лл. МУ занятие 1.1.1. Занятие 1 Введение. Клеточный уровень организации живых систем. Цитохимические методы исследования Введение
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Дисциплинарный модуль 1. Модульная единица 1.1. «Биология клетки» Занятие 1.1.1. Введение. Клеточный уровень организации живых систем. Цитохимические методы исследования 1.Введение Знакомство с кафедрой, МРС по дисциплине, с ТБ по работе в аудиториях и с электрическими приборами. Изучение клетки с помощью современных методов исследования (электронная микроскопии, авторадиография, цитоспектрофотометрия, рентгеноструктурный анализ и др.) позволило выяснить, что основные биопроцессы, проходящие в клетке, характеризуя такое сложное явление как жизнь, являются общими для всех живых организмов. Принципиальное морфологическое и функциональное единство всего многообразия растительных и животных клеток является свидетельством единства происхождения жизни на Земле (эволюционный принцип). 2.Актуальность темы занятия Заключается в том, что оптические приборы дают возможность исследовать и понимать многочисленные явления и процессы окружающего мира. Знание данной темы необходимо для формирования диалектико-материалистического мировоззрения у будущего врача. Знание основ морфологии функционирования клетки необходимо практическому врачу любой специальности. 3.Цель занятия: Ознакомиться с правилами выполнения практических работ и оформления их в рабочей тетради. Изучить устройство светового микроскопа и правила микроскопирования. Познакомиться с некоторыми основными цитохимическими реакциями. 4. План изучения темы: 4.1. Контроль исходного уровня подготовки обучающихся (тесты к занятию 1.1.1 в ЭОС) 4.2. Теоретический блок Вопросы самоподготовки 1. Чем представлена оптическая часть микроскопа? 2. Для чего предназначены макро- и микровинты? 3. Как подсчитывается увеличение микроскопа? 4. Немембранные способы компартментации 5. Классификация клеточных включений (трофические, пигментные, секреторные, экскреторные включения). 6. Значение клеточных включений в метаболизме клетки и организма. 7. Цитохимия и ее методы выявления различных органоидов клеточных включений. 4.3. Практическая работа обучающихся Ознакомление с правилами оформления лабораторных работ: Протокол практической работы в тетради должен содержать следующие элементы: тему работы, цель работы, номера и названия всех выполняемых работ, сквозная нумерация и подписи к рисункам, вывод. Правила оформления рисунков: Зарисовка объектов при их изучении является чрезвычайно важным моментом, фиксирующем внимание студента на различных деталях морфологии исследуемого материала. Именно поэтому при выполнении рисунка необходимо соблюдать определенные требования: Зарисовки делаются только с препарата простым карандашом/цветными карандашами, но не фломастерами. Изображение цвета на рисунке должно точно соответствовать цвету изучаемого объекта. 1. Рисунок не должен быть очень маленьким или слишком большим (примерно 1/4 или 1/5 от размера тетрадного листа). 2. Рисунки в практической работе должны быть пронумерованы (нумерация сквозная). Каждый рисунок должен быть подписан. Если на рисунке приводится изображение с микроскопа, то в подписях к рисунку должно быть указано при каком увеличении получено изображение. В подписях к рисункам, изображающим организмы различных видов, указывается систематическое положение этих организмов (тип, класс, отряд, семейство, род, вид) с использованием латинских и русских названий. 3. Рисунок необходимо снабдить обозначениями. Обозначения цифрами делаются ручкой. Расшифровка цифровых обозначений приводится справа от рисунка или сразу под рисунком. Работа № 1. Изучить устройство светового микроскопа. 1 – окуляр 2 – тубус 3 – тубусодержатель 4 – винт грубой наводки 5 – микрометрический винт 6 – подставка 7 – зеркало 8 – конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр 9 – предметный столик 10 – револьверное устройство 11 – объектив Рис. 1 Световой микроскоп монокулярный Рис. 2 Световой микроскоп бинокулярный Составные части микроскопа: 1 – окуляры; 2 – бинокулярная насадка; 3 – штатив; 4 – рукоятка грубой; настройки на резкость; 5 – рукоятка точной; настройки на резкость; 6 – рукоятки перемещения предметного столика вправо/влево (вперед/назад); 7 – коллектор; 8 – конденсор; 9 – предметный столик; 10 – объективы; 11 – револьверное устройство. Работа № 2. Правила работы со световыми оптическими приборами. 