1. Качественные реакции на белки, осаждение белков. Занятие 1 Качественные реакции на белки. Реакции осаждения белков
 Скачать 87.42 Kb.
|
|
ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ № 1 Качественные реакции на белки. Реакции осаждения белков ЦЕЛЬ: изучить теоретические основы качественных реакций на белки, и применить их на практике. ОБОРУДОВАНИЕ: 1) пробирки; 2) пробиркодержатели; 3) стеклянная палочка; 4) пипетки Пастера; 5) воронка; 6) фильтровальная бумага; 7) спиртовка. РЕАКТИВЫ: 1) концентрированный и разбавленный растворы белка; 2) 30%-й раствор NaOH; 3) 1%-й и 5%-й растворы CuSO 4 ; 4) 1%-й раствор нингидрина (в 95%-м растворе этанола); 5) конц. раствор HNO 3 ; 6) конц. раствор HCl; 7) конц. раствор H 2 SO 4 ; 8) 1%-й раствор сульфа- ниловой кислоты (в 5%-м растворе HCl); 9) 0,5%-й раствор NaNO 2 ; 10) 10%-й раствор Na 2 CO 3 ; 11) 5%-й раствор ацетата свинца; 12) 2,5%-й раствор формальдегида; 13) крист. сульфат аммония; 15) крист. NaCl; 16) этиловый спирт. Качественные реакции на белки Методы качественного обнаружения белков основаны на двух типах реакций: • по пептидным связям; • по радикалам аминокислот. Биуретовая реакция основана на образовании комплексного соединения меди с енолизи- рованными пептидными группами белков. Нингидриновый реактив специфичен к первичным аминогруппам. Ксантопротеиновая реакция основана на нитровании радикалов аминокислот. Реакция Паули основана на взаимодействии остатков тирозина и гистидина со специфическим реактивом. Реакция на «слабосвязанную серу» основана на отщеплении при щелочном гид- ролизе от остатков цистеина и цистина сульфид–ионов, образование которых обнаруживают при помощи ионов свинца. Реакция Вуазене протекает только с теми белками, которые со- держат в своем составе триптофан. Триптофан в этой реакции конденсируется с формальдеги- дом, полученное соединение в присутствии минеральных кислот образует окрашенные в сине– фиолетовый цвет соли. ЗАДАНИЕ 1. Биуретовая реакция. К 1 мл разбавленного раствора белка прибавляют 2 мл 30%-го раствора NaOH, тщательно перемешивают и добавляют 2–3 капли 1%-го раствора CuSO 4 , снова перемешивают. Наблюдают появление _______________________________________________________ окраски. ЗАДАНИЕ 2. Нингидриновая реакция. К 1 мл разбавленного раствора белка прибавляют 1 мл 1%-го раствора нингидрина (осто- рожно, яд!), тщательно перемешивают и ставят на кипящую водяную баню на 10–15 минут. Наблюдают появление ___________________________________________ окраски. ЗАДАНИЕ 3. Ксантопротеиновая реакция. К 1 мл белка прибавляют 5–6 капель концентрированного раствора HNO 3 до появления белого осадка. При нагревании в пламени спиртовки раствор и осадок окрашиваются в ______________________________ цвет. Осадок при этом почти полностью __________________________. Смесь охлаждают и осторожно по каплям, не взбалтывая, добавляют избыток NaOH. Наблюдают появление ______________________________________ окраски. ЗАДАНИЕ 4. Реакция Паули. К 0,5 мл 1%-го раствора сульфаниловой кислоты приливают 1 мл 0,5%-го раствора NaNO 2 , сильно встряхивают и немедленно добавляют 1 мл разбавленного раствора белка. Пе- ремешивают и приливают 3 мл 10%-го раствора Na 2 CO 3 . Наблюдают появление ____________________________________ окрашивания. ЗАДАНИЕ 5. Реакция на «слабосвязанную серу». К 1 мл концентрированного раствора белка добавляют двойной объем 30%-го раствора NaOH, кладут несколько «кипятильников» и осторожно кипятят смесь (осторожно, жидкость может выплеснуться!). К горячей жидкости приливают 1 мл 5%-го раствора ацетата свинца. Наблюдают ____________________________ окрашивание. ЗАДАНИЕ 6. Реакция Вуазене. К 2 мл разбавленного раствора белка прибавляют 2 капли 2,5%-го раствора формальдеги- да. После перемешивания прибавляют 6 мл концентрированной соляной кислоты и снова пе- ремешивают. Через 10 мин. прибавляют при перемешивании 0,5 мл 0,5%-го раствора нитрита натрия. Наблюдают _____________________________ окрашивание. Реакции осаждения белков В водном растворе белков их частицы являются заряженными и сильно гидратирован- ными. Эти два фактора обуславливают устойчивость белковых растворов. Введение в раствор солей сопровождается гидратацией их ионов, в результате свободных молекул растворителя становится меньше, и возрастает тенденция к отрыву молекул воды, входящих в состав упорядо- ченных оболочек молекул белка, с обнажением неполярных радикалов аминокислот. Высалива- ние неорганическими солями основано на агрегации белков своими гидрофобными участками. Осаждение белков солями является обратимым процессом. Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимое осаждение белков. Это связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с денатурацией белка. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осажде- ние белков, образуя с ними нерастворимые в воде солеобразные соединения, однако некото- рые из таких осадков растворяются в избытке осадителя в результате пептизации осадка адсор- бирующимися на его частицах ионами. По мере возрастания концентрации органических рас- творителей снижается способность молекул воды к сольватации заряженных гидрофильных участков молекул белков, что приводит к образованию агрегатов в силу электростатического притяжения и дальнейшему выпадению их в осадок. ЗАДАНИЕ 1. Высаливание белков сульфатом аммония. В пробирку наливают 1 мл раствора белка, добавляют 1 мл насыщенного раствора сульфа- та аммония и слегка встряхивают смесь. Наблюдают ___________________________________________. Это осажденные глобулины. Содержимое пробирки фильтруют через сухой складчатый фильтр, затем добавляют в фильтрат, содержащий альбумины, избыток сухого сульфата аммония до пре- кращения его растворения. Наблюдают __________________________________________. ЗАДАНИЕ 2. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами. В 3 сухие пробирки наливают по 1 мл концентрированной азотной, серной и соляной кислот. Затем, наклонив каждую пробирку, приливают в нее из пипетки по 0,5 мл раствора белка так, чтобы он не смешивался с кислотой. В месте соприкосновения двух жидкостей появляется ___________________________________________________. При встряхивании осадок, выпавший при добавлении азотной кислоты, _______________________________, а осадки, выпавшие при действии соляной и серной кислот, ______________________________________. ЗАДАНИЕ 3. Осаждение белков солями тяжелых металлов. В две пробирки наливают по 1–2 мл раствора белка, прибавляют по каплям в первую пробирку 0,5%-й раствор ацетата свинца, во вторую — 5%-й раствор CuSO 4 . Наблюдают образо- вание _____________________ в обеих пробирках. При добавлении избытка солей осадки ________________________. ЗАДАНИЕ 4. Осаждение белков спиртом. В пробирку наливают 1 мл раствора белка и добавляют немного кристаллического хлори- да натрия. Приливают постепенно 2–3 мл этилового спирта. При этом наблюдают ________________________________________. Отчет: 1. Заполните таблицу: Таблица 1. Качественные реакции на белки Название реакции Окрашивание 2. Напишите уравнения реакций, являющихся качественными на белки: 3. Заполните таблицу: Таблица 2. Реакции осаждения белков Название реакции Эффект Химические связи и группы атомов, участвующие в реакции Контрольные вопросы: 1. На чем основаны методы качественного обнаружения белков? 2. Перечислите качественные реакции на белки. На чем они основаны? 3. Какие факторы обусловливают устойчивость белковых растворов? 4. Чем сопровождается введение в раствор солей? 5. На чем основано высаливание неорганическими солями? 6. Как соли тяжелых металлов влияют на белки? 7. Какие существуют структуры белка? 8. Что такое белковый домен? Для каких функций он нужен? 9. Как формируются и за счёт каких связей различные белковые структуры? 10. Какие аминокислоты вызывают изгиб полипептидной цепи? Сгруппируйте протеиноген- ные аминокислоты в соответствии с их структурной и функциональной классификацией. 11. За счёт каких типов межмолекулярных связей формируется пространственная структура белка? 12. Что такое фолдинг белка? Как он происходит? 13. Активность многих ферментов очень сильно зависит от температуры реакционной среды. Объясните, почему? 14. Почему опасны отравления солями тяжёлых металлов? |