловлена образованием эфирного соединения коричневого цвета. РЕАКТИВЫ: H2SO4 (конц). ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: фолликулин, спиртовой или масленый раствор. ХОД РАБОТЫ. РЕАКЦИЯ С H2SO4 (конц). Для спиртового раствора фолликулина. В пробирку наливают 20-30 капель спиртового раствора фолликулина и помещают её в кипящую водяную баню на 5-10 минут для удаления спирта. К оставшемуся в пробирке фолликулину добавляют 0,4 мл (8 капель) H2SO4 (конц.) и ставят пробирку вновь в кипящую водяную баню на 5-10 минут. Жидкость в пробирке постепенно приобретает соломенно-желтое окрашивание, переходящее при нагревании в оранжевое. Для масляного раствора фолликулина. С масляным раствором фолликулина реакцию проводят при комнатной температуре. К 2 каплям масляного раствора фолликулина приливают 0,5 мл (10 капель) H2SO4 (конц.), постепенно развивается коричневое окрашивание. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 21. Тема: «КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ГОРМОН ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ – ИНСУЛИН». Гормон поджелужочной железы – инсулин – получил свое название потому, что он вырабатывается в островках Лангерганса. Инсулин является простым белком, влияет на углеводный обмен. При недостатке инсулина увеличивается содержание сахара в крови и выделяется большое количество сахара с мочой. Увеличение количества сахара в крови называется гипергликемией, а появление сахара в моче – глюкозурией. При введении инсулина происходит резкое снижение содержания сахара в крови. В настоящее время инсулин широко применяется при лечении сахарного диабета. Инсулин дает характерные реакции на белок (Геллера, биуретовую, Фоля, Миллона и др.), но эти реакции неспецифичны. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ. Штатив с пробирками, пипетки. Раствор инсулина в ампулах, концентрированная азотная кислота, 10 и 30%-ный раствор едкого натра, 1%-ный раствор сернокислой меди, реактив Фоля (5%-ный раствор ацетата свинца). ХОД РАБОТЫ. РЕАКЦИЯ ГЕЛЛЕРА. К 10 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки приливают равный объем – 10 капель раствора инсулина. Пробирку наклоняют под углом 45 так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется белый аморфный осадок в виде небольшого кольца. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ. К 10 каплям инсулина добавляют 5 капель 10%-ного раствора едкого натра и 3-5 капель 1%-ного раствора сернокислой меди. Перемешивают, встряхивают. Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет. РЕАКЦИЯ ФОЛЯ. К 5 каплям раствора инсулина приливают 5 капель 30%-ного раствора едкого натра и 5 капель реактива Фоля и кипятят. Через 1–2 минуты при стоянии появляется бурый или черный осадок сернистого свинца. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 22. Тема: «РЕАКЦИЯ НА БИЛИРУБИН». Билирубин образуется из простетической группы гемоглобина-гема. Гем теряет железо и подвергается превращению. При этом образуется ряд веществ, молекулы которых представляют собой открытые цепи. Наиболее окисленным из них является биливердин, который восстанавливаясь, переходит в билирубин. Билирубин образуется в селезенке, печени, а также, по-видимому, в эритроцитах. В процессе обмена веществ билирубин вступает во временную связь, с белками тканей и жидкостей организма. Билирубин образует комплексы преимущественно с альбуминами. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах (0,2-0,8 мг%). При различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия, когда концентрация билирубина в крови достигает 30-35 мг% (см таблицу). Содержание билирубина в сыворотке крови в зависимости от возраста.