1) Микроскоп следует правой рукой брать за штатив, а левой – поддерживать основание. 2) Установите микроскоп. Тубусодержатель должен быть обращен к вам, а зеркало – напротив света. 3) Поставьте объектив малого увеличения в рабочее положение, если действие выполнено правильно, то вы услышите легкий щелчок. Запомните: изучение любого объекта начинается с малого увеличения. 4) Смотрите в окуляр и вращайте зеркало до тех пор, пока поле зрения не будет освещено ярко и равномерно 5) Опустите объектив малого увеличения (х8) над столиком на высоту примерно 0,5 см с помощью макрометрического винта (винт нужно вращать на себя). 6) Положите на предметный столик микропрепарат покровным стеклом вверх так, чтобы объект находился в центре отверстия предметного столика. 7) Смотрите на микроскоп сбоку и опускайте тубус с помощью винта на расстояние приблизительно 5 мм от объектива до препарата. 8) Смотрите в окуляр и медленно поднимайте тубус (вращайте винт на себя) до тех пор, пока не увидите четкого изображения объекта. 9) Перейдите к рассматриванию объекта при большом увеличении. Вращая револьвер, установите объектив большого увеличения (х20) над предметным столиком; дождитесь легкого щелчка; найдите фокус, вращая винтом. Запомните: большое увеличение позволяет видеть глубину объекта, поэтому резко видны то одни, то другие структуры. Фокусное расстояние при большом увеличении составляет приблизительно 1 мм. 10) По окончании работы с большим увеличением, установить малое увеличение, поднять объектив примерно на 1-2 см от предметного столика, снять с рабочего столика микропрепарат. Работа №3. Работа с постоянными препаратами. 1) Рассмотреть постоянный препарат «Клетки кожицы лука» с помощью микроскопа при ув. 7х8 и 7х20. Отработать навык перехода с микроскопии объекта при малом увеличении на микроскопию объекта при большом увеличении. Зарисовать, отметить все видимые элементы: ядро, клеточную стенку, цитоплазму. Рис. 1 Клетки кожицы лука Работа № 4. Выявление трофических включений в клетках 4.1. Выявление гликогена ШИК-реакцией. Рассмотреть на большом увеличении микроскопа микропрепараты «Включения гликогена в клетках печени аксолотля», окрашенные на гликоген Шик-реакцией, полученные из печени крыс. Зарисовать и указать, что гликоген окрашивается в темно-вишневый цвет реакцией с Шифф-йодной кислотой (смесь реактива Шиффа с йодной кислотой). ШИК-реакция и выявляется в виде гранул и глыбок (1), которые часто смещаются при фиксации ткани к одному из полюсов клетки. Рис. 2 Гликоген в клетках печени (ШИК-реакция) 4.2. Выявление липидов в клетках (окраска осмиевой кислотой). Изучить на большом увеличении микроскопа микропрепарат «Жировые включения в клетках печени», окрашенный на липиды осмиевой кислотой. Зарисовать несколько клеток, отметить ядро клетки (2) и нейтральные липиды, расположенные в цитоплазме клеток в виде мелких и крупных капель черного цвета (1). Рис. 3 Липиды в цитоплазме клеток (осмиевая кислота) 4.3. Выявление желточных трофических включений в клетках (окраска пикрофуксином). Рассмотреть микропрепарат «Желточные включения в бластомерах амфибий». Желточные включения (1) образуются в яйцеклетках постепенно, в процессе их развития при непосредственном участии сетчатого аппарата Гольджи и служат питательным материалом для развивающегося зародыша. Помимо желточных гранул, в цитоплазме бластомеров встречаются мелкие буровато- коричневые пигментные включения, которые представляют собой защитное приспособление от сильного воздействия световых лучей. Скопление белка, различимые в световом микроскопе, в норме встречаются только в яйцеклетках и клетках зародыша на ранних этапах эмбриогенеза. Рис. 4 Бластомеры амфибии Работа № 5. Выявление органоидов клетки 5.1. Выявление комплекса Гольджи (окраска осмиевой кислотой). Рассмотреть микропрепарат «Комплекс Гольджи в нейронах спинального ганглия кошки», в которых комплекс Гольджи имеет черную окраску (импрегнация солями серебра или осмиевой кислотой). Он располагается обычно около ядра или вокруг клеточного центра в виде черных извитых нитей и точек, однако его локализация может изменяться в связи с функциональной активностью клетки. Зарисовать одну клетку и отметить ядро клетки с ядрышком илокализацию комплекса Гольджи. Рис. 5 Комплекс Гольджи в цитоплазме клеток (осмиевая кислота) 5.2. Выявление митохондрий (окраска по Альтману). Рассмотреть под микроскопом микропрепараты «Хондриосомы в клетках канальцев почки», «Хондриосомы в эпителиальных клетках. Кишечник аскариды» и на большом увеличении найти митохондрии (окраска по Альтману). Они имеют вид красных гранул, палочек, колбочек. Зарисовать несколько клеток, отметить ядро клетки с ядрышком и митохондрии. Рис. 6 Митохондрии в цитоплазме эпителиальных клеток канальцев нефрона (окраска по Альтману) Работа № 6. Выявление пигментных включений. Рассмотрите микропрепарат «Меланоциты кожи хвоста головастика» на малом увеличении, затем на большом увеличении. В поле зрения видны пигментные клетки (меланоциты), характеризующиеся отростчатой формой и присутствием в цитоплазме гранул пигмента меланина, окрашенных в коричневый цвет. Зарисовать меланоцит, отметить ядро клетки и коричневые гранулы меланина Рис. 7 Меланин в пигментных клетках кожи Работа № 7. Выявление нуклеиновых кислот в клетках 7.1. Выявление ДНК в ядрах клетки по Фёльгену. Под иммерсионным увеличением микроскопа рассмотреть (демонстрация) микропрепараты клеток, окрашенные реактивом Шиффа, фуксин-сернистой кислотой по Фёльгену. Зарисовать одну клетку, отметить ДНК в ядре клеток окрашенное по Фёльгену в сиренево-фиолетовый цвет. Обратить внимание на глыбчато-нитчатую структуру хроматина в ядрах клеток. Рис. 8 ДНК в ядрах клеток (окраска по Фёльгену) 7.2. Выявление РНК по Браше. Рассмотреть при иммерсионном увеличении микроскопа (демонстрация) микропрепараты, окрашенные на РНК по Браше, полученные из печени крыс. Зарисовать одну клетку с реакцией на РНК. Указать, что РНК по Браше выявляется в виде гранул и глыбок в цитоплазме и окрашивается пиронином в малиново-красный цвет (1). Зарисовать окрашенное ядрышко (3). Одновременно метод Браше позволяет компонентам красителя – метиловым-зеленым окрашивать ДНК в зеленый цвет в ядре (2). Рис. 9 РНК в ядрышках и цитоплазме клеток (окраска по Браше) Работа № 8. Выявление секреторных включений 8.1 Рассмотреть микропрепарат «Секреторные гранулы в клетках Лейдига кожи аксолотля», окрашенный гематоксилинэозином. При малом увеличении надо найти край среза, образованный клетками, расположенными в несколько слоев, среди которых нетрудно заметить относительно крупные, овальной формы клетки, окрашенные в розово-красный цвет (рис. 10). При большом увеличении видно, что цитоплазма этих так называемых лейдиговских клеток заполнена белковыми гранулами, представляющими собой секреторные включения (рис.11). Круглое базальное ядро темно-синее ядрышко и такого же цвета глыбки хроматина. Зарисовать несколько клеток, отметить гранулы секреторных включений. Рис. 10 Клетки Лейдига с секреторными гранулами. 100 х Рис. 11 Клетки Лейдига с секреторными гранулами. 400 х 8.2 Рассмотреть микропрепарат «Гранулы зимогена в клетках поджелудочной железы крысы», окрашенный железным гематоксилином. На малом увеличении найдите концевые секреторные отделы железы округлой или овальной формы, образованные одним слоем железистых клеток. В клетках и в просвете этих образований видны окрашенные в черный цвет гранулы зимогена. При большом увеличении изучить конические железистые клетки, в апикальных отделах которых находятся гранулы зимогена. Экзокринные клетки поджелудочной железы. Цитоплазма клеток целиком заполнена шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Находящиеся на его мембранах рибосомы синтезируют полипептидные цепи зимогенов многих пищеварительных ферментов. Зимогены накапливаются в вакуолях, превращающихся в зрелые зимогенные гранулы. Рис. 12 Железистые клетки с гранулами зимогена 4.4.Итоговый контроль 4.4.1. Рассмотрите качественные реакции на различные компоненты клетки и заполните таблицу Выявляемые компоненты клетки Цитохимическая реакция Характер выявления ДНК в ядрах Фёльгена (реактив Шиффа – фуксин-сернистая кислота) РНК Браше (метиленовый зеленый – пиронин) Гликоген Шик-реакция (Шифф-йодной кислотой) Липиды Осмиевая кислота Комплекс Гольджи Осмиевая кислота Митохондрии По Альтману (гематоксилин и кислый фуксин) Пигментные включения Желточные включения Секреторные гранулы Гранулы зимогена 4.4.2. Ситуационные задания 1. На свободной поверхности клеток расположены структуры, в которых под электронным микроскопом видны 9 пар периферических и 2 пары центральных микротрубочек. Как называются эти структуры и какова их роль? 2. В цитоплазме клеток расположены структуры, в которых под электронным микроскопом видны 9 триплетов периферических в центральной части микротрубочки отсутствуют. Как называется этот органоид и какова его роль? 3. При исследовании различных клеток под электронным микроскопом было обнаружено, что одни клетки на поверхности имеют единичные микроворсинки, другие – щеточную каемку. Какое можно сделать заключение о функции этих клеток? 