В сыворотке крови имеются два вида билирубина: нерастворимый в воде непрямой билирубин и прямой билирубин, связанный с глюкуроновой кислотой, хорошо растворим в воде. Непрямой билирубин связан с альбуминами крови и дает розовое окрашивание с диазореактивом только после обработки сыворотки крови этиловым или метиловым спиртом. Эта реакция на билирубин называется непрямой. Прямой билирубин, связанный с глюкуроновой кислотой, дает прямую диазореакцию (т.е. без предварительной обработки спиртом). У здоровых людей свободный билирубин (т.е. связанный с альбумином, нерастворимый в воде, непрямой) уходит из плазмы в печень и там переходит из свободного в связанный с глюкуроновой кислотой (т.е. в растворимый, прямой). В норме прямой билирубин составляет 75% общего билирубина крови. Прямая реакция на билирубин характерна в первую очередь для желтухи, возникшей вследствие механического препятствия оттоку желчи. Повышение непрямого билирубина является одним из основных признаков гемолитической желтухи. В печени билирубин задерживается и затем вместе с желчью в виде глюкуронида изливается в желчный пузырь. В состав желчи входит билирубин и биливердин в форме солей щелочных металлов. Билирубин имеет красновато-желтую, биливердин – зеленую окраску. Вместе с желчью билирубин и биливердин поступают в двенадцатиперстную кишку. Под влиянием микроорганизмов пищеварительного тракта часть билирубина восстанавливается в темно окрашенный пигмент кала – стеркобилиноген, который на воздухе окисляется и превращается в стеркобилин. Схема превращения билирубина: Билирубин + 2Н2 мезобилирубин; Мезобилирубин + 2Н2 стеркобилиноген (уробилиноген); Стеркобилиноген + 2Н2 стеркобилин. Часть мезобилирубиногена из тонкого кишечника всасывается в кровь, попадает в печень и вновь поступает с желчью в кишечник. Незначительное количество стеркобилирубиногена после всасывания в толстом кишечнике, минуя печень, попадает в кровь и выделяется с мочей. Стеркобилиноген является пигментом мочи, обусловливающим специфическую окраску, и носит название уробилиноген. На воздухе уробилиноген окисляется и превращается в уробилин. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: 1) сыворотка крови. 2) сыворотка крови, содержащая прямой билирубин (к консервированной сыворотке добавляют небольшое количество желчи). РЕАКТИВЫ: 1) диазореактив приготовляется смешиванием 10 мл раствора №1 и 0,3 раствора №2 (диазореактив №1: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при подогревании в 300-400 мл дистиллированной воды, 15 мл конц. солянойкислоты и доводят водой до 1 л. Диазореактив №2: 0,5%-ный раствор азотистокислого натрия). 2) Спирт этиловый. 3) Сыворотка крови (нативная). ОБОРУДОВАНИЕ: бюретки, штатив с пробирками, воронки, фильтры бумажные, пипетки на 1 и 2 мл, часовое стекло, стеклянные палочки. ХОД РАБОТЫ: Непрямая реакция. В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови, 2 мл этилового спирта и фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива – появляется красно-розовое окрашивание. Прямая реакция. На часовое стекло, под которое положен лист белой бумаги, наносят каплю сыворотки крови, содержащий прямой билирубин, добавляют 3 капли свежеприготовленного диазореактива и перемешивают стеклянной палочкой. Образуется характерное для билирубина красное окрашивание. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛОВВ СЫВОРОТКЕ КРОВИ».Триацилглицеролы омыляются гидроксидом калия в глицерин, при окислении которого возникает формальдегид. Формальдегид определяют по реакции с метилацетоном и амониевыми ионами как желтый 3,5-диацетон-1,4-дегидролутидин. РЕАКТИВЫ: 1) Эталонный раствор триолеин 3,39 ммоль/л 2) Ацетилацетон, 0,75 г/л в растворе 20%-ного раствора изопропилового спирта. 3) Окислительный раствор 0,13 Н KIO4 в ацетатном буфере. 4) KOH 1 моль/л. 5) Изопропиловый спирт. 6) Адсорбент. ОБОРУДОВАНИЕ: КФК-2, водяной термостат, встряхиватель, пробирки, бюретки. ХОД РАБОТЫ: 1. Отмечают цифрами три центрифужные пробирки. 2. В пробирку №1 помещают 0,1 мл исследуемой сыворотки крови. 3. В пробирку №2 помещают 0,1 мл эталонного раствора триолеина. 4. В пробирку №3 помещают 0,1 мл дистиллированной воды. 5. В каждую пробирку помещают по 4 мл изопропилового спирта. 6. В каждую пробирку добавить одну порцию адсорбента. 7. Содержимое пробирки в течение 10-15 минут на встряхивателе. 8. Затем центрифугируют 5 минут при 3000 оборотах в минуту. 9. Отмечают три сухих пробирки цифрами и в каждую из центрифужных пробирок отмеривают по 2 мл надосадочной жидкости и по 5 мл раствора KOH. 10. Содержимое пробирок перемешивают, пробирки закрывают пробками и инкубируют в течение 10 минут при температуре 60 ±20С. 11. Охлаждают пробирки в холодной воде в течение 5 минут. 12. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл раствора KIO4. 13. Оставляют стоять 10 минут при комнатной температуре. 14. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл ацетилацетона и перемешивают. 15. Все пробирки инкубируют точно в течение 30 минут при температуре 600С. После охлаждения измеряют оптическую плотность содержимого пробирки. №1 (А1) и №2 (А2) относительно содержимого пробирки №3 на длину волны 450-420 нм в кювете 1 см. РАСЧЕТ: С (триацилглицеролов) (ммоль/л)= 3,39 А1/А2. | |||||||||||