4. При усиленной физической нагрузке организма в его клетках уменьшается содержание трофических включений. С чем это связано? 5. При загаре в клетках кожи появляются гранулы пигмента. К каким структурным элементам клетки относятся эти гранулы? Сделайте вывод (вывод делается по выполненным целям практической работы) Ознакомился с правилами выполнения практических работ и……. Изучил устройство светового микроскопа и……. Познакомился…… 4.5. Домашнее задание 1.подготовить занятие 1.1.2, сделать тесты к занятию 1.1.2 в ЭОС 2. ознакомиться с темами самостоятельной работы в ЭОС в модуле №1, выбрать тему для выполнения 5. Список тем по УИРС, предлагаемый кафедрой Методы изучения клетки (самостоятельная работа) В настоящее время формирование оптического изображения является лишь первым шагом к анализу данных. Микроскоп выполняет эту функцию в сочетании с электронными детекторами, процессорами изображений и устройствами отображения. Компьютеризированное управление фокусом, сценическим положением, оптическими компонентами, ставнями, фильтрами и детекторами широко распространено и позволяет проводить экспериментальные манипуляции, которые невозможны для человека при использовании механических микроскопов. Возрастающее применение электрооптики в флуоресцентной микроскопии привело к созданию оптических пинцетов, способных манипулировать субклеточными структурами или частицами, изображениями отдельных молекул и широким спектром сложных спектроскопических приложений (Бородин, 2019). Выбрать одно из направлений и описать по плану, объем – 1-2 стр. А4, шрифт 12-14, Times New Roman, интервал однострочный). Одно направление могут брать не больше 2-х человек План характеристики цитологических методов исследования Название Цель Преимущества и недостатки 1. Метод прижизненного (витального) окрашивания 2. 2.Метод микроскопирования в темном поле (темнопольная микроскопия) 3.Светлопольная микроскопия 4.Флуоресцентная микроскопия 5.Фазово-контрастная микроскопия 6.Лазерная конфокальная микроскопия 7.Мультифотонная микроскопия 8.Методы просвечивающей электронной микроскопии. Метод реплик. Метод замораживания-скалывания. 9.Методы просвечивающей электронной микроскопии. Методы позитивного и негативного контрастирования. 10.Методы просвечивающей электронной микроскопии. Методы цитохимического мечения гликолипидов и гликопротеинов: использование лектинов 11.Электронно-микроскопическая авторадиография. Импульсный и импульснопоследовательный методы авторадиографии. 12.Гибридизация in situ в электронной микроскопии. Преэмбеддинг и постэмбеддинг. 13.Иммуноэлектронная микроскопия 14.Растровая (сканирующая) электронная микроскопия (РЭМ). 15.Атомно-силовая микроскопия. 6. Рекомендуемая литература Основная: 1.Биология: учебник: в 2-х т. т. 1/ ред. В.Н. Ярыгин. – Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2013. – С. 38-45, 97-111, 139-154 2.Биология [Электронный ресурс]: учебник: в 2-х т. т. 1 / ред. В. Н. Ярыгин. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 736 с. ил. - Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970426401.html 3. Ярыгин В.Н., Биология. Т. 1. / под ред. Ярыгина В.Н. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2020. - 728 с. - ISBN 978-5-9704-5307-0 - Текст: электронный // ЭБС "Консультант студента": [сайт]. - URL: https://www.studentlibrary.ru/book/ISBN9785970453070.html 4. Биология: учебник для студентов высших учебных заведений / Первый МГМУ имени И.М. Сеченова; под ред. Н. В. Чебышева. - Москва: Медицинское информационное агентство, 2016, 2005. - 640 с. 5. Слюсарев, А. А. Биология с общей генетикой: учебник для студентов медицинских институтов / А. А. Слюсарев. - М.: Альянс, 2011. С. 14-27. Рекомендуемая: 1. Биология: учебник: в 2-х кн. / ред. В.Н. Ярыгин. - 9-е изд., стереот. - М.: Высшая школа, 2008: Кн.1 - c.38-51. Биология: руководство к лабораторным занятиям: учебное пособие / ред. О. Б. Гигани. - Москва: ГЭОТАР- Медиа, 2016. - 272 с. 2.Биология: руководство к практическим занятиям [Электронный ресурс]: учебное пособие / ред. В. В. Маркина. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 448 с. ил. - Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970413074.